不同种类蔬菜SOD提取和活性比较花亦洁 2.docx

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不同种类蔬菜SOD提取和活性比较花亦洁2

生物化学实验（甲）自主实验（微型研究课题）设计与实践

不同种类蔬菜SOD提取和活性比较

花亦洁3080005006

一、实验背景和目的

　超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。

对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果从1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。

1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。

SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。

它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。

生物体在长期的生命活动中,总会由于环境因素或生理条件的变化而出现氧自由基增加，抗氧化能力下降的情况，并由此引发一些疾病，如脂质过氧化与膜疾病、肿瘤、衰老、心血管疾病、创伤、辐射损伤、高度中毒等有关。

SOD作为生物体内一种重要的抗氧化剂，起着非常重要的作用。

同时，SOD还可以作为一种添加剂，添加到化妆品和食品中，在预防和治疗由于自由基增多而引起的一系列疾病方面起到一定作用。

由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成，由此可见SOD的重要性。

本实验希望通过测定得到四种常见蔬菜中的SOD含量，从而可以对日常饮食做出一定指导。

同时希望通过此次自主实验，进一步熟悉生物化学实验的设计方法、学习SOD定量检测方法并提高自身实验操作能力。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（E1.15.1.1）（SuperoxideDismutase,SOD）是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的金属酶。

它催化超氧化物阴离子自由基（O2-）发生歧化反应，从而消除自由基：

M（n+1）+−SOD+O2−→Mn+−SOD+O2

Mn+−SOD+O2−+2H+→M（n+1）+−SOD+H2O2.

其中M=Cu（n=1）、Mn（n=2）、Fe（n=2）、Ni（n=2）.

SOD在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除的动态平衡中起着重要作用。

邻苯三酚自氧化：

经典的邻苯三酚自氧化法是Marklund等于1974年发表的一种通过比色测定SOD的简便方法。

邻苯三酚自氧化过程为链式反应，可产生O2-，生成有色的中间产物，吸光度随之增加，可用分光光度计检测。

在pH<9.0时，邻苯三酚自氧化速率与生成的O2-的浓度呈正相关。

SOD加入后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光度下降，邻苯三酚自氧化速率降低。

故可通过紫外可见光分光光度仪来定量测定SOD在体系中对O2-的清除作用，间接评价其抗氧化能力。

主要反应如下：

本实验中用逐差法计算邻苯三酚平均自氧化速率：

酶活性单位采用抑制邻苯三酚光化还原50%为一个酶活性单位表示：

三、实验器材与仪器

试管15cm;

精确pH试纸;

研钵;

纱布;

漏斗;

玻棒;

量筒；

容量瓶；

移液管（5ml）；

移液枪（1000μl）

BeckmanCoulter的Avanti™CentrifugeJ-25;50mL离心管

北京普新通用仪器有限责任公司产的TU-1800紫外可见光光度计

60℃、25℃水浴锅

四、实验材料与试剂

实验材料：

新鲜莴苣、红果番茄、芹菜、韭黄

实验试剂：

1、0.05mol/LpH7.8

2、0.1mol/LTris-HCl（pH8.2内含2mmol/LEDTA）

3、60mmol/L邻苯三酚

4、石英砂

5、氯仿

6、乙醇

7、二次蒸馏水

五、实验操作方法和步骤

试剂的配制：

1、0.05mol/LpH7.8磷酸缓冲液

（1）0.2mol/L的Na2HPO4；称取NaH2PO4.2H2O固体0.78g用重蒸水定容至25ml。

（2）0.2mol/L的Na2HPO4：

称取Na2HPO4.12H2O固体1.7908g用重蒸水定容至25ml。

（3）0.2mol/LpH7.4的PB的配制：

取5.9ml0.2mol/L的NaH2PO4溶液和25ml0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。

（理论比为19：

81）。

取2.5ml上述溶液于100ml容量瓶定容得0.05mol/L磷酸缓冲液用一定浓度NaOH溶液调节pH至7.8即得。

2、0.1mol/LTris-HCl（pH8.2内含2mmol/LEDTA）

Tris（分子式:

NH2C（CH2OH）3、分子量:

121.14）EDTA（分子量：

292.248、分子式：

C10H16N2O8）

称取0.303gTris，25ml容量瓶定容，称取0.015g的EDTA溶于上述溶液，用约4mol/L的HCl调PH即可。

3、60mmol/L邻苯三酚（分子式C6H6O3、分子量126.11）：

称取0.189165g邻苯三酚，25ml容量瓶定容即可。

4.氯仿-乙醇混合液：

将氯仿和无水乙醇以3：

5体积比混合。

验操作步骤

1、SOD的提取

取3g新鲜蔬菜食用部分，1：

5（W/V）加入0.05mol/LpH7.8磷酸缓冲液，加石英砂少许，冰浴中研磨成匀浆，二层纱布过滤液，于4℃，1300r/min离心20min，上清液为SOD粗提取液。

2、SOD的纯化

（1）热处理：

SOD粗提取液于60℃热处理20min，8500r／min离心10min，弃沉淀。

（2）氯仿-乙醇沉淀：

按酶液体积的1/4加入氯仿-乙醇混合液，搅拌15min，4500r／min离心15min，弃去沉淀，将上清液静置10min，分层，取上层液体。

3、SOD的活性检测（邻苯三酚自氧化法）：

试剂

1

2

3

4

5

0.1mol/LTris-HCl

（pH8.2内含2mmol/LEDTA）/mL

4.15

4.15

4.15

4.15

4.15

二次蒸馏水/ml

0.2

0.1

0.1

0.1

0.1

60mmol/L邻苯三酚/ml

0.15

0.15

0.15

0.15

0.15

25℃恒温20min，SOD预热

SOD酶液/ml

（韭黄、芹菜、莴苣、番茄）

-

0.1

0.1

0.1

0.1

总体积/ml

4.5

4.5

4.5

4.5

4.5

4、吸光度测定

在试管按上表加入缓冲液、二次蒸馏水与邻苯三酚溶液，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的SOD酶液后，迅速摇匀，立即倾入比色皿中，每隔30s测一次A值，测3min。

六、数据记录及处理

验原始数据:

时间

项目

30“

1’00”

1’30”

2’00”

2’30”

3’00”

韭黄

A空白

1.322

1.397

1.462

1.579

1.518

1.579

A样品

0.110

0.119

0.125

0.128

0.128

0.130

芹菜

A空白

1.732

1.711

1.643

1.759

1.761

1.772

A样品

0.070

0.069

0.069

0.070

0.072

0.075

莴苣

A空白

1.785

1.816

1.728

1.820

1.851

1.889

A样品

0.075

0.044

0.062

0.077

0.029

0.069

番茄

A空白

1.919

1.941

1.958

2.018

2.083

2.052

A样品

0.035

0.050

0.027

0.030

0.049

0.050

不同种类蔬菜SOD活性对比：

项目

蔬菜

种类

样品△A325

空白△A325

SOD活性（U/g）

参考值*（U/g）

韭黄

0.330

0.021

405.32

486.21

芹菜

0.137

0.006

398.46

454.08

莴苣

0.178

-0.004

443.00

465.86

番茄

0.193

0.011

439.31

523.69

*参考值来自任吉君，王燕.不同种类蔬菜SOD活性的研究[J].北方园艺2008（6）.

七、结果分析与讨论

根据所测数据，莴苣和番茄SOD含量较高，更有利于健康；芹菜SOD含量最少；

所测结果与参考值比较，莴苣SOD含量与参考值最为接近，韭黄和番茄的测量值误差较大；

误差分析：

1、D活性小于参考值：

研磨不充分导致SOD未完全释放；

实验时间持续较长，可能导致SOD变性；

试剂配制不够准确；

实验时因时间有限，将搅拌15分钟改为了涡旋振荡10分钟，可能时间过长导致部分SOD被破坏。

色素未除尽。

2、吸光度数据波动较大：

测吸光度时存在计时误差；

含具有氧化性的杂质；

仪器误差。

八、讨论、心得

1、关于超氧化物岐化酶的相关信息

SOD按其结合的金属离子可分为：

Fe-SOD、Mn-SOD和Cu、Zn-SOD三种。

这三种酶活性部位的金属离子与酶蛋白都在催化反应中起到关键作用，但酶的性质与分子结构有所不同。

前两种性质很相似，但他们在蛋白质一级结构、空间结构、相对分子质量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感性等方面与后者别较大。

Fe-SOD和Mn-SOD的一级结构和空间结构很相似，但均不同于Cu、Zn-SOD的结构。

Cu、Zn-SOD一般是由两个相同的亚基组成二聚体，每个亚基的相对分子质量约有16000，含有一个铜原子和一个锌原子。

Cu、Zn-SOD一般没有或含有少量的络氨酸和丝氨酸。

它们的紫外吸收光谱在250~270nm有不同程度的吸收，而在280nm的吸收峰不存在或者不明显。

Cu、Zn-SOD的可见光吸收谱反映了二价铜离子的光学性质，不同来源的SOD都在680nm附近有最大吸收。

Cu、Zn-SOD最适pH较宽，在pH5.2~9.5之间。

Cu、Zn-SOD对氰化物、

比较敏感，但在热、蛋白水解酶作用下相对比较稳定。

不同来源的Cu、Zn-SOD的氨基酸序列，无论是来自细菌、真菌、高等植物细胞浆或叶绿体，还是来自高等动物和人的细胞浆，它们的同源性都很高。

有些氨基酸很保守，在所有序列中都保持不变，这说明这些氨基酸与活性中心有关。

牛红细胞Cu、Zn-SOD的X衍射电子密度图显示其结构核心是一个由反向八股反平行的β折叠围成的桶状结构（β-barrel）。

整个结构中的α螺旋较少，Cu与44、46、61、118位的组氨酸相连，Zn与61、69、78位组氨酸组氨酸和81位天冬氨酸相连，Cu、Zn之间通过组氨酸形成咪唑桥结构。

此外，天冬氨酸122与组氨酸69和组氨酸44之间形成氢键，由此构成了Cu、Zn之间的第二座间接的桥，这两座桥在酶的催化反应中对酶结构的稳定起着重要的作用。

半胱氨酸55和144形成的二硫键是Cu、Zn、SOD中唯一一对二硫键，它对维持Cu、Zn、SOD的稳定结构也起着重要作用。

Mn-SOD在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体，大多数Fe-SOD为二聚体，这两种SOD的许多性质都很相似，每个亚基的相对分子质量一般为23000，每个亚基含有0.5-1.0个Mn或Fe原子。

它们的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，在280nm附近有最大吸收峰。

Mn-SOD的可见吸收光谱在475nm附近有最大吸收，反映了所含金属离子的光学性质。

任何生物来源的Fe-SOD和Mn-SOD的一级结构的同源性都很高。

SOD作为一种重要的抗氧化剂，它对于维持生物体内自由基的产生和清楚之间的平衡起着重要作用。

在某些病理情况下，自由基产生和清除功能失去了平衡，不论其原因是自由基产生过量，还是不足，或者是机体清除自由基的能力减弱，都会导致疾病的发生或衰老。

尽管Fe-SOD和Mn-SOD的金属离子与蛋白质构造均与Cu、Zn-SOD不同，但这三类酶的共同特点都是涉及活性部位内金属离子的交替还原或再氧化。

2、不同超氧化物歧化酶的分离提纯方法的比较选取

超氧化物歧化酶有多种提纯方法，其中包括热变性法、磷酸缓冲液提取法、氯仿—乙醇沉淀法、丙酮沉淀法、硫酸盐分级沉淀法等。

为了能够使SOD的提取量和纯化度均较高，经过资料查阅，并对比了各种超氧化物歧化酶的分离提纯方法。

粗提取方法：

（1）磷酸缓冲液法：

将材料于搅拌机中搅拌10min后移至研钵中研磨，于磷酸缓冲液中浸泡30-45min后用6层纱布抽滤。

将滤渣再用2倍磷酸缓6层纱布抽滤。

如此反复共3次，收集3次抽滤所得滤液，测酶活力。

（2）热变性法：

将材料SOD酶液于60℃热处理20min，8500r／min离心10min，弃沉淀，测定上清液酶活力。

纯化方法：

（1）氯仿一乙醇沉淀法：

将氯仿和乙醇以3：

5体积比混合后，按酶液体积1／4将其加人酶液中，搅拌15min，4500r／min离心15min，弃去沉淀，将上清液置于分液漏斗中静10min后检测其SO酶活力。

（2）丙酮沉淀法：

将酶液置于冰浴中，加入18％预冷的丙酮，搅拌10min于4500r／min离心15min，弃上清液，用50mmol／L磷酸缓冲液溶解其沉淀后，透析磷酸缓冲液，4℃过夜，4500r／min离心10min，测定上清液SOD酶活力。

（3）硫酸铵分级盐析法：

将硫酸铵研磨后加入SOD粗提液中，使之达到50％饱和度，放置于4℃冰箱内30min，10000r／min冷冻离心20min，除去杂蛋白，在上清液中再加人硫酸铵至90％饱和度，放置于4℃冰箱内2h，于10000r／min冷冻离心20min，收集沉淀，溶于最小量的50mmol／L，pH7．8磷酸缓冲液，透析，测其SOD酶活力。

根据所查资[7]热变性法单位体积SOD酶活力为2905．43U/ml；磷酸缓冲液提取法所得酶活为2377．17U/ml．由此可见，在进行粗提的方法选择上，应选择热变性法，而且热变性法也是最经济实惠的一种方法．

通过氯仿一乙醇沉淀法提纯SOD粗酶液酶活力为3873．91U/ml．通过丙酮沉淀法提纯SOD粗酶液酶活力为3900．33U/ml；通过硫酸铵分级沉淀法提纯SOD粗酶液，50％饱和度时酶活力为3081．57U/ml，而二级沉淀的酶活力为2993．48U/ml．由此可见，丙酮沉淀法是纯化结果较好的一种方法；硫酸铵分级沉淀法盐析需要消耗大量的盐，不能回收利用，盐析后的蛋白质需要透析除盐，否则会影响分离纯化；氯仿有较大的毒性，要在通风口处操作，并要戴手套和口罩，不利操作。

根据以上资料，我们设计用磷酸缓冲液法和热变性法进行SOD的粗提取。

磷酸缓冲液用于溶解破碎细胞后得到的SOD，热变性法可以去除部分杂蛋白。

粗提物的纯化方法采用氯仿一乙醇沉淀法，虽然根据资料，该方法效果略差于丙酮沉淀法，但由于实验时间有限，介于丙酮法需要过夜处理，故选用氯仿-乙醇沉淀法。

3、可行的拓展性实验

提取出不同蔬菜的SOD之后，还可以进行SOD同工酶的分离与活性染色。

由于在高等生物的组织和器官中普遍存在着SOD同工酶，因此利用活性染色可大致确定在某种生物的组织和器官中存在几种SOD同工酶，这是因为通过聚丙烯稀酰胺凝胶电泳可将不同相对分子质量大小及电荷多少的SOD同工酶进行分离，而黄色的NBT溶液加入凝胶中后，在SOD同工酶普带附近，由于SOD同工酶的存在，抑制蓝色的甲生成，因而在蓝色背景下SOD同工酶谱呈现透明状，从而可以观察到不同来源SOD同工酶之间以及同一来源不同发育阶段之间SOD同工酶的差异。

4、SOD活性的测定方法

㈠SOD的直接分析法

由于O2-极不稳定，要测定其浓度变化是相当困难的。

单如将观察时间大大缩短，或采用提高pH的方法也可以直接测定SOD活性。

Marklund使用KO2作为O2-的来源，采用高pH缓慢自氧化，此法可检测10-19mol/L的SOD。

电子顺磁共振EPR也已成功地用于SOD的直接分析，这种方法采用快速冷冻技术使反应物混合物冷冻，测出未配对电子量，故可直接测定O2-的量。

核磁共振（NMR）也可用于SOD活性分析。

SOD能增加18F的纵向弛豫率，但这种方法与其他分析方法不同，它反映的不是SOD活性，而是反映活性部位金属离子配位区域的性质。

此外还有节流光谱法雨极谱法等。

㈡SOD的间接侧活法

用间接法测SOD活性通常要借助于两种物质，一种可产生O2-，称超氧自由基产生剂，另一种可与O2-作用，称为超氧自由基指示清除剂。

一旦加入SOD，SOD即与指示清除剂竞争O2-，从而抑制清除剂与O2-的结合，这样就可根据指示剂与O2-反应的速度变化间接测定酶活性。

根据这种原理建立的测活方法最多，应用也最广泛。

①黄嘌呤氧化酶法

在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶（XOD）能催化黄嘌呤或次黄嘌呤生成尿酸，与此同时产生超氧自由基，将氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C。

后者在550nm有最大光吸收，因此测定氧化型细胞色素C在加入SOD前后的光吸收变化可间接计算酶活性。

②NBT法

除细胞色素C外，氮蓝四唑（NBT）也可作为O2-指示清除剂。

O2-可使NBT还原为甲臜。

③LDH-NADH法

乳酸在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下，作为超氧自由基清除剂，可与XOD配合以间接推算SOD的活性。

④邻苯三酚自氧化法

见前实验原理部分。

除邻苯三酚外，肾上腺素、6-羟基多巴胺、羟胺的自氧化亦可用来检测SOD活性。

⑤化学发光法

黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤或次黄嘌呤生成尿酸同时产生超氧自由基。

在碱性条件下，O2-与鲁米诺（luminol）反应，产生激发态产物，当其迅速返回基态时，即发出光。

若有SOD存在，则由于O2-被消除而使发光强度降低，故可利用SOD浓度与其抑制发光百分率的关系来计算酶活性。

⑥极谱氧电极法

本法的原理是利用邻苯三酚自氧化过程产生氧气，当反应体系中加入一定量的SOD后即有氧气放出，氧量变化可通过氧电极检测。

⑦核黄素光氧化法

㈢放射免疫法

测定SOD活性的一般化学法，其特异性和灵敏度都不如放射免疫法。

但本法分析的是SOD的量，而不是酶活性。

㈣实验方法选择

黄嘌呤氧化酶法：

金属离子易使XOD失活，因此在反应体系中必须添加EDTA或其他金属络合剂。

反应体系中如果含过氧化氢酶，可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用而干扰检测过程，不纯的SOD粗体液中含有过氧化氢酶，不适合用本法。

NBT法：

以NBT作O2-指示清除剂的缺点是：

它可被XOD直接还原，在氧饱和体系中，仅80%的还原受O2-调节，可被SOD抑制。

而XOD对NBT的直接还原却不受SOD抑制，这将影响测试结果的准确性。

化学发光法：

专一性较强，受其他干扰因素少，因而用作粗提液中SOD活性的检测尤为合适。

此外，该法灵敏度很高，可检测10-10~10-11mol/L的SOD溶液。

但是所需试剂luminol（3-氨基苯二甲酰肼）价格较贵：

46.50USD/10g（Biosynth）。

根据以上分析，以及可以找的的参考文献数量，最终选择邻苯三酚自氧化法进行SOD的酶活力测定。

实验心得

根据本次实验，可以改进的地方有：

（1）增加研磨时间，以保证细胞充分破碎；

（2）将搅拌步骤改为涡旋振荡可以提高实验效率，但是最佳振荡时间需经过进一步实验加以确定；

（3）在测试吸光度前要检查样液中的色素是否除尽。

参考文献

[1]BarondeauDP,KassmannCJ,BrunsCK,TainerJA,GetzoffED（2004）."Nickelsuperoxidedismutasestructureandmechanism".Biochemistry（25）

[2]McCordJM,FridovichI（1988）."Superoxidedismutase:

thefirsttwentyyears（1968-1988）".FreeRadic.Biol.Med.5（5-6）:

363–9.

[3]TainerJA,GetzoffED,RichardsonJS,RichardsonDC（1983）."Structureandmechanismofcopper,zincsuperoxidedismutase.".Nature

[4]韩少华，朱靖博，王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究.[J].中国酿造2009（6）.

[5]任吉君，王燕.不同种类蔬菜SOD活性的研究.[J].北方园艺2008（6）.

[6]许雅娟，赵艳景，胡虹.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究.[J].西南名族大学学报自然科学版.2006（6）.

[7]原龙，王新，杨平.大蒜中超氧化物岐化酶提取工艺的研究.[J].西安工程大学学报2009

（2）.