第21章 常用分子生物学技术的原理及其应用.docx

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第21章常用分子生物学技术的原理及其应用

第21章常用分子生物学技术的原理及其应用

学习要求

1．掌握分子杂交、印迹技术、PCR技术、核酸序列分析技术、基因文库构建的基本原理及应用；基因诊断、基因治疗的基本概念。

2．熟悉生物大分子相互作用的研究技术；基因诊断的方法；基因治疗的策略和程序。

3．了解生物芯片技术、遗传修饰动物模型的建立及应用、疾病相关基因的克隆与鉴定。

基本知识点

本章简要介绍了目前医学分子生物学中的部分常用技术。

主要内容包括：

分子杂交技术、印迹技术、PCR技术、核酸序列分析技术、基因文库构建的基本原理及应用、生物芯片技术、生物大分子相互作用研究技术、遗传修饰动物模型的建立及应用、疾病相关基因的克隆与鉴定以及基因诊断和基因治疗技术。

印迹技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。

它主要包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术。

DNA印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析。

RNA印迹技术主要用于检测某一组织中或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可比较基因的表达情况。

蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性的蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

其它方法还有斑点印迹、原位杂交、DNA芯片技术等。

PCR技术以拟扩增的DNA分子为模板，以一对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，依半保留复制机制沿模板链延伸直至完成两条新链的合成。

重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

PCR反应体系的基本成分包括：

①模板；②DNA；③特异引物；④耐热DNA聚合酶；⑤dNTP；⑥含Mg2+的缓冲液。

PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。

该技术具有高敏感、高特异、可重复以及快速简便等优点。

PCR技术主要用于：

①目的基因的克隆；②基因的体外突变；③DNA和RNA的微量分析；④DNA序列测定；⑤基因突变分析等。

核酸序列分析技术有手工测序和自动测序，其原理主要建立在化学裂解法或DNA链末端合成终止法的基础上。

目前广泛应用的是DNA自动测序。

基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。

其可分为基因组DNA文库和cDNA文库。

生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片。

生物芯片技术是一项新的规模化生物信息分析技术。

该技术主要应用包括基因表达检测、基因突变检测、基因诊断、功能基因组研究、基因组作图和新基因发现等多个方面。

生物大分子之间形成的各种复合物，在生命活动中起着重要作用。

研究各种生物大分子相互作用方式的相关技术，也变得日益重要。

酵母双杂交和标签蛋白沉淀是目前分析蛋白质相互作用的主要手段。

电泳迁移率变动测定和染色质免疫沉淀法是研究DNA-蛋白质相互作用的重要分析技术。

转基因动物、动物整体克隆技术、基因剔除技术在建立疾病的动物模型、探讨疾病的发生机制方面具有重要价值。

从基因水平研究疾病的发病机制，采取针对性措施治疗患者，是医学日后发展方向。

基因诊断和基因治疗已成为现代医学的重要内容。

一、选择题

（一）A型题

1．分子杂交实验不能用于

A．单链DNA与RNA分子之间的杂交B．双链DNA与RNA分子之间的杂交

C．单链RNA分子之间的杂交D．单链DNA分子之间的杂交

E．抗原与抗体分子之间的杂交

2．关于探针叙述错误的是

A．带有特殊标记B．具有特定序列C．必须是双链的核酸片段

D．可以是基因组DNA片段E．可以是抗体

3．下列哪种物质不能用作探针

A．DNA片段B．cDNAC．蛋白质D．氨基酸E．RNA片段

4．印迹技术可以分为

A．DNA印迹B．RNA印迹C．蛋白质印迹D．斑点印迹E．以上都对

5．PCR实验延伸温度一般是

A．90℃B．72℃C．80℃D．95℃E．60℃

6．Westernblot中的探针是

A．RNAB．单链DNAC．cDNAD．抗体E．双链DNA

7．Northernblotting与Southernblotting不同的是

A．基本原理不同B．无需进行限制性内切酶消化C．探针必须是RNA

D．探针必须是DNAE．靠毛细作用进行转移

8．可以不经电泳分离而直接点样在NC膜上进行杂交分析的是

A．斑点印迹B．原位杂交C．RNA印迹D．DNA芯片技术

E．DNA印迹

9．下列哪种物质在PCR反应中不能作为模板

A．RNAB．单链DNAC．cDNAD．蛋白质E．双链DNA

10．RT-PCR中不涉及的是

A．探针B．cDNAC．逆转录酶D．RNAE．dNTP

11．关于PCR的基本成分叙述错误的是

A．特异性引物B．耐热性DNA聚合酶C．dNTP

D．含有Zn2+的缓冲液E．模板

12．DNA链末端合成终止法不需要

A．ddNTPB．dNTPC．引物标记D．DNA聚合酶E．模板

13．cDNA文库构建不需要

A．提取mRNAB．限制性内切酶裂解mRNAC．逆转录合成cDNA

D．将cDNA克隆入质粒或噬菌体E．重组载体转化宿主细胞

14．标签蛋白沉淀是

A．研究蛋白质相互作用的技术B．基于亲和色谱原理

C．常用标签是GSTD．也可以是6组氨酸标签E．以上都对

15．研究蛋白质与DNA在染色质环境下相互作用的技术是

A．标签蛋白沉淀B．酵母双杂交C．凝胶迁移变动实验D．染色质免疫沉淀法E．噬菌体显示筛选系统

16．动物整体克隆技术又称为

A．转基因技术B．基因灭活技术C．核转移技术D．基因剔除技术

E．基因转移技术

17．目前主要克隆的致病基因是

A．糖尿病致病基因B．恶性肿瘤致病基因C．单基因致病基因

D．多基因致病基因E．高血压致病基因

18．基因疫苗主要是指

A．DNA疫苗B．RNA疫苗C．反义核酸D．核酶E．小干扰RNA

19．目前基因治疗中选用最多的基因载体是

A．非病毒载体B．脂质体C．病毒载体D．噬菌体E．质粒

20．目前基因治疗多采用的方法是

A．基因增补B．基因置换C．基因矫正D．基因灭活E．基因疫苗

（二）B型题

A．Southernblotting

B．Northernblotting

C．Westernblotting

D．dotblotting

E．insituhybridization

1．不需要电泳、转膜等程序，直接将样品点在NC膜上用于杂交分析。

2．电泳前不需进行限制性内切酶消化，可以用于检测细胞中已知的特异mRNA水平。

3．靠电转移完成生物大分子的转移

4．直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交

A．逆转录PCR

B．原位PCR

C．实时PCR

D．多重PCR

E．RFLP

5．将目的基因扩增与定位相结合

6．能动态检测反应过程中的产物量

7．将RNA的逆转录和PCR反应联合应用的一项技术

8．在同一反应中采取多对引物

A．功能克隆

B．定位克隆

C．转基因技术

D．核转移技术

E．基因剔除

9．也叫基因靶向灭活

10．该技术中，被导入的目的基因称为转基因

11．从对基因编码产物的功能的了解出发克隆致病基因

A．基因疫苗

B．基因矫正

C．基因置换

D．基因增补

E．基因失活

12．目前基因治疗采用最多的方法是

13．将致病基因的异常碱基进行修正的基因治疗方法是

14．将正常基因经体内基因同源重组原位替换致病基因的基因治疗方法是

15．利用特定的反义核酸阻断变异基因异常表达的基因治疗方法是

A．酵母双杂交技术

B．标签蛋白沉淀

C．电泳迁移率变动测定

D．染色质免疫沉淀

E．荧光共振能量转换效应分析

16．凝胶阻滞实验

17．需要设计诱饵基因

18．近年该技术与芯片技术结合在一起，成为一项鉴定特定核蛋白的DNA结合靶点的新技术

（三）X型题

1．核酸探针可以是

A．人工合成寡核苷酸片段B．基因组DNA片段C．RNA片段

D．cDNA全长或部分片段E．核苷酸

2．核酸分子杂交可以形成的杂化双链有

A．DNA/DNAB．RNA/RNAC．DNA/RNAD．寡核苷酸/RNA

E．寡核苷酸/DNA

3．PCR技术主要用于

A．目的基因的克隆B．基因的体外突变C．DNA和RNA的微量分析

D．DNA序列测定E．基因突变分析

4．分子杂交技术的原理涉及

A．分子杂交特性B．基因文库C．印迹技术D．生物芯片E．探针技术

5．关于DNA链末端合成终止法正确的是

A．需加入的链终止剂ddNTPB．dNTP需要标记C．引物也需要标记

D．又称Sanger法E．ddNTP缺乏5'-OH

6．基因组DNA文库建立需要

A．基因组进行限制性内切酶消化B．DNA片段克隆到相应载体中

C．重组体感染宿主菌D．筛选目的基因可以通过核酸分子杂交的方法进行

E．以λ噬菌体为载体的人基因组DNA文库的克隆数目至少应在106以上

7．用于构建基因组DNA文库的载体有

A．酵母人工染色体B．粘粒C．λ噬菌体D．腺病毒E．脂质体

8．基因诊断较常规诊断其特点有

A．属于病因诊断B．特异性强C．适用范围窄D．灵敏度高E．有放大效应

9．基因失活的常用技术包括

A．基因疫苗B．核酶C．小干扰RNAD．反义核酸E．基因置换

10．克隆羊多莉的产生属于

A．同种异体细胞转移技术B．同种异体细胞核转移技术C．试管内受精

D．无性繁殖E．同种异体细胞转基因技术

11．疾病动物模型可用于

A．探讨疾病的发生机制B．克隆致病基因C．新治疗方法的筛选系统

D．新药物的筛选系统E．新疾病模型的筛选系统

12．蛋白质芯片主要应用于

A．蛋白质结构的研究B．蛋白质表达谱的研究C．蛋白质功能的研究

D．蛋白质之间的相互作用研究E．疾病的诊断和新药的筛选

13．研究蛋白质相互作用的技术包括

A．标签蛋白沉淀B．酵母双杂交C．凝胶阻滞实验

D．噬菌体显示筛选系统E．DNA印迹

14．基因治疗的基本程序包括

A．治疗性基因的选择B．基因载体的选择C．靶细胞的选择

D．基因转移E．回输体内

15．目前可用作基因治疗的基因载体包括

A．腺病毒相关病毒B．噬菌体C．腺病毒D．逆转录病毒E．粘粒

二、是非题

1．Southernblot主要用于RNA的定性和定量分析。

2．蛋白质印迹分析技术中蛋白质的转移，可以用电转移，也可以靠毛细作用转移。

3．实时PCR技术与普通PCR技术相比，它可以动态监测反应过程中产物的量。

4．Sanger法在测定核酸序列时，反应管中加入的dNTP仅标记一种即可。

5．生物芯片可以是DNA芯片、cDNA芯片或蛋白质芯片。

6．酵母双杂交技术是分析DNA-蛋白质相互作用的一项重要技术。

7．核转移技术，是指将动物体细胞核全部导入另一个体去除了胞核的卵细胞内，使之发育成个体。

8．基因矫正是用正常的基因通过体内基因同源重组，替换致病基因来达到治疗目的。

9．目前基因治疗多采用基因增补的方式。

10．RNA印迹技术中，RNA分子在转移前需进行限制性内切酶切割。

11．PCR反应中变性主要是使模板DNA完全变性为单链。

12．实时PCR技术中，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到荧光探针，可发挥3'→5'核酸外切酶活性。

13．酵母双杂交系统可用于证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。

14．转基因技术即动物克隆技术，是无性繁殖。

15．内源基因结构突变发生在生殖细胞可引起恶性肿瘤。

16．基因转移和基因剔除技术在医学中最重要的用途是建立疾病动物模型。

17．定位克隆是指从对基因编码产物的功能的了解出发来克隆致病基因。

18．目前DNA序列分析是找出患者有关基因变异所在的最为直接和确切的基因诊断法。

三、填空题

1．分子杂交是利用DNA和这一基本性质来进行DNA或RNA定性、定量分析的。

2．在印迹技术中，将DNA片段在琼脂糖凝胶中使其成为，利用使胶中的生物大分子转移到膜上，使之成为固相化分子。

3．印迹技术的基本流程依次为、、和。

4．Southernblotting主要用于定性和定量分析，亦可用于和的分析。

5．Northernblotting主要用于检测的表达水平，敏感性较PCR，但其具有和的优点。

6．Westernblotting主要用于检测样品中的存在、细胞中以及的相互作用研究等。

7．PCR的基本反应步骤包括、、。

8．基因芯片适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的，其原理是基于。

9．在转基因技术中，被导入的目的基因称为，目的基因的受体动物称为。

10．标签融合蛋白结合实验主要用于证明是否存在直接的物理结合，分析结合的及筛选细胞内与融合蛋白相结合的。

11．染色质免疫沉淀法是目前可以研究与相互作用的主要方法。

12．目前克隆致病相关基因主要有和两大策略。

13．根据受体细胞的类型不同，基因治疗分为的基因治疗和的基因治疗两大类。

14．目前基因治疗使用的基因载体有和两大类。

15．在人类基因治疗实施中，导入基因的方式有和两大类。

四、名词解释

1．probe

2．blottingtechnologe

3．genelibary

4．核转移技术

5．genechip

6．genetherapy

7．genediagnosis

8．基因疫苗

9．geneinactivation

10．genereplacement

11．geneaugmentation

12．PCR

13．exvivo

五、问答题

1．简述印迹技术的分类及应用。

2．简述PCR反应体系的基本成分、PCR的基本反应步骤和主要用途。

3．简述PCR技术的基本原理。

4．简述逆转录PCR、原位PCR和实时PCR技术的基本原理和主要区别。

5．简述DNA链末端合成终止法（Sanger法）测序的基本原理。

6．简述基因转移和基因剔除技术在医学发展中的作用。

7．简述酵母双杂交技术的基本原理及应用。

8．试述染色质免疫沉淀法基本原理及用途。

9．简述基因诊断的概念及特点。

10．何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？

11．试述基因治疗的基本程序。

12．欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。

请你设计一个实验，利用PCR方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。

13．请设计一个实验，利用酵母双杂交系统检测从某一癌组织中提取、纯化的一种未知蛋白质X与两种已知蛋白质a、b三者之间是否有相互作用，并给出可能的相互作用形式。

14．请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。

参考答案

一、选择题

（一）A型题

1．B2．C3．D4．E5．B6．D7．B8．A9．D10．A11．D12．C13．B14．E15．D16．C17．C18．A19．C20．A

（二）B型题

1．D2．B3．C4．E5．B6．C7．A8．D9．E10．C11．A12．D13．B14．C15．E16．C17．A18．D

（三）X型题

1．ABCD2．ABCDE3．ABCDE4．ACDE5．ABD6．ABCDE7．ABC8．ABDE9．BCD10．BD11．ACD12．BCDE13．ABD14．ABCD15．ACD

二、是非题

1．B2．B3．A4．A5．A6．B7．B8．B9．A10．B11．A12．B

13．A14．B15．A16．A17．B18．A

三、填空题

1．变性复性

2．变性单链毛细作用NC

3．电泳转移杂交放射自显影或化学显色

4．DNA重组质粒噬菌体

5．mRNA差特异性强假阳性率低

6．特异性蛋白质的存在特异性蛋白质的半定量分析蛋白质分子

7．变性退火延伸

8．基因差异表达情况双色荧光探针杂交

9．转基因转基因动物

10．两种蛋白质分子具体结构部位未知分子

11．体内DNA蛋白质

12．功能克隆定位克隆

13．体细胞生殖细胞

14．病毒载体非病毒载体

15．直接体内疗法间接体内疗法

四、名词解释

1．probe—探针，是指带有特殊可检测标记（放射性核素或其它化合物标记）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片断互补结合，因此可用于检测核酸样品中特定的基因。

2．blottingtechnolog—印迹技术，是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。

它包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术等。

3．genelibrary—基因文库，是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。

基因文库可以分为基因组DNA文库和cDNA文库。

4．核转移技术—即所谓动物整体克隆技术，是指将动物体细胞核全部导入另一个体去除了胞核的激活的卵细胞内，使之发育成个体。

这样的个体所携带的遗传性状仅来自一个父亲或母亲个体，因而为无性繁殖。

从遗传角度上讲，是一个个体的完全拷贝，故称之为克隆。

5．genechip—基因芯片，又称DNA微阵列，包括DNA芯片（DNAchip）和cDNA芯片（cDNAchip），是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。

6．genediagnosis—基因诊断，是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

7．genetherapy—基因治疗，从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

8．基因疫苗—主要是指DNA疫苗，是第三代疫苗。

其将编码外源性抗原的基因插入到真核表达质粒中，直接导入人体内，抗原基因在一定时间内持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到治病或防病目的。

9．geneinactivation—基因失活，是指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。

10．genereplacement—基因置换，是指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。

11．geneaugmentation—基因增补，是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。

12．PCR—聚合酶链反应，指以DNA分子为模板，以一对与模板序列相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，完成新的DNA的合成，重复这一过程使目的DNA片段得到扩增。

这一技术可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。

13．exvivo—间接体内疗法，是指在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到治疗的目的。

五、问答题

1．简述印迹技术的分类及应用。

答：

印迹技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。

它主要包括DNA印迹技术（Southernblot）、RNA印迹技术（Northernblot）和蛋白质印迹技术（Westernblot）等。

DNA印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析，例如对基因组中特异基因的定位及检测等，此外亦可用于分析重组质粒和噬菌体。

RNA印迹技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。

蛋白质印迹技术，也叫免疫印迹，用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

2.简述PCR反应体系的基本成分、PCR的基本反应步骤和主要用途。

答：

组成PCR反应体系的基本成分包括模板DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。

PCR的基本反应步骤包括：

（1）变性：

将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。

（2）退火：

将温度下降至适宜温度使引物与模板结合。

（3）延伸：

将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。

以上三个步骤为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。

PCR主要用途：

（1）目的基因的克隆；

（2）基因的体外突变；（3）DNA和RNA的微量分析；（4）DNA序列测定；（5）基因突变分析。

3．简述PCR技术的基本原理及应用。

答：

PCR技术类似于DNA的体内复制。

以DNA分子为模板，以一对与模板序列互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，利用4种脱氧核苷酸，完成新的DNA的合成，重复这一过程使目的DNA片段得到扩增。

这一技术可以将微量目的DNA片段扩增100万倍以上。

基本步骤是首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高，使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。

这种变性-退火-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA和RNA的的微量分析、DNA序列测定和基因突变分析等。

4.简述逆转录PCR、原位PCR和实时PCR技术的基本原理和主要区别。

答：

逆转录PCR是将RNA的逆转录和PCR反应联合应用的一种技术。

即首先以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以后者为模板通过PCR反应来扩增目的基因。

原位PCR是在固定液固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。

实时PCR的基本原理是引入了荧光标记分子，并使荧光信号强度与PCR产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出PCR产物量。

根据动态变化数据，可以精确计算出样品中最初的含量差异。

逆转录PCR与传统PCR相比，将RNA的逆转录和PCR反应联合起来，可以对已知序列的RNA进行定性及半定量分析。

常规PCR或RT-PCR技术的产物不能在组织细胞中定位原位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，原位PCR技术可以将目的基因的扩增与定位相结合。

实时PCR技术与传统PCR反应相比，在常规正向和反向引物之间，增加了一特殊引物作为探针。

该技术可以通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰。

5.简述DNA链末端合成终止法（Sanger法）测序的基本原理。

答：

DNA链末端合成终止法基本原理是：

将2'，3'-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分dNTP作为底物掺入到新合成的DNA链中，由于ddN