生物参数检测与控制教案h.docx
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生物参数检测与控制教案h
西华大学教案
章节名称
第四章色层分析法
第四节薄层层析第五节纸上电泳
教学时数
2
授课方式
多媒体
教学目的及要求
1．掌握薄层层析、纸上电泳的基本原理及测定样品的原理。
2．掌握薄层层析、纸上电泳的基本概念及结果计算。
3．了解薄层层析、纸上电泳的操作技术和仪器使用。
教学重点与难点
1．薄层层析、纸上电泳的基本原理及测定样品的原理。
2．薄层层析、纸上电泳的基本概念及结果计算。
讨论练习作业
1．薄层层析、纸上电泳的基本原理及测定样品的原理。
2．薄层层析、纸上电泳的基本概念及结果计算。
教学手段
讲授
参考资料
《分析化学》
具体内容
第四节薄层层析
薄层层析是近二十多年来发展起来的一种微量而快速的层析方法。
它是把吸附剂或支持剂均匀地铺在玻璃板上，成一薄层，把样品点到薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离鉴定和定量的目的。
因为层析是在薄层上进行的，所积称为薄层层析。
薄层层析能用于各种有机物和无机离子为分离和鉴定，在发酵工业上常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等，并可用来定量分析。
它的应用范围比纸上层析更加广泛，因此，在发酵工业上的应用日益增多。
薄层层析的原理同柱层析，操作与纸上层析相似，但与纸上层析相比，薄层层析具有下列优点：
①展开时间短。
一般在20～30分钟左右，展开距离通常只需10厘米，且分高效果较好。
②层析后得到的斑点小而清晰。
③能够使用多种显色剂。
象浓硫酸那样具有腐蚀性的试剂也可见直接喷洒在薄层上，或直接将薄层板加热到500℃左右，观察炭化后的斑点。
④点样量少。
通常仅需样品量几微克到几十微克，灵敏度比纸上层析高10～100倍，甚至0．01微克的成分也可检出，故可用于微量成分分析。
但也能分离500毫克甚至更多的样品作制备层析。
薄层层析的缺点是Rf值的重视性比纸上层析差，在某些情况下“边缘效应”较为严重。
一、分类
（－）吸附薄层层析
吸附薄层层析的原理同吸附柱层析。
根据吸附剂对各种化合物吸附能力的强弱不同，在吸附剂和层开剂中吸附和解吸的差异，使样品中各物质以不同的速率移动，最后达到分离。
吸附薄层主要用于脂溶性物质的分离，但也能分离水溶性物质。
（二）分配薄层层析
分配薄层层析的原理同纸上屋析。
是以所吸收的水或其他溶剂作为固定相，以适当的溶剂作为流动相来展开，由于样品中各物质在两相中分配系数不同，从而得到分离。
分配簿层适用于水溶性物质的分离，对于脂溶性物质则可用反相薄层层析进行分离。
（三）离子交换簿层层析
离子交换薄层层析的原理同离子交换柱层析。
一般用离子交换纤维素来制备薄层板，可用来分离某些亲水性强的化合物，如核苷酸。
（四）其他
如用凝胶（如交联葡聚糖凝胶）作为簿层材料，称为“凝胶层析”，它能起分子筛的作用。
适于分离一些高分子化合物，如蛋白质、酶和多糖等。
如将薄层板代替滤纸送行电泳，称为“凝胶电泳”，其电泳时间短，且斑点紧密。
二、操作方法与操作条件的选择
在薄层层析中，吸附剂与支持剂往往不能截然区分，在某些情况下，同一物质既可作为吸附剂，又可作为支持剂。
（－）吸附剂的选择
用于薄层层析的吸附剂要求不应溶于水及有机溶剂，并具有一定的吸附能力，能使样品混合物得到良好的分离效果，其颗粒应具有一定大小。
吸附剂的吸附能力强弱不仅决定于吸附剂本身，还和下列因素有关:
①吸附能力（即活性）随水分增加而降低。
如硅胶合水量超过16-18％时，其吸附作用最弱。
氧化铝需经高温处理，除去水分后吸附作用最强。
②与被测物质的化学结构有关。
例如：
对于饱和烃几乎完全不被吸附，或吸附很弱，而对于具有双键结构的化合物则吸附能力较强，对具有共轭双键的化合物吸附能力更强。
（二）常用的吸附刘
①硅胶：
硅胶（SiO2·nH2O）系多孔性物质，在网状多孔结构的分子内可以吸留多量的水分，此部分水称为“结构水”，在加热活化时，如温度过高即可失去结构水,破坏网状结构而失去活性。
硅胶表面的吸附水称为“自由水”或“游离水”。
硅胶的活性决定于自由水的多少，自由水多时活性低，反之则活性高。
当加热到100℃左右时，自由水即被可逆除去，当自由水含量高达17％以上时，则吸附力极低，此时可用作分配层析的支持剂。
硅胶能吸附脂溶性物质，也能吸附水溶性物质。
由于它是略带酸性的吸附剂，故适于分离酸性及中性的物质。
目前，薄层层析用的硅胶国内已有生产,其粒度200～250目，纯度较高。
②氧化铝；氧化铝的吸附能力比硅胶强，它是略带碱性的吸附剂，适于分离碱性物质或用于硅胶不能分离的中性物质。
层析用的氧化铝一般为200～300目，粘合力强，可以制软板，也可见制硬板。
③聚酰胺：
聚酰胺（即尼龙）是一种用途广泛的有机吸附剂，其优点是具有极大的吸附能力，适于带羟基化合物的分离。
用于薄层的聚酰胺粉末，其颗粒大小为0．1～0．2毫米，即70～140目．如将聚酰胺以水、缓冲液与甲酰胺处理，则可作为分配薄层的支持剂。
（三）支持剂的选择
用于分配薄层的支持剂与分配柱层析相似，它应该是惰性的，没有吸附力的，但要能吸留较大量的固定相液体。
常用的支持剂是纤维素及硅藻土。
①纤维素：
薄层层析用纤维素是长度为2～20微米的短纤维，颗粒为70～140目。
它有两种应用型式，即天然纤维素与微晶纤维素。
其中天然纤维素既可作为吸附剂，又可作为支持剂．而微晶纤维素只能作为支持剂，适于分离水溶性的物质如糖类、氨基酸、核酸等．
②硅藻土：
薄层用硅藻土的颗粒大小一般为0．07毫米，它与纤维素一样，适于分离水溶性的物质。
（四）展开剂
1．选择原则
在吸附层析中，当所用吸附剂已定，则对同一化合物的解吸能力与展开剂的极性有关，极性大则洗脱能力也大，即在薄层上斑点展开距离越远，Rf值也越大。
展开剂的洗脱能力的次序见柱层析一节。
薄层层析所用展开剂主要是低沸点的有机溶剂，并须加以精制。
一般使用2～3种组分的多元溶剂系统。
对于薄层所用的展开剂的选择原则与吸附柱层析一样，也是根据溶剂的极性、被测物质的极性及吸附剂的活性三方面来考虑（见图5－25）。
如果选择不当，就会出现物质被带到溶剂前沿，不形成斑点，而成为和溶剂前沿一致的一条带状，或被留在原点，或上升距离很小，分离效果不好等。
在吸附剂、展开剂、样品三因素中，实际上样品的极性与吸附剂的吸附能力都是在一定情况下恒定的因素，因此，分离效果主要取决于展开刘。
通常可以先选择某一种溶剂，根据物质在薄层上的分离效果，再加减其他溶剂来调节极性大小。
2．选择方法
展开剂的选择方法有下列几种：
①微量圆环法：
将待分析的几个样品，用毛细管点在薄层上，两点间距离为2～3厘米，再用毛细管将待选择的展开剂滴到点样处，并进行展开，干燥后显色，观察样品经展开后呈圆环状的情况。
取同心圆层次清楚，Rf值在0．5左右的溶剂再进行复试，进一步决定展开剂的取舍。
②载玻片法；用普通载玻片（2．5×7．5厘米）涂上吸附剂制成薄层板，把样品点在薄层上．放在盛有3～5毫升待试展开剂的小玻璃缸中展开5厘米．干燥后显色，根据显色情况来确定展开剂的取舍，此法也适用于分配薄层。
③图解法：
用硬纸或透明照相底片，按图5-25制成一供选择展开剂用的简便选择器，根据被测物质的极性，将中间可转动的三角形的一个顶端固定，然后根据其他两个顶端所指部位，决定所选择的吸附剂的活性与展开剂的极性。
例如：
被测物质的极性较大，应选用活性较弱的吸附剂以及极性较强的展开剂。
如被测物质的极性较小，则应选用活性较强的吸附剂以及极性较弱的展开剂。
&对于分配薄层的展开剂选择与纸上层析基本相似。
（五）操作方法
1．薄层极的制作
薄层层析所用的玻璃板应是质量较好，表面平整，最好是镜面玻璃，否则制出的薄层就可能各部分不一致。
玻璃板应先平水浸泡，洗手，烘干。
在涂料前用浸有乙醇的脱脂棉擦净，玻璃板上不得留有油痕，否则薄层在展开时容易脱落．
常用的薄层板可分为硬板（湿板）与软板（平板）两种。
在吸附剂或支持剂中加入粘合剂（如煅石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等），所制成的板称为硬板。
反之，不加粘合剂的板称为软板。
硬板因吸附刑或支持剂被粘牢在玻璃板上，所以喷显色剂时不会被冲散，而且可以直立展开。
不含粘合剂的软板易被风吹散，只能安放于近水平的位置展开。
市售的“硅胶G”、“氧化铝G”都是加了一定量的锻石膏作粘合剂的。
而牌号“H”或“N”（如“硅胶H”、“硅胶N）则不含粘合剂，可供制备软板用，如欲制备硬板，必须加入一定量的粘合剂（如硅胶中加入锻石膏量为5～20％，一般为10～13％）。
此外，还有牌号“F”的吸附剂，其中已加入对254纳米波长能发荣光的物质，即荧光吸附剂．
①软板的制备：
软板的制备是用干法涂布。
在一根玻璃棒的两端分别绕几圈胶布，圈数多少视所需薄层厚度而定，一般厚度为0．5～0．75毫米，有时可达1～2毫米。
然后在玻璃板下放一张大于玻璃板的纸，便于回收吸附剂或支持剂。
已经活化的吸附剂或支持剂倒在玻璃板上，将玻璃板一端固定，然后用玻璃棒压在玻璃板上。
如图5－26
（1）所示，用力均衡匀速地推进。
中途切勿停顿，否则薄层厚度不均匀，影响分离效果，然后再除去多余的吸附剂或支持剂即成。
另外也可用特制的涂有器涂制，见图5－26
（2）。
②硬板的制备：
硬板采用湿法涂布，即在加粘合剂的吸附剂或支持剂干粉中，加入水或其他溶液，调成糊状，涂布于玻璃板上，再经一定的干燥才能应用。
具体操作可分为调浆和涂板二步。
i调浆：
调制浆料是制板的一个重要环节，用水量多少与调浆时间不仅关系到浆料的稠性，而且也影响到薄层厚度，一般吸附剂或支持剂与蒸馏水用量之比为1：
2到1：
2．5为宜。
调浆时要调和均匀，不要用力过猛而产生大量气泡，使薄层涂布不均匀而影响分离效果。
现以硅胶G和氧化铝G为例：
称取10克，加水15毫升，于研体中迅速搅拌，然后再加水3～5毫升，再搅拌后立即涂布。
如为纤维素薄层，则可取15克纤维索加90毫升水，搅拌后涂布，一般可不加粘合剂。
另外，在某些特定要求下，为了保持薄层具有恒定的PH值，可见用缓冲溶液代替蒸馏水制板。
有时为了减少显色手续，在制板时加入显色剂或荧光指示剂，调制成浆后再制板。
ⅱ涂板：
常用的涂权方法有下列四种：
浸涂法；将玻璃板在调好的浆液中浸一下，使浆液在板面上形成薄层。
喷涂法：
用喷雾器将浆液均匀地喷在玻璃板上，使形成薄层。
推铺法：
同干法涂板。
倾淌法：
用一根宽口吸管，取调好的浆液涂在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使浆液淌满整块玻璃板，再轻敲玻璃板，使薄层较为均匀。
另外，也可用特制的涂布器，推动涂布器将浆液涂在准备好的玻璃板上，这种涂布器一次可涂布很多厚度一致的薄尾板。
薄层涂好后，平放，在温室下任其自然干燥。
薄层的厚度一般为0．25—0．30毫米，如分析较多量的样品时可达0．4～0．5毫米，但不能太薄，否则影响分高效果。
涂好的薄层板对光观察时，板面应均匀一致、表面光滑、细洁无痕和无泡点，喷雾时，吸附刑或支持剂不应脱落。
③活化：
涂好的吸附薄层要进行活化。
活化目的是使其失去水分，具有一定的吸附能力。
其操作是先将自然干燥后的薄层板放入干燥箱中干燥，一般硅胶薄层板加热温度为100一105℃活化1小时。
氧化铝薄层板加热温度为80～100℃，活化40～50分钟。
活化时间的长短应视薄层的厚度和所需活性而定。
会有缓石膏的薄层不能超过128℃，否则会再一次脱水而影响活性。
活化好的薄层板放在盛有无水氯化钙或变色硅胶的干燥器中，供一周内使用，超过一周应再次活化。
对于分配薄层则不需活化，一般使其自然干燥12小时左右即可使用。
如用甲酸胺作固定相，则在使用前方在薄层上喷甲酸胺的丙酮溶液，待丙酮挥发后立即应用。
④活性测定：
吸附剂的活性关系到被分离物质在薄层上分离情况的好坏以及Rf值的大小，因此薄层板的活性不应太强或太弱．
ⅰ硅胶薄层的活性测定：
称取奶油黄、苏丹红、靛益三种色素各庄0毫克，溶于100毫升苯中，将此混合液点子薄层上，用本展开，时间为30—40分钟，溶剂前沿上升到10厘米时，三种色素的R；位应分别为0．58，0．19，0．08，则活性为合格。
另外，也可取对二甲氨基偶氯苯、靛益、苏丹红各10毫克，分别溶于1毫升氯仿中，点于薄层上，点的直径为1～2毫米，用正乙烷：
乙酸乙酯＝9：
1展开后。
对二甲氨基偶氯苯是在溶剂前沿，靛蓝于后，苏丹红在最后则为活性合格。
ⅱ氧化铝薄层的活性测定：
称取偶氯苯30毫克，对甲贫基偶氯苯、苏丹黄、苏丹红及对氨基偶氯苯各20毫克。
分别溶于50毫升重餐的无水四氯化碳中，各取QO微开点于氧化铝薄层上，用四氯化碳展开，溶剂上升至10厘米，根据表5－18所列的Rf位测定其活性。
氧化铝活性级别分五级。
Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅴ，一般以Ⅱ、Ⅲ级为宜。
在实际工作中，最可靠的办法是在同一薄层板上用标准物质作对照，因此活性试验可省略。
⑤变性薄层板与反相薄层板的制作及应用：
通常由于吸附剂PH值的差异而达不到分离的效果，如硅胶为微酸性的吸附剂，适于酸性和中性物质的分离。
对于碱性物质则在展开时会留在原点不动或造成严重的拖尾。
同理，氧化铝是碱性吸附剂，不适于酸性物质的分离。
在这些情况下可使用变性薄层。
变性薄层是以酸液、碱液或缓冲液代替水来制备具有一定酸碱度的薄层。
制备酸性薄层时，可用0．SN草酸或0．IN硼酸溶液，碱性薄层可用0．5～1．ON氢氧化钠或氢氧化钙溶液，缓冲溶液可用0．ZM磷酸缓冲溶液。
另外，在分配薄层层析中，同纸上层析一样，对于分高脂溶性物质时可采用反相薄层层析。
它是以极性溶剂为流动相，而以极性弱的溶剂作为固定相。
反相薄层是在薄层板制好并干燥后，再以硅酮、十一烷、十四烷、液体石蜡、石油馏分（沸点240℃）。
煤油（沸点240～250℃）、硅油等浸渍薄层。
其操作是将薄层板小心地浸没在含5—10％上述化合物的乙醚或石油醚溶液中，数分钟后，取出干燥，除去溶剂（乙醚可在室温挥发除去，石油醚则应在120“C加热25分钟）即可。
⑥烧结薄层板：
这是一种经一次制备可从多次使用的薄层板，它的制备、使用没洗涤方法如下：
取石英玻璃在球磨机中磨碎，然后用1：
1盐酸洗涤，再用蒸馏水反复洗至中性，洗涤时应不断搅拌。
静置，顾去浮在水面上的玻璃细粉，最后倒去上层水液。
将玻璃粉移入搪瓷盘中，以160～180℃烘1小时，过200～300目筛备用。
另取200～300目氧化铝，以1：
2.5的重量比例与上过玻璃粉混合均匀，用无水乙醇调成浆状，按通常方法涂板，涂层厚度为0．25～0．30毫米，在空气中自然干燥。
干燥后放在约5毫米厚的硬石棉板上，在高温炉中加热至750～780℃，关闭电路，自然冷却后取出备用。
也可用硅胶H按1：
2．5的重量比例与玻璃粉制成烧结板，但加热温度不直超过750℃，否则就会出现薄层龟裂现象，而且薄层的硬度也较差，易受损伤。
用普通玻璃粉代替石英玻璃粉得到的烧结板同样可以使用，但因其能吸收波长300钠米的紫外线，所以在用荧光激发显色剂时灵敏度有所降低。
烧结薄层板的使用方法在点样与展开等操作方面和一般薄层板完全一样。
但每次使用后必须将原有斑点及显色剂的沾污洗涤干净。
洗涤的步骤是先用乙醇或其他有机溶剂浸泡，自来水冲洗干净后烘干。
再用铅酸洗液浸泡，自来水冲洗并浸泡至残留黄色褪去，或加入数滴浓氟水使黄色褪去，最后用蒸馏水充分洗净，在110℃烘箱中活化1小时，取出备用。
对于某些不易用此法清除的有机溶剂，可试在450℃高温下处理之。
2．点样
在点样前，样品一般都需经过预处理。
液体样品可直接萃取，固体样品应粉碎后萃取，或经过离子交换树脂除来后点样。
点样操作和纸上层析相似。
先将薄层板修整一下，因为涂好的薄层板在在四周的厚度不易均匀，影响展开效果。
所以在点样前从干燥器中取出的薄层板，将边缘约5毫米宽的涂层刮去。
在薄层板的底端约1．0～1．5厘米处划出点样线（原线），然后用针或铅笔每隔0．8～175厘米轻轻做一标记作为点样处（原点）。
将处理好的被测样品用合适的溶剂溶解（一般用氯仿、乙醇或其他挥发性好的有机溶剂，而不宜用水，因水能降低吸附剂的活性），。
浓度一般控制在0．01～1．0％为宜。
点样可用微量注射器、微量吸管或毛细管等。
点样量应视混合物中各物质含量而异，一般为几微克至几十微克。
如过多，则展开后斑点太大且发生畸形，使分离不清，过少则不显斑点。
，在薄层厚度为0．25毫米时，点样量不宜超过50微克，点的直径以0.２～０.３厘米为宜．用于定量或分离提纯时，可沿原线点上样品成一直线状，以使点样量相应增多。
必须注意，对于吸附薄层的休整和点样过程中，应力求操作迅速，防止薄层吸湿而降低活性。
点样最好在密闭的器皿中进行，如在空气中点样则越快越好，点样后可用热风吹一下。
点样的方法有以下两种：
①直接点样法：
将已纯化的样品清液用点样管直接点于薄层的原点上，点的直径不应超过0．3厘米，以使展开后得到较好的圆点，同时应注意勿戳破薄层，此法最为常用。
②滤纸移样法：
此法适宜于较大量的样品溶液。
操作时将滤纸用皮带冲打成3毫米直径的滤纸片，用针灸针戳起，固定在一个木塞上．将样品溶液点在悬空的滤纸片上，挥发干后再继续点样，直到点完一定量的样品溶液为止。
另外，在薄层板的原线上，用直径为3毫米的平头玻璃棒（或其他工具）轻轻压一下，形成一个直径为3毫米的圆穴，将点好样品的滤纸片用镊子小心地放入圆穴内。
如欲使纸片在薄层板上粘牢，可在薄层板的圆穴内滴入少许可溶性淀粉糊。
由于样品中各物质的Rf值受操作条件影响较大，放在实际操作中，通常在同一薄层上与标准物质一起，按相同操作条件进行展开。
3．展开
薄层的展开需在密闭的器皿中进行，层析江可用标本缸或长方形玻璃缸。
如采用单一的溶剂展开，且所用的玻璃缸体积较小，则溶剂蒸汽易达饱和。
展开时间也短。
故不必象纸上层衍那作预先用溶剂蒸汽饱和。
如用多元溶剂系统来展开时，‘其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯访一甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边较易挥发，因此。
它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。
见图5-27所示。
为减轻或消除边缘效应，可在层析缸的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加，见图5－28。
薄层层析的展开方式与纸上层析相似，有上升法、下降法与水平法等。
其中见上升法最为常用，上升法的装置见图5－29，层析缸一般是可密闭的玻璃缸，它的大小以能容纳薄层板为宜。
缸可以是立式的，也可风是卧式的。
在卧式装置中，缸内外各用木块垫起10～30˚角，使展开剂浸入薄层约0．3～0．5厘米，切勿使点样处浸入展开剂中。
对于不加粘合剂的薄层板只可采用近水平展开，板与水平面成10～20˚角。
采用立式装置时，由于空间容积较大，溶剂蒸汽不易饱和，为了防止边缘效应，必须在层析缸内壁贴上用展开剂润湿的滤纸。
当展开剂上升至一定距离（一般为10～15厘米）时，取出薄层板，晾干。
另外，与纸上层析一样，当样品混合物分离不清时，可采用两次展开、双向展开与楔形展开等。
展开后物质的Rf值应在0．15～0．8之间，最好能在0．4～0．5左右，否则应选用其他合适的溶剂来展开。
4．显色
经展开后的薄层，如被分离物质是有色化合物，则可观察到斑点位置，如为无色化合物，则需显包后才能确定。
常用的显色法有紫外线显示法与显色剂显示法。
①紫外线显示法：
同纸上层析法。
有时对于本身不显荧光的物质，可在制板调浆时把荧光指示剂（如1．5％磷酸锌）加入到浆料中，展开后直接在紫外线下观察斑点。
②显色剂显示法：
、一般纸上层析所用的显色剂均可用于薄层层析中，另外还可采用万能显色剂。
万能显色剂多数具有腐蚀性，需用玻璃喷雾器喷洒。
显色喷雾时，喷出的雾应细而均匀，不应有浓滴。
对于不含粘合剂的薄层板应注意勿使薄层吹散。
为此薄层板与喷雾器的距离应稍远。
喷雾腐蚀性显色剂时，必须在通风柜中进行，并用玻璃板作底村以免腐蚀其他物品。
对子聚酰胺与纤维素薄层板，则不能使用腐蚀性显色剂，否则薄层会被腐蚀。
万能显色剂适用于有机物的检出，但灵敏度较低。
常见的有下列几种：
①10～20％硫酸溶液。
②碘结晶：
在密闭容器中用碘蒸汽熏或喷民0．5％碘的氯仿溶液，生成暗褐色斑点，特别是对于不饱和的有机化合物较为灵敏。
③硫酸-重铅酸钠；重铅酸钠3克溶于20毫升水及10毫升浓硫酸中，喷雾于薄层后，红色的底上呈现绿色的斑点。
④硫酸-钒酸溶液：
2克钒酸铵加5毫升水成悬浊液，加50毫升50％硫酸溶液，将薄层于110℃加热10～20分钟后喷雾。
⑤将薄层极加热至500℃左右，可出现炭化的斑点。
纤维素及聚酸胺薄层板不能使用此法。
薄层板显色后，根据其几位即可进行定性鉴定，其定量方法与纸上层析基本相同。
三、影响薄层层析的因素
在应用薄层层析进行分析时，为取得良好的分离效果及重现的Rf值，必须严格控制各种操作条件，使影响因素尽量减小。
薄层层析的影响因素基本上与纸上层析相同，另外还有：
①吸附剂的粒度：
吸附剂粒度的大小对展开速度、分离效果及Rf值均有显著影响。
如颗粒太粗，展开速度太快，分离效果不好。
颗粒太细，展开速度太慢。
如颗粒大小不均匀，则不能制成均匀的薄层，而且展开时溶剂前沿不齐。
②吸附剂的活性：
吸附剂的活性与含水量的多少有关，它能影响Rf值与分高效果。
如活性太大，则使Rf位降低。
因此，活化薄层板时，加热时间与温度要固定，点样时动作要迅速。
此外，薄层制作时，对同一组实验应使用同一批吸附剂或支持剂，以及同一批试剂作展开剂。
由此可知，薄层层析的影响因素要比纸上层析多，因此，Rf值的重现性较差。
对于不同的检测物质以及不同的操作条件，其重现性也有差异。
重现性的好坏常以RS来表示。
当被测物质与标准物质（S）在同一薄层上展开时：
RS值或﹥1，或﹤1，越接近于1，则表示重现性越好。
第五节纸上电泳
一、电泳原理与分类
带电粒子（胶粘或分子）在直流电场作用下，能向异性电极移动，这种现象称为电泳。
带电粒子所以能在电场的作用下移动，是因为本身带有电荷，由于粒子大小不同，以及所带电荷种类、数量不同，在一定的电场作用下，就以不同速度向电极移动。
从而用来分离混合物和鉴定未知物质。
电泳速度U又称电泳迁移率，即在单位电场强度下，带电粒子在单位时间内所移动的距离，可用下式求得：
式中E——电场强度（伏/厘米）
t——泳动时间（秒）
⊿X——泳动距离（厘米）
电泳一般可分两类：
1．自由电泳（界面电泳）
它是没有支持解质的电泳，一般作胶体纯度的鉴定及电泳速度的测定。
但由于使用仪器复杂，又难于操作，因此应用不广泛。
2．区带电泳（分段电泳）
它是有支持解质的电泳，电泳后不同组分会形成带状区间而分离。
设备简易、操作方便、分辨力较好、样品可多可少、应用较广。
但由于支持解质的存在，准确性不如自由电泳高，同时带进了一些新的因素影响电泳结果。
区带电泳按其支持剂的不同可分为：
①滤纸及其他纤维素电泳：
以滤纸、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维为支持物质。
②粉末电泳：
以纤维素粉、淀粉、玻璃粉为支持物质。
③凝胶电泳：
以交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶等为支持物质。
④薄膜电泳：
以醋酸纤维薄膜为支持物质。
按仪器装置形式可分为：
①平板电泳；将支持物质铺在长方形的玻璃或有机玻璃平板上进行电泳，此法最为常用。
②垂直板电泳：
将支持物质铺在平板上，作垂直装置后进行电泳。
③垂直柱形电泳：
将支持物质装在垂直的圆形玻璃柱内进行电泳。
④连续液流电泳：
将样品和缓冲液连续吸到垂直的滤纸上进行连续电泳。
⑤盘电泳：
将支持物质装入同一规格的玻璃管内，在一不连续系统中进行电泳，样品分离后的区带类似圆盘。
纸上电泳具有快速、准确、重现性好等
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