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胰岛素一级结构测定

胰岛素的一级结构测定方案

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胰岛素的一级结构测定

【摘要】胰岛素一级结构是是推测蛋白质高级结构的分子依据，是理解蛋白质功能的分子基础，是研究生物进化的分子佐证，因此研究胰岛素的一级结构具有很重要的意思。

本文通过介绍胰岛素的基本定义，结果，功能，分类，以及胰岛素一级结构的测定方案，来进一步加深对胰岛素的了解。

【关键词】胰岛素一级结构实验测定步骤

一、胰岛素的基本概念

1.胰岛素的基本定义

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。

胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。

外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗，糖尿病患者早期使用胰岛素和超强抗氧化剂如（注射用硫辛酸、口服虾青素等）有望出现较长时间的蜜月期，胰岛素注射不会有成瘾和依赖性。

2.胰岛素的基本结构

胰岛素是在胰岛β细胞的内质网膜结合型核糖体上合成的，核糖体上最初形成的产物是一个比胰岛素分子大一倍多的前胰岛素原单链多肽，其N端区域含有20个氨基酸左右的疏水性信号肽。

当新生肽链进入内质网腔后，信号肽酶便切除信号肽，形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体，以颗粒的形式储存备用。

胰岛素就像一把钥匙，开启葡萄糖进入细胞的大门，只有进入细胞的葡萄糖才能为细胞提供动力，使人体具有正常的各种生理功能。

胰岛素的一级结构由51个氨基酸残基组成分两条链：

A链：

21个氨基酸残基B链：

30个氨基酸残基含三个二硫链：

一个A链内的二硫键两个链间二硫键。

不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上，它们随种属而异。

表1-1仅列出人和几种动物的氨基酸差异，但它们的生理功能是相同的。

表1-1不同种属动物的胰岛素结构

表：

一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异

名称

A8

A9

A10

B30

与人的差异数

活性

人

苏氨酸

丝氨酸

异亮氨酸

苏氨酸

-

猪

-

-

丙氨酸

1

抹香鲸

-

-

丙氨酸

1

马

-

甘氨酸

丙氨酸

2

↓

象

-

甘氨酸

缬氨酸

2

↓

牛

丙氨酸

-

缬氨酸

丙氨酸

3

↓

　由于猪与人的胰岛素相比只有B30位的一个氨基酸不同，人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸，因此我国目前临床应用的是以猪胰脏为原料来源的胰岛素，抗原性比其他来源的胰岛素要低。

胰岛素的前体是胰岛素原，胰岛素原可以看成是由一条连接肽（C肽）的一端与胰岛素A链的N-末端相连，另一端与B链的C-末端相连，不同种属动物的C肽也不同，如人的C肽为31肽，牛的为26肽，猪的为29肽。

胰岛素原通过酶的作用，C肽两端的4个碱性氨基酸被水解去除后，即形成一分子胰岛素和一分子无活性的C端。

人胰岛素：

甘精胰岛素：

Detemir：

赖脯胰岛素：

天门冬胰岛素：

3.胰岛素的功能胰岛素是由胰岛β-细胞分泌的一种蛋白质类激素

●促进肌肉、脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性

●诱导、促进肝脏葡萄糖激酶等合成，增强糖的分解代谢

●促进肝、肌肉中糖原合成

●抑制糖异生

●促进糖转变为脂肪抑制脂肪分解

4.胰岛素的分类：

按来源不同分类

●动物胰岛素：

从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。

●半合成人胰岛素：

将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。

●生物合成人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：

利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。

二．胰岛素的一级结构测定：

1．蛋白质一级结构测定的意义

①对于酶催化部位及高级结构的研究提供化学基础

②对于研究生物进化提供不可缺少的重要材料

③研究病变的机理：

如分子病

④为合成某些生物药类提供依据

⑤是研究基因工程中基因表达的重要内容

⑥预测蛋白质的二级及三级结构，甚至预测蛋白质

的某些功能

2.测定原则：

将大化小，逐段分析，并对照两套以上肽段的分析结果，排出

肽段的前后位置，最后确定全顺序。

3、测定大致步骤

①测定胰岛素氨基酸残基组成，很据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量。

②测定胰岛素分子中多肽链的数目。

③二硫键的断裂及多肽链的拆分。

④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定。

⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解的各肽段的氨基酸顺序彼此间的相互重叠拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序，并确定二硫键的位置。

简单的说：

A.分离提纯待分析的蛋白质样品

B.拆分蛋白质分子中的多肽链（鉴定N-末端或C-末端残基，确定蛋白质分子的肽链数，测定各亚基的分子量，测定肽链的氨基酸组成）

C.酶解肽链及片段分离

D.测定片段氨基酸序列

E.拼接肽链的一级结构

F.确定二硫键的位置

B步骤中

⑴拆分蛋白质分子中的多肽链：

若肽链间非共价键连接，可使蛋白质变性，用高浓度变性剂，8mol/L脲素或解聚剂SDS拆离，或6mol/L盐酸胍处理。

若肽链间通过—S—S—连接，需拆开—S—S—，并将出现的—SH保护（防止氧化连结），保护剂用烷基化试剂，如碘乙酸等。

1.氧化法（过甲酸）

优点：

—S—S—切断后，肽链不能重新形成—S—S—，便于肽链分离。

缺点：

①甲硫氨酸侧链氧化成亚砜，但由于相当稳定，并不影响分析

②色氨酸会遭到破坏

③氧化产物不能重新还原为巯基

2.还原法（巯基乙醇）

利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。

当高浓度的巯基乙醇在pH8条件下室温保温几小时后，可以使-S-S-定量还原为SH。

此同时反应系统中还需有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构型，此时还原剂就可作用于-S-S-。

此反应是可逆的，因此要使反应完全，疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。

Cleland试剂的还原作用：

Cleland′s指出二硫赤苏糖醇（dithioerythriotol）及二硫苏糖醇（dithiothriotol）在氧化还原能力上是比较强的试剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。

还原蛋白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。

稳定H基的方法可用烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生

物。

如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其产物S-羧氨甲基衍生物不带电荷，磺代乙酸也可与组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应，但反应条件不同，可通过各种pH及反应时间进行控制。

⑵测定多肽链的N—末端或C—末端目的：

①确定蛋白质分子中多肽链的数目

②确定多肽链N—末端和C—末端氨基酸残基的种类

（一）游离N—末端测定法

1Sanger反应（2，4－二硝基氟苯的反应）

用酸将DNP－多肽水解，第一个肽键断裂，形成DNP－氨基

酸，用乙醚抽提DNP－氨基酸，经纸层析后，确定是何种氨基酸

用途：

用来鉴定多肽或蛋白质N－端氨基酸顺序

3.二甲氨基萘磺酰氯法（DNS法），亦称丹磺酰氯法

4.氨肽酶法

5.DABITC/PITC双偶合法：

DABITC（4-N，N-对甲氨基偶氮苯—4′—异硫氰酸酯），生成的DABTH—AA具明显颜色，光吸收在340—580nm，消光系数约为PTH—AA的两倍，大大提高了灵敏度。

但产率仅50%，需再用PITC作第二次偶合。

6.氰酸法：

先用8mol/L脲素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，再用氰酸钾处理

（二）封闭N—末端的测定

1.乙酰化N—末端：

CH3CO-NH-肼解N—末端乙酰基形成乙酰肼，与DNS—Cl作用，形成N—乙酰—N′—丹磺酰肼，经乙醚抽提后，层折鉴定。

2.甲酰化N—末端：

弱酸（0.5mol/LHCl的甲醇溶液），室温处理48h，甲酰基即水解下来，再按N—末端测定方法鉴定。

3.焦谷氨酸封闭的N—末端

①酶降解法

②化学降解法

（三）C—末端测定法

1.羧肽酶法：

羧肽酶A、B、C、Y等

2.肼解法

4.乙内酰硫脲法

3.还原法：

α-氨基酸，α-氨基醇，层析鉴定

三、多肽链断裂成肽段（多肽链部分裂解及肽片段的分离）要求：

①水解点少②选择性强③反应产率高

（一）部分裂解：

注意：

要用两种或两种以上的方法进行部分裂解。

1溴化氰水解法：

它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键

2.部分酸水解：

①稀酸：

pH2.5时，天冬氨酸羧基侧的肽链易断裂②浓酸：

含羟基侧链的AA残基如丝氨酸、酪氨酸的氨基侧肽键断裂。

3.羟胺水解

4.蛋白酶裂解法：

酶和对应的断裂位点

●胰蛋白酶Lys，Arg（C）

●颌下腺蛋白酶Arg（C）

●胰凝乳蛋白酶Phe,Trp,Tyr（C）

●金黄色葡萄球菌V8蛋白酶Asp,Glu（C）

●天冬氨酸－N－蛋白酶Asp,Glu（N）

●胃蛋白酶Phe,Trp,Tyr（N）

●赖氨酸内切蛋白酶CLys（C）

（二）肽片段的分离原理：

基于肽片段的物理化学性质，如分子大小、电荷、极性、溶解度、共价或非共价结合等。

方法：

凝胶过滤法、离子交换法、薄层层析法、薄层电泳、高效液相层析（HPLC）等。

四、肽段氨基酸组成分析：

①确定肽链中的氨基酸组分②帮助发现分离时肽段的丢失③为选择裂解手段提供依据

Ⅰ盐酸水解法：

密封无氧、110℃、5.7mol/L恒沸点HCl，另加2%苯酚抗氧化，水解24h。

Ⅱ磺酸水解法：

用4mol/L甲基磺酸或3mol/L对甲苯磺酸，内含0.2%色胺作保护剂，密封无O2、110℃水解24h以上。

Ⅲ碱水解法：

仅限于测定色氨酸和对酸不稳定的某些氨基酸衍生物。

密封无O2、4.2mol/LNaOH、110℃水解16h，可加入一定量的淀粉，用作抗氧化剂，以提高色氨酸的回收率。

4.酶水解法：

①蛋白酶（内切酶）②氨肽酶（外切酶）

五、氨基酸排列顺序的测定

（一）异硫氰酸苯脂降解法（Edman降解法）

长肽：

顺序Edman测序法

短肽：

减去法，测未反应肽段的氨基酸组成

（二）DNS—Cl—Edman法

将高灵敏度的DNS—cl技术与能连续降解的Edman反应相结合

（三）蛋白质自动顺序分析仪：

1.液相旋转杯顺序分析仪

2.固相序列分析仪

3.气相序列仪

六、建立蛋白质的一级结构

（一）N端基肽段的确定

（二）C端基肽段的确定

（三）重迭肽的建立

七、二硫键的定位

1.用胃蛋白酶水解原来的含-S-S-的蛋白质（链内、链间）成较小的肽段。

2.所得肽段混合物用对角线电泳技术进行分离含-S-S-的肽段。

3.将滤纸暴露在过甲酸蒸气中，供-S-S-断裂，被氧化成含两个半胱氨磺酸的肽段。

4.将滤纸旋转90°，进行第二向电泳，由于含半胱氨磺酸的成对肽段比原来含—S—S—的肽段小，且负电荷增加，都偏离对角线。

5.将每对含半胱氨磺酸的肽段分别取下，测序，与多肽链的氨基酸顺序比较，推断—S—S在肽链间或肽链内位置。

后记

胰岛素是一个结构特殊的小蛋白质,又是具有重要生物功能的蛋白质激素,与人类的健康和疾病有密切关系。

因此,有关胰岛素的研究始终是蛋白质研究中的热门课题。

【参考文献】

[1]张惠展，贾林芝.基因工程（第2版）[M].北京市：

高等教育出版社，2011.2

[2]余虹.班廷和胰岛素的发现.杭州：

杭州科技，2003年第1期

[3]吴祺.胰岛素史话

（一）——胰岛素的发现.北京：

中学化学教学参考，2007年第3期

[4]贾培红.从胰岛素的发展史看胰岛素类似物.糖尿病之友，2007年第4期

[5]杨荣武.生物化学原理.北京:

高等教育出版社,2006