利用蚕豆微核检验种产品.docx
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利用蚕豆微核检验种产品
蚕豆根尖微核检测对水体污染程度的研究
实验小组：
08级生物技术试验班一班A组
成员：
壳壳来了锅哥波波
指导教师：
****
时间：
*************************
目录
一、摘要.................................................................................................................................3
二、前言.................................................................................................................................3
三、实验目的和要求...................................................................................................4
四、实验原理.....................................................................................................................4
五、关键字...........................................................................................................................4
六、实验的材料和方法............................................................................................5
6.1、实验材料................................................................................................................5
6.2、实验方法................................................................................................................5
七、结果与讨论...............................................................................................................6
7.1、显微观察结果.......................................................................................................6
7.2、数据统计处理结果与分析.............................................................................7
7.2.1、数据统计结果...................................................................................................7
7.2.2、数据统计分析....................................................................................................7
八、参考文献......................................................................................................................10
一、摘要
采用蚕豆Viciafaba根尖微核检测技术对水体的污染情况进行了研究。
分别用5中不同方法对蚕豆进行处理，分别为重铬酸钾原液、100倍原液稀释液、500倍原液稀释液、1000原液稀释液、污水厂进口水、污水厂出口水，在以自来水直接处理蚕豆根尖作为对照，检测各组水样对蚕豆根尖细胞形成微核的诱导效应。
结果表明，各水样处理蚕豆根尖细胞后微核率在2％o～10％o之间，其中，4个样点水样可显著诱导蚕豆根尖细胞形成微核（P<0．05），水样污染达到中度污染水平。
二、前言
1．微核
微核（micronucleus，MN）是一种类似细胞核的结构，它位于间期细胞的细胞质中，其形状近似椭圆形、卵圆形或圆形，而且边缘光滑整齐。
虽然它在染色性质，结构特征和折光性等方面与细胞核（主核）相似，但它独立存在，不与主核连在一起。
微核大小不一，有的较大，有的较小，不仅在不同植物和同种植物的不同细胞中是这样，即使在同一细胞中也常常是如此。
无论它存在于何处，是何因子诱导而成，其体积总比所在细胞的主核小，其直径一般只有主核的1／20～l／3，所以称它为微核。
在通常情况下，绝大多数细胞没有微核，微核只存在于少数细胞中。
微核的产生与细胞的内外环境有关，主要是由于各种具有损伤性的理化因子影响了染色体的结构与功能，使胞内DNA的复制和细胞分裂受到干扰以及纺垂体的形成出现了障碍。
有人认为，细胞微核的形成有两条途径，一条是细胞G，期产生的染色体断片因没有着丝粒，在细胞有丝分裂后期不能被纺锤体牵引到细胞两极，故在细胞进入间期时，它们被排斥在细胞的主核之外，形成微核。
另一条是一些染色体因种种原因，使它们不能按时达到细胞的中央赤道板；或到达了细胞中央赤道板，但不能很好分离；或纺锤体的功能受到损伤，致使染色体不能被纺锤体牵引到细胞两极。
由于上述原因，使一些染色体滞留在赤道板附近或细胞质中，在细胞进行分裂时不能参与细胞主核的形成，成为游离于细胞中的微核。
此外，细胞受放射线严重照射时，一些DNA双链发生断裂，产生错误修复和间期细胞核严重膨胀，在某一部分向外隆起形成瘤状突起（核芽），然后瘤状突起尾部收缩，脱离细胞核，游离在细胞质中也可形成微核。
也有人认为，细胞凋亡能引起细胞内ca2+浓度升高，进而激活DNA内切酶，使其活性增加，产生较多的DNA断片【1】或细胞组分不正常（如缺乏叶酸）也在细胞中形成微核。
由此可见，微核的形成有多种途经和多种方式，而且它们中的染色体也不完全一样，既可以是有着丝粒的染色体，也可是没有着丝粒的染色体断片，或者二者都有。
2．蚕豆微核检测
蚕豆根尖细胞微核试验（Mcronudenstest，MCN）技术，是Degrassi在1982年提出的一种用于环境致突变物的检测方法。
近几年来，MCN技术作为一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试终点的植物微核检测方法，以其灵敏度高、操作技术简单，而且试验结果能够反映各种污染因子的综合遗传毒性等优点成为目前研究和运用较多的拟代替动物培养细胞检测环境“致癌、致畸、致突变”物质的高等植物细胞检疫体系【2】。
MCN技术在检测水环境中污染物的致突变性亦受到广泛重视，应用于对河流、湖泊、地下水及工业污水的水质研究。
目前主要集中在由水体中Cd2+、Hf+、z抒+、蚶+等重金属以及农药、抗菌素、洗涤剂等对蚕豆根尖细胞遗传毒性方面的研究【3】，而对由含高N、P无机或有机污染物引起的水体富营养化所导致的蚕豆根尖细胞遗传毒性的研究报道甚少
3.蚕豆根尖技术的优缺点
目前，在水体致突变性检测方面的成熟方法有很多，新方法也层出不穷，但应用于环境污染的大范围、大样本的遗传毒性检测，却仍然是为数不多的几种经典方法，如Ames试验和各种微核试验。
蚕豆根尖微核试验作为其中之一，具有许多其它测试手段无法比拟的优点。
首先，它的可靠性和灵敏性较高。
其次，蚕豆根尖微核试验的本底较低，这对于一种致突变性检测方法是十分重要的。
第三，它的检测物谱较广。
第四，在方法学上，它也特别适合环境致突变性监测和肿瘤流行病学调查。
与其它动物试验或细胞学试验相比，试验材料容易获得，仪器设备简单，也不损害工作人员的健康；与其它植物测试相比，它还具有个体差异小及不受地理、气候条件限制等优点。
这几点保证了它的普及性,特别适合于发展中国家及县、市级以下的监测点[4]。
但是，蚕豆根尖微核试验也存在一些不足之处。
首先它毕竟不是动物细胞试验，缺乏一定的代谢活化系统，其次它无法根据结果直接指示受试样品中致突变物的类型和诱变机制，第三，微核的判定、计数容易带有一定的主观性。
尽管蚕豆根尖微核试验与目前一些其它的细胞或分子生物学检测方法相比有某些方面的不足，但由于该方法的简便、快速及其经济性,在环境监测、污染调查中作为致突变性大范围筛选还是十分有价值的。
虽然这是一个已经成熟的方法,但是并没有过时。
与其它的化学或生物测试方法联合使用，还将进一步扩大它的应用前景。
三、实验目的和要求
⒈了解微核测试原理和毒理遗传学意义。
⒉学习蚕豆根尖的微核测试技术。
3.了解细胞微核形成的机理及其形态特征。
四、实验原理
微核（micronucleus,MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3～1/10，染色与主核一样或稍浅。
一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。
[5]
五、关键字：
蚕豆根尖细胞；微核检测；重铬酸钾；进出污水
六、实验材料和方法
6.1材料
松滋青皮蚕豆、显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液、重铬酸钾。
6.2方法
⑴浸种催芽：
择饱满、均匀的种子，洗净后用蒸馏水常规浸种、催芽24～30h，此期至少换水2次；待种子充分吸胀后，移入铺有干净、双层湿纱布的托盘内培养。
⑵用被检测液处理根尖：
当初生根长到2～3cm时，选初生根生长良好的蚕豆3～4粒，分别放入污水厂进口水、污水厂出口水、100倍原液稀释液、500倍原液稀释液、1000原液稀释液中染毒8～12h。
⑶根尖细胞恢复培养：
处理后的种子用蒸馏水（自来水）浸洗3次，每次2～3min；将处理液洗净后，置于湿棉花上恢复22～24h；同时均设蒸馏水处理为空白对照组。
以上温度均为25℃。
图1、六种水体处理蚕豆种子
⑷根尖细胞固定：
将恢复后的种子，从根尖顶端切下1～1.5cm长的幼根，用Carnoys固定液固定20～24h。
固定后的根如不及时制片，可换入70%的酒精溶液中置4℃冰箱中保存备用。
⑸酸解：
用蒸馏水浸洗固定好的幼根3次，每次5min，吸净蒸馏水，加入盐酸酒精解离液室温下酸解8-10min，幼根软化即可。
⑹染色：
吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1～2分钟。
最后浸于水中。
制片前取出置载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴1-2滴改良苯酚品红染液染色10～15min后，加上盖玻片，覆以吸水纸常规压片。
七、实验结果与讨论
7.1显微观察结果
图2、污水厂出口水处理图图3、污水厂进口水处理图
图4、自来水处理图（对照）图5、100倍原液稀释液
图6、500倍原液稀释液处理图图7、1000倍原液稀释液处理图
7.2数据统计处理结果与分析
在显微镜低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察微核。
每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测指标。
7.2.1.数据统计结果
表1、各种水体处理结果情况对照表
样品
微核数（个）
平均值（个）
千分率
污水出口
19
24
17
20
20‰
污水进口
25
31
34
30
30‰
100倍原液
34
30
28
30.6
30.6‰
500倍原液
13
14
16
14.3
14.3‰
1000倍原液
2
5
6
4.3
4.3‰
自来水（对照）
2
4
1
2.3
2.3‰
7.2.2.数据统计分析
Ⅰ、做方差齐性检验
表2.方差齐性检验
Levene统计量
df1
df2
显著性
1.421
5
12
.285
分析：
从表2可以看出显著性为0.285，其值大于0.05，说明了6种水体处理中的3组平数据比较平稳，偏离不大，即这3组数据可以用来进行数据的统计处理。
Ⅱ、均值图
图8、微核均值图
分析：
图中可以看出六中处理方法导致细胞微核形成的平均数呈曲线趋势，其中污水进口与100倍原液形成的微核数比较接近，不同倍数原液稀释液处理微核产生数有显著差异且呈下降趋势。
Ⅲ、方差分析
①、Duncan检验
表3.Duncan检验
range
N
alpha=0.05的子集
1
2
3
4
Duncana
自来水
3
2.3333
1000倍原液
3
4.3333
500倍原液
3
14.3333
污水出口
3
20.0000
污水进口
3
30.0000
100倍原液
3
30.6667
显著性
.423
1.000
1.000
.787
将显示同类子集中的组均值。
a.将使用调和均值样本大小=3.000。
分析：
图中可以看出，自来水与1000原液、污水进口与100原液之间没有显著差异，而500原液、污水出口、自来水与1000原液、污水进口与100原液这四组之间存在显著差异。
②、LSD检验
表4.多重比较
（I）range
（J）range
均值差（I-J）
标准误
显著性
95%置信区间
下限
上限
LSD
污水出口
污水进口
-10.00000*
2.41139
.001
-15.2540
-4.7460
100倍原液
-10.66667*
2.41139
.001
-15.9206
-5.4127
500倍原液
5.66667*
2.41139
.037
.4127
10.9206
1000倍原液
15.66667*
2.41139
.000
10.4127
20.9206
自来水
17.66667*
2.41139
.000
12.4127
22.9206
污水进口
污水出口
10.00000*
2.41139
.001
4.7460
15.2540
100倍原液
-.66667
2.41139
.787
-5.9206
4.5873
500倍原液
15.66667*
2.41139
.000
10.4127
20.9206
1000倍原液
25.66667*
2.41139
.000
20.4127
30.9206
自来水
27.66667*
2.41139
.000
22.4127
32.9206
100倍原液
污水出口
10.66667*
2.41139
.001
5.4127
15.9206
污水进口
.66667
2.41139
.787
-4.5873
5.9206
500倍原液
16.33333*
2.41139
.000
11.0794
21.5873
1000倍原液
26.33333*
2.41139
.000
21.0794
31.5873
自来水
28.33333*
2.41139
.000
23.0794
33.5873
500倍原液
污水出口
-5.66667*
2.41139
.037
-10.9206
-.4127
污水进口
-15.66667*
2.41139
.000
-20.9206
-10.4127
100倍原液
-16.33333*
2.41139
.000
-21.5873
-11.0794
1000倍原液
10.00000*
2.41139
.001
4.7460
15.2540
自来水
12.00000*
2.41139
.000
6.7460
17.2540
1000倍原液
污水出口
-15.66667*
2.41139
.000
-20.9206
-10.4127
污水进口
-25.66667*
2.41139
.000
-30.9206
-20.4127
100倍原液
-26.33333*
2.41139
.000
-31.5873
-21.0794
500倍原液
-10.00000*
2.41139
.001
-15.2540
-4.7460
自来水
2.00000
2.41139
.423
-3.2540
7.2540
自来水
污水出口
-17.66667*
2.41139
.000
-22.9206
-12.4127
污水进口
-27.66667*
2.41139
.000
-32.9206
-22.4127
100倍原液
-28.33333*
2.41139
.000
-33.5873
-23.0794
500倍原液
-12.00000*
2.41139
.000
-17.2540
-6.7460
1000倍原液
-2.00000
2.41139
.423
-7.2540
3.2540
*.均值差的显著性水平为0.05。
分析：
经过多重比较有利于比较6中处理方法中的任何一组与其他的5组之间进行对比。
体现之间的差异性。
从图可以看出污水出口与其余五组呈显著差异，污水进口与100原液不显著但与其余几组显著，500原液与其余五组都呈显著差异，1000倍原液与污水出口不显著但与其余几组显著。
结论：
通过①②两种检验方法综合可以看出：
污水进口与100原液对蚕豆微核的形成、污水出口与1000原液对蚕豆微核的形成没有显著差异，即水体污染程度相差不大；500原液、污水出口、自来水与1000原液、污水进口与100原液这四组之间存在显著差异即水体污染程度大小比较为污水进口与100原液>500原液>污水出口>自来水与1000原液。
[参考文献]
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1160一1164。
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（1）：
16‘18。
[3]段昌群，王焕校．重金属对蚕豆的细胞遗传学毒理作用和对蚕豆根尖微核技术的探讨[1][J]．植物学报，1995，37
（1）：
14-24。
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[5]王建波，方呈祥，遗传学实验教程[M]，武汉大学出版社，2004。
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11～12.
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