紫山药淀粉酶解工艺优化及动力学模型研究崔晋12马艳弘1黄开红1.docx

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紫山药淀粉酶解工艺优化及动力学模型研究崔晋12马艳弘1黄开红1

紫山药淀粉酶解工艺优化及动力学模型研究

崔晋,2马艳弘1黄开红1曹培杰2殷剑美3司卫东4

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；3.江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏南京210014；4.江苏博达生物科技有限公司，江苏徐州221723）

摘要：

以还原糖释放率（DE）为考察指标，考察酶添加量、pH值、温度、时间对紫山药淀粉酶解效果的影响，并采用响应面法对酶解过程中的工艺参数进行优化。

通过Lineweaver-Burk和Wilkinson统计法求解米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm），建立相应动力学模型。

结果表明，紫山药淀粉的最佳酶解工艺条件是α-淀粉酶添加量为23U/g，酶解温度75℃，酶解pH为5.5，酶解时间77min，在此条件下，DE值为27.17%；在pH5.5，75℃条件下，Vm=4.141mg/（mL·min），Km=4.329mg/mL，酶解动力学方程为：

=6.98[S]/（7.94+[S]），R2=0.9966。

关键词：

紫山药淀粉；酶解；响应面法；动力学

中图分类号：

TS231文献标识码：

A文章编号：

1003-0174（）--

CuiJin1,2MaYanhong1HuangKaihong1CaoPeijie2YinJianmei3SiWeidong4

（1.InstituteofAgriculturalProductsProcessing,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,Jiangsu,China;2.CollegeofFoodScienceandNutritionEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,Shanxi,China;3.InstituteofEconomicCrops,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,Jiangsu,China;4.JiangsuBodaBiotechnologyLtd.,Xuzhou221723,Jiangsu,China）

OptimizationofAmylaseProcessinPurpleYamandItsKineticsModeling

Abstract:

Theeffectofenzymedosage,pH,temperatureandtimeontheenzymatichydrolysisofpurpleyamstarchwasinvestigatedwiththereleaserateofreducingsugar（DE）astheindex.Theresponsesurfacemethodologywasusedtooptimizetheprocessparametersintheenzymolysisprocess.TheMichaelisMentenconstant（Km）andthemaximumreactionvelocity（Vm）werecalculatedbyLineweaver-BurkandWilkinsonstatisticalmethods,andthecorrespondingkineticmodelwasestablished.Theresultsshowedthattheoptimumenzymolysisconditionsofpurpleyamstarchisα-amylasecontentof23U/g,enzymolysistemperature75℃,enzymesolutionpH5.5,77min,enzymolysistimeunderthiscondition,DEvalueof27.17%.InpH5.5,undertheconditionof75℃,theVm=4.141mg/mL（min）,Km=4.329mg/mL,enzymekineticsequationis:

[S]=6.98/（7.94+[S]）,R2=0.9966.

Keywords:

Purpleyamstarch;Enzymatichydrolysis;Responsesurfacemethodology;Kinetics

紫山药（Dioscoreaalata）是薯蓣科（Dioscoreae）山药属（DioscoreaL.）一年生或多年生蔓生植物，又名参薯、脚板薯等，是我国重要的地方特色经济作物。

紫山药是近年来发现的一种药食同源植物，属于紫红肉山药品种，研究表明紫山药中主要的活性成分多糖含量高于其他品种[1-4]，花青素、矿质元素含量均较高[5-6]，因此具有很好的市场前景。

《本草纲目》记载紫山药具有补脾胃、益肺肾、消渴，可治气虚衰弱、慢性泄泻、虚劳咳嗽等病症，对虚弱、慢性肠胃炎、糖尿病等也有一定的疗效，长期服用可以抗病、强身[7]。

目前市场上紫山药产品比较单一，主要以鲜食或加工成紫山药粉为主，紫山药发酵饮料等高附加值产品鲜有报道。

因紫山药中含有大量的淀粉[8]，在制备紫山药发酵饮料、紫山药酒等产品的过程中，微生物不能直接利用淀粉，需要通过酶解技术将紫山药中的淀粉转化为可发酵的糖，才有利于微生物发酵。

可见采用淀粉酶解技术不仅有利于提高淀粉的水解率会使原料营养利用最大化、还有利于改善其口感、增强产品稳定性，提高紫山药中的花青素等生物活性的高效利用。

淀粉酶解是一个复杂的过程，会受到底物浓度、酶浓度、pH、反应温度与时间等因素的影响，应用米氏方程确定酶反应速度与底物浓度的动力学模型已应用于马铃薯、玉米、高粱、荞麦等淀粉的酶解[9-11]，但紫山药淀粉的酶解工艺及其动力学研究尚鲜见报道。

因此本研究以紫山药淀粉为材料，利用α-淀粉酶进行酶解，在单因素实验基础上利用响应面分析法对其酶解工艺进行优化，并对酶解动力学模型进行了研究，为紫山药淀粉的水解及其相关产品的开发提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

紫山药：

苏蓣1号，由江苏省农业科学院南京市六合实验基地提供。

α-淀粉酶（枯草杆菌，酶活力4000U/g，60~70℃）：

南京建安实业有限公司；碳酸氢钠、氢氧化钠：

沧州建宇化工有限公司；盐酸：

济南英出化工有限公司。

1.2主要仪器与设备

MJ-BL15U11破壁搅拌机：

广东美的电器制造有限公司；FE20pH计：

梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；LXJ-IIB离心机：

上海安亭科学仪器厂；D-8紫外分光光度计：

南京菲勒仪器有限公司。

1.3紫山药酶解实验

将新鲜紫山药清洗、切片后蒸30min，按料水比1：

4混合，打浆得紫山药浆液。

将紫山药样液调节pH，加入α-淀粉酶混匀后，水浴一定时间后取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温。

将样液进行离心，取稀释后的上清液进行还原糖的测定。

1.3.1单因素实验设计

在pH为6.5，温度65℃，时间90min条件下，考察不同α-淀粉酶添加量（10、15、20、25、30、35U/g）对还原糖释放率DE值的影响；在α-淀粉酶添加量25U/g,温度65℃，时间90min条件下，考察不同pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）对还原糖释放率DE值的影响；在α-淀粉酶添加量25U/g，pH为6.5，时间90min条件下，考察不同反应温度（45、55、65、75、85℃）对还原糖释放率DE值的影响；在α-淀粉酶添加量25U/g，pH为6.5，温度65℃条件下，考察不同酶解时间（30、50、70、90、110、130min）对还原糖释放率DE值的影响。

1.3.2响应面优化设计

根据单因素实验结果，采用Box-Behnken方案，以α-淀粉酶、pH、酶解温度、时间4个因素进行响应面实验，以DE为响应值，利用Design-Expert8.05软件优化酶解工艺参数。

因素水平表见表1。

表1Box-Behnken实验设计因素和水平编码表

因素水平

A（加酶量）/U·g-1

B（pH）

5.5

C（时间）/min

D（温度）/℃

1.4还原糖释放率DE值的测定

DE值是衡量紫山药酶解过程中淀粉的水解程度，即浆液中淀粉转化的还原糖占淀粉含量的百分率[12]，按照陈鹰等[13-14]的方法将紫山药淀粉进行酸水解，采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，按照下列公式

（1）计算DE值：

式中：

A：

酶解后还原糖含量B：

紫山药原有还原糖C：

酸水解后还原糖含量

1.5紫山药的α-淀粉酶酶解动力学实验

将新鲜紫山药清洗，切片后蒸30min，按原料水比2:

1、1:

2、1:

3、1:

4混合打浆，得到紫山药浆液，按照响应面所得最佳参数调节pH值，加入α-淀粉酶混匀，恒定温度酶解10min后立刻沸水浴灭活5min，离心后取上清液，按照下列公式

（2）计算还原糖释放量，参考高义霞[15-16]等的方法，按照公式（3）计算反应速率。

还原糖释放量（mg/mL）=酶解后测定值（mg/mL）－紫山药本身还原糖（mg/mL）

式中：

v为反应速率，mg/（mL·min）；m/V为还原糖质量浓度，mg/mL；t为反应时间，min。

1.6酶促反应动力学模型[15-16]

Michaelis和Menten根据快速平衡学说建立米氏方程。

Briggs和 Haldane用稳态代替快速平衡态，得到更合理的酶促反应动力学过程：

由于酶促反应的速度与Es的形成与分解直接相关所以在考察酶促反应速度时,必须同时考虑ES的形成速度与分解速度。

通过推导将米氏方程修正为：

线性化处理后得Lineweaver－Burk方程：

式中：

v为反应速度；Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数，Km为（K2+K3）/K1

2结果与分析

2.1不同α-淀粉酶添加量、pH、酶解温度、时间对DE值的影响

由图1可知，当酶添加量低于25U/g时，DE值随着酶添加量的增加而升高；当酶添加量大于25U/g时，DE值变化趋于平缓，由此说明酶添加量达到25U/g时，紫山药淀粉已经基本酶解完全，底物已经耗完，再增加酶用量对DE值的影响不大，考虑到经济效益和酶解效果，选择25U/g时为酶解的最佳酶添加量。

pH值影响酶分子构象的稳定性和极性基团的解离状态，从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力[15]。

由图1可知，在pH4.5~5.5范围内，DE值随着pH的上升而增加，pH大于5.5，DE值反而随着pH值的升高而下降。

因此，酶解的最适宜pH值为5.5。

由图1可知，在45~85℃范围之间，DE值随着酶解温度的升高呈现先增加后降低的趋势，在45~65℃范围内，DE值随温度升高而升高，当温度达到65℃时，DE值达最大；超过65℃，DE值开始随温度升高而有所下降。

可见，过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，这是因为温度过高会导致酶的失活从而造成催化作用完全丧失；同时作用温度越高，还原糖与氨基酸越容易发生氨基糖反应，还原糖之间也会发生焦糖化反应，造成糖分的直接损失。

因此65℃为紫山药淀粉的适宜酶解温度。

由图1可知，随着酶解时间的延长，酶与底物的接触和反应越来越充分，产生的还原糖释放率DE越来越高，当反应时间为70min时，DE值达最大；超过70min后，DE值变化逐渐下降。

因此，70min为紫山药淀粉最佳酶解时间。

图1不同α-淀粉酶添加量、pH、酶解温度、时间对DE值的影响

2.2响应面分析法优化工艺条件

2.2.1回归模型建立与方差分析

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，以DE为响应值，优化紫山药淀粉酶解的酶解工艺。

实验设计及结果见下表2。

以DE值为响应值（Y），利用DesignExpert8.05软件对表中数据进行了二次多元回归拟合，得到响应值Y对自变量的多元回归方程为：

Y=27.73-1.03A-1.39B+2.00C+1.97D+0.97AB-2.74AC-2.86AD-1.92BC+3.40BD+0.95CD-5.69A2-8.90B2-4.55C2-1.37D2。

表2响应面设计与实验结果

序号

加酶量（U/g）

时间（min）

温度（℃）

Y：

DE（%）

4.5

13.24

5.5

14.56

5.5

27.24

5.5

14.93

6.5

11.15

6.5

22.97

5.5

27.28

5.5

29.90

6.5

10.76

5.5

26.21

4.5

16.32

5.5

25.69

5.5

26.61

5.5

21.53

5.5

20.83

6.5

12.50

5.5

15.58

6.5

12.15

5.5

20.31

4.5

16.32

5.5

15.97

4.5

18.75

5.5

19.10

4.5

12.85

4.5

20.57

5.5

24.88

5.5

27.60

6.5

11.81

5.5

20.14

对模型方程进行显著性分析，由表3可知：

模型方程极显著（P<0.0001），失拟项不显著，实际实验值与预测值高度相关（R2=0.9942，R2Adj=0.9884），表明此模型与实验值拟合程度良好[17]，实验误差较小，可以用该模型对紫山药淀粉酶解工艺进行准确的分析预测。

由表3还可以得知：

4个自变量对DE值均有显著影响，其影响程度大小顺序为：

时间（C）＞温度（D）＞pH（B）＞加酶量（A）。

二次项A2、B2、C2对DE的影响极显著。

AB和CD的交互作用对响应值的影响不显著外，AC、AD、BC、BD的交互作用对响应值的影响均显著（P＜0.01或P＜0.05）。

表明4个因素均不同程度的对响应值产生影响，本实验设计的因素选择科学合理。

表3实验结果方差分析表

平方和

自由度

均方

F值

显著性

模型

929.37

66.38

29.53

<0.0001

A-加酶量

12.73

5.66

0.0321

B-pH

23.22

10.33

0.0062

C-时间

47.77

21.25

0.0004

D-温度

46.62

20.74

0.0005

3.73

1.66

0.2186

30.09

13.39

0.0026

32.82

14.60

0.0019

14.75

6.56

0.0226

46.22

20.56

0.0005

3.65

1.62

0.2235

210.32

93.57

<0.0001

514.13

228.73

<0.0001

134.52

59.85

<0.0001

12.24

5.44

0.0351

残差

31.47

2.25

失拟

25.03

2.50

1.56

0.3557

误差

6.43

1.61

总和

960.84

R2=0.9672R2Adj=0.9345

（注：

*表示0.05水平显著，**表示0.01水平显著。

）

2.2.2紫山药淀粉酶解响应面图分析与优化

绘制加酶量、酶解时间、pH和酶解温度4个变量之间交互作用的响应面图和等高线图，响应曲面图中的曲面的陡峭程度可以表明变量对DE的影响程度，曲面较陡峭表明影响较大，反之则较小；等高线图反映了因素间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著[18]。

通过响应面图分析：

加酶量和酶解时间、pH和酶解温度、加酶量和温度的交互作用的响应面坡度较陡，等高线均呈现椭圆、扁平状，上述因素之间的相互作用显著。

2.2.3最优提取工艺条件及验证实验

经软件分析得到紫山药淀粉酶解最优工艺为：

α-淀粉酶酶添加量为22.82U/g，pH为5.58，时间为76.87min，温度为75℃时，为了操作方便，修正最佳的提取条件为：

加酶量23U/g、pH5.5、时间为77min、温度为75℃，在这个条件下，进行3次平行实验，所得紫山药淀粉酶解得率平均值为27.17%。

实测值与预测值29.46%相对误差仅为2.29%，因此证明实验模型合理，实验结果理想。

2.3紫山药淀粉酶解动力学方程及参数求解

2.3.1Lineweaver-Buck法求解参数

在淀粉浓度较低时，酶未被底物饱和，反应速率与淀粉浓度呈正比关系，表现为一级反应;随后继续增大淀粉浓度，反应速率不再呈正比增加，表现为混合级反应;当淀粉浓度增至相当高时，淀粉浓度对反应速率影响变小，平衡时达到最大反应速率，表现为零级反应，这表明紫山药淀粉的酶解遵循米氏酶中间络合物学说，可用米氏方程进行拟合[19]。

求得Km=7.94mg/mL，Vm=6.98mg/（mLmin），方程为=6.98[S]/（7.94+[S]），R2=0.9966，方程极显著。

图2底物浓度与反应速率的关系

2.3.2Wilkinson统计法求解参数

Wilkinson统计法包括非线性二乘法求估算解和泰勒展开式求精校解两步。

2.3.2.1最小二乘法求估算解

由表4可知，Δ=αε﹣γδ=0.17303，Vm0=（βε﹣δ2）/=3.940mg/（mL·min），Km0=（βγ﹣αδ）/Δ=4.034mg/mL。

式中Vm0和Km0分别为最大反应速度和米氏常数估算值。

表4Wilkinson统计法求估算解

Tab.4CalculationofprovisionalVmaxandKmvaluesbytheWilkinsonmethod

[S]/（mg/mL）

V/（mg/mL⋅min）

X=v2

Y=v2/[S]

0.25

0.21708

0.04712

0.18850

0.01023

0.00222

0.04092

0.00888

0.03553

0.33

0.27750

0.07701

0.23335

0.02137

0.00593

0.06476

0.01797

0.05445

0.5

0.39025

0.15230

0.30460

0.05944

0.02319

0.11887

0.04639

0.09278

0.82406

0.67908

0.55960

0.46114

0.55960

0.46114

1.29299

1.67183

0.83592

2.16167

2.79503

1.08084

1.39751

0.69876

∑

2.81231

3.28752

1.86498

1.93190

1.34267

代号

2.3.2.2泰勒展开式求精校解

由表5可知，Δ=α''﹣γ'2=0.0033，b1=（''﹣''）/'=1.051，b2=（''﹣''）/'=0.309，求得精确解为Vm=Vm0b1=4.1413；Km=Km0+b2/b1=4.3284。

表5Wilkinson法精校解

Tab.5FineadjustmentofVmaxandKmvaluesbytheWilkinsonmethod

[S]

[S]+Km0

Vm0[S]

f'2

f'f

vf'

0.25

4.2844

0.9851

0.22993

-0.0537

0.0529

0.0029

-0.012

0.0499

-0.01165

0.33

4.3644

1.30033

0.29794

-0.0683

0.0888

0.0047

-0.02

0.0827

-0.018944

0.5

4.5344

1.9702

0.4345

-0.0958

0.1888

0.0092

-0.042

0.1696

-0.037395

5.0344

3.9404

0.7827

-0.1555

0.6126

0.0242

-0.122

0.645

-0.128116

6.0344

7.8808

1.30598

-0.2164

1.7056

0.0468

-0.283

1.6886

-0.279833

∑

2.6486

0.0877

-0.479

2.6358

-0.475938

代号

α'

β'

γ'

δ'

ε'

2.3.3Lineweaver－Buck法和Wilkinson统计法的比较

由表可知，Lineweaver-Buck法和

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