地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书.docx
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地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书
地高辛标记与检测DNA试剂盒
DIGDNALabelingandDetectionKit
采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。
此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，
可检测10×10cm2面积的杂交膜50张
指导手册
1前言
1.1内容表
1前言
1.1内容表
1.2试剂盒成分
2.介绍
2.1产品简介
3.操作步骤和所需材料
3.1在你开始前
3.2流程图
3.3地高辛标记DNA
3.4标记效率的确定
3.5DNA的转移和固定
3.6杂交
3.7免疫检测
3.8DNA印记的洗脱和再杂交
1.2试剂盒的成分
瓶号
标记
内容
包括功能
1
无标记对照DNA1
2
无标记对照DNA2
3
DNA稀释缓冲液
2管1mL
50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃
澄清溶液
4
DIG标记的对照DNA
20μL
5μg/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）
澄清溶液
用于确定标记效率
5
六聚核苷酸混合物
6
标记用混合物
7
DNA聚合酶1大片段
标记级
8
抗地高辛的碱性磷酸酶结合物
200μL
750U/mL
从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶
澄清溶液
9
NBT/BCIP
10
封阻试剂
附加仪器与所需试剂
除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
在每个操作程序的前面提供了详细的信息。
操作程序
仪器设备
试剂
3.3DIG-DNA标记
水浴
灭菌的双蒸水
0.2MpH8.0灭菌的EDTA
3.4标记效率的半定量
带正电荷的尼龙膜*
地高辛洗涤和封阻缓冲组合*
TE缓冲液
或者
洗涤缓冲液
马来酸缓冲液
检测缓冲液
3.5DNA转移和固定
紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备
2×SSC
或者10×SSC
3.6杂交
尼龙膜，带正电荷*
杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉）
注意：
当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
DIGEasyHyb
（杂交缓冲液，需单独购买）
3.7免疫检测
耐热的塑料袋或者滚筒瓶
杂交袋*
地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液
或者
洗涤缓冲液
马来酸缓冲液
检测缓冲液
3.8DNA斑点的脱色和重新标记探针
大的托盘
水浴
DMF
0.2MNaOH，0.1%SDS
2×SSC
*标记的产品可以从RocheAppliedScience获得。
2.介绍
2.1产品概况
实验原则
此试剂盒采用DIG（地高辛），一种甾类半抗原，steroidhapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。
步骤
描述
DNA标记
根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。
地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。
杂交
根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。
采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。
免疫检测
杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后采用即时可用的化学发光底物NBT/BCIP可以看到杂交结果。
应用
地高辛标记DNA探针可以用于：
所有类型的滤膜杂交
样品材料
至少100bp的DNA片段
线性的质粒，cos质粒或者DNA
超螺旋的DNA
实验时间
步骤
反应时间
DNA标记
1h-O/N
杂交
6horO/N
免疫检测
1.5h
显色
0.5-16h
检测数量
一个试剂盒足够用于:
25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg；
并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。
质量控制
根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA【pBR328】进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg同源DNA点在膜上16h后成色显影检测。
试剂盒的储存和稳定性
未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。
在干冰中运输。
一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。
试剂盒成分
储存条件
抗地高辛碱性磷酸酶结合物（8号管）
2-8℃稳定。
NBT/BCIP
（9号管）
2-8℃，避光保存
或者15-25℃保存4周
封阻液（10号管）
未开封时，2-8℃或者15-25℃稳定；
一旦开封，应分装并储存在-15℃到-25℃或者无菌条件下2-8℃间可以稳定保存1个月；
工作溶液都应是新鲜配制的
灵敏度和特异性
采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。
3．实验步骤和所需材料
3.1在你开始前
主要的操作要求
此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：
要求
指引
在清洁的条件下进行操作
高压灭菌地高辛系统的试剂
过滤灭菌的溶液包括：
SDS,吐温20，并应该加入到已灭菌的溶液中。
用干净的孵育托盘
每次使用前都要严格地清洗实验托盘
处理膜的要求
带无粉手套
处理膜的时候，只能够用干净的镊子夹膜的边缘
3.2流程图
3.3部分
地高辛标记DNA
↓
3.4部分
标记效率的检测
↓
3.5部分
DNA固定
↓
3.6部分
杂交
↓
3.7部分
免疫检测
↓
3.8部分
洗脱和DNA斑点与另一探针的杂交
3.3地高辛标记DNA
介绍
随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5×浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。
附加设备和所需试剂
水浴
冰水混合物
此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。
溶液
成分
储存条件/稳定性
用途
水
高压灭菌的双蒸水
15-25℃，稳定
稀释DNA
EDTA（乙二胺四乙酸）
0.2MEDTA,pH8.0
15-25℃，稳定
终止标记反应
模板DNA：
模板DNA所需特征：
特征
详细信息
纯度
模板DNA应该采用theHighPurePlasmidIsolationKit进行制备。
当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时，我们建议额外进行一次苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋白质。
在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用，那么此步骤也是需要进行的。
大小
为了获得理想的结果，模板DNA应该线性化，且大小应该在100-10000bp以上。
如果模板DNA大于10kb，那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如HaeⅢ）对模板进行酶解。
数量
上面步骤描述原则上10ng-3μg的模板均可以标记上，然而请仔细查看在给定的表中，用于你的杂交实验所需的探针。
可以根据提供的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。
如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的模板DNA用量至少300ng（探针浓度：
25ng/mL杂交液）。
标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA
如果你想要完成基因组的southern杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。
为了从凝胶中分离DNA,你可以用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒（theAgaroseGelDNAExtractionKit）进行大小在400bp-5kbp范围内DNA片段的回收。
这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。
然后，不需要进一步纯化即可对DNA片段进行高效的地高辛标记。
然后标记好的探针应该用高效的PCR产物纯化试剂盒（HighPurePCRProductPurificationKit）进行纯化，以去除残留的琼脂糖颗粒。
步骤
此步骤用于标记10ng-3μgDNA。
可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA（最高达10μg）。
步骤
操作
1
向一个反应管仲中加入10ng-3μg模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达15μl；作为对照，向另一管中加入5μl无标记对照DNA（Vial2）和高压灭菌水，终体积达15μl
2
沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中
注意：
完全变性对于标记的有效性是十分重要的
3
加入以下试剂到变性探针或对照DNA中：
试剂
体积
Vial5
2μL
Vial6
2μL
Vial7
1μL
充分混合并简单离心；
37℃孵育1小时或者过夜
注意：
较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记DNA的产量
4
加入2μL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65℃加热10分钟终止反应
注意：
采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长度
标记反应的产量
表1：
此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。
在标准反应中每个实验采用1μgDNA作为模板。
1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。
20小时后消耗了大约38%的核苷酸。
模板DNA
1h
20h
10ng
15ng
50ng
30ng
30ng
120ng
100ng
60ng
260ng
300ng
120ng
500ng
1000ng
260ng
780ng
3000ng
530ng
890ng
使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。
地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实（10个独立标记实验的平均值）。
3.4标记效率的确定
介绍
地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。
在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。
实验原则
检测标记探针质量的好方法是直接检测法。
步骤
描述
1
将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上；
尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（Vial4）作为标准。
2
采用anti-DIG-AP结合物（Vial8）和随时即用的NBT/BCIP对尼龙膜进行免疫检测。
比较地高辛标记DNA与对照DNA的一系列稀释点的强度确定标记效率。
所需附加溶液的制备
请找出下表中的成分和所需制备的试剂。
下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。
溶液
成分/制备
储存/稳定性
用途
洗涤缓冲液
0.1M马来酸
0.15MNaCl
pH7.5（20℃）
0.3%（v/v）Tween20
15-25℃,稳定
去除未结合的抗体
马来酸缓冲液
0.1M马来酸
0.15MNaCl
用NaOH（固体）调节pH值到7.5（20℃）
15-25℃,稳定
封阻液的稀释
检测缓冲液
0.1MTris-HCl
0.1MNaCl
pH9.5（20℃）
15-25℃,稳定
调整pH值到9.5
TE缓冲液
10mMTris-HCl
1mMEDTA
pH8.0
15-25℃,稳定
终止颜色反应
试剂盒工作溶液的制备
下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：
溶液
成分/制备方法
储存/稳定性
用途
封阻溶液
用马来酸缓冲液按照1：
10的比例将10×封阻液（10号瓶按体积比10%溶解）稀释成1×工作溶液
一直新鲜制备
封阻膜上非特异结合位点
抗体溶液
每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP（8号管）10000rpm离心5分钟。
然后从表面小心吸取所需用量。
用封阻溶液按照1：
5000（150mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP
2-8℃，12h
与地高辛标记的探针结合
底物显色液
取40μLNBT/BCIP（9号管）
于2ml检测缓冲液中混匀
注意：
避光保存
即配即用
稀释系列
根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（Vial4）应该稀释到1ng/μL。
利用第3.3章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。
产量取决于起始时的模板量和孵育时间。
注意：
表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。
按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照DNA进行一系列的梯度稀释。
管
DNA
（μL）
来自于管#
DNA稀释缓冲液（3号管）
（μL）
稀释比例
终浓度
1
稀释的原液
1ng/μL
2
5
1
495
1：
100
10pg/μL
3
15
2
35
1：
3.3
3pg/μL
4
5
2
45
1：
10
1pg/μL
5
5
3
45
1：
10
0.3pg/μL
6
5
4
45
1：
10
0.1pg/μL
7
5
5
45
1：
10
0.03pg/μL
8
5
6
45
1：
10
0.01pg/μL
9
0
-
50
-
0
操作步骤
下面的步骤描述的是直接检测。
注意：
在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。
步骤
操作
1
分别从你标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1μL点在尼龙膜上
2
通过紫外交联或者120℃烘烤30分钟的方法将核酸固定在膜上
3
将膜转移到一个装有20mL马来酸缓冲液的塑料容器中
在15-25℃中振荡孵育2分钟
4
在10mL封阻液中孵育30分钟
5
在10mL抗体溶液中孵育30分钟
6
用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟
7
在10mL检测缓冲液中平衡2-5分钟
8
将膜上带有DNA的一面朝上，放入盛有2ml底物显色液的盒子中，避光，15-25℃中孵育5分钟。
注意：
不能摇动；可适当打开盒子观察染色情况
9
待显色到适合的效果后用TE缓冲液洗膜5min，扫描
结果分析
比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记DNA的量。
如果你的探针稀释后量达0.1pg的点与对照DNA的点均可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度。
3.5DNA的转移和固定
转移方法和膜
凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。
胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题。
所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验；
在实验中，在20×SSC中采用毛细管转移的方法将DNA转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。
注意：
碱性转移（如在0.4MNaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker的转移。
固定操作
将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用
那么
紫外交联的方法
（尼龙膜）
将膜放到已经用10×SSC浸透的Whatman3MM滤纸上。
洗涤之前用紫外交联这块湿润的膜
紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后自然晾干。
120℃，烘烤（尼龙膜）
在2×SSC简单的洗涤一下膜
将尼龙膜放在120℃下烘烤30分钟或者根据操作说明的要求进行操作。
80℃，烘烤（尼龙膜）
在2×SSC简单的洗涤一下膜
将尼龙膜放在80℃下真空烘烤2小时
膜的储存
请根据下表选择膜的储存方法。
如果
那么
你想继续实验
立即将这个膜进行预杂交
如果你想稍后进行实验
那么将干燥的膜储存于2-8℃
3.6杂交
需要的附加设备DIGEASYHyb
冰水浴
震荡水浴
或杂交炉
耐高温的塑料或者玻璃盒，培养皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋
注意：
不要用敞口的容器盛放杂交缓冲液
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：
Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）{I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算}
Topt.=Tm-（20～25℃）
这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。
用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt.要比计算出的Tm低20-25℃。
Topt.可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。
当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。
操作步骤请参照下表进行实验。
步骤
操作
1
将适量体积的杂交缓冲液（DIGEASYHyb）提前预热到杂交温度（37-42℃）。
在适当的容器中温和振荡30分钟进行预杂交。
注意：
膜应该自由的移动。
尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。
2
变性地高辛标记的DNA探针：
（在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL）将探针放入沸水浴中煮5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。
注意：
因为DIG-11-dUTP是碱标记的，因此DNA探针不能用碱处理（NaOH）的方法变性。
3
将变性的地高辛标记探针加入到预热的地高辛杂交缓冲液（每100cm2的膜加入3.5mL杂交缓冲液）中，充分混合但要避免产生泡沫（气泡容易产生背景）
4
倒出预杂交液，向膜上加入探针杂交液的混合物；
温和振荡孵育4小时或延长孵育至过夜
杂交液的储存
含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25℃，可以反复使用几次，在每次使用前需要68℃新鲜变性10分钟。
注意：
不可以将杂交液煮沸。
严谨洗涤
对于大部分DNA:
DNA应用,用0.5×SSC进行严谨洗涤已经足够。
针对每个探针来说，正确的洗涤条件应该依据经验来确定。
对于人基因组DNA，采用的条件是0.5×SSC，65℃。
探针长度大于150bp且GC含量高时，应在68℃下进行洗涤。
对于长度为100bp或更短的探针，洗涤温度应该降低。
此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。
步骤
操作
1
用足够的2×SSC，0.1%SDS连续振荡洗涤两次，每次5分钟。
2
在65-68℃，用足够的0.5×SSC，0.1%SDS（提前预热到洗涤温度）连续振荡洗涤两次，每次15分钟。
3.7免疫检测
需要附加的试剂
请找出下表中的成分和所需制备的试剂。
下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。
溶液
成分/制备
储存/稳定性
用途
洗涤缓冲液
0.1M马来酸
0.15MNaCl
pH7.5（20℃）
0.3%（v/v）Tween20
15-25℃,稳定
去除未结合的抗体
马来酸缓冲液
0.1M马来酸
0.15MNaCl
用NaOH（固体）调节pH值到7.5（20℃）
15-25℃,稳定
封阻液的稀释
检测缓冲液
0.1MTris-HCl
0.1MNaCl
pH9.5（20℃）
15-25℃,稳定
调整pH值到9.5
TE缓冲液
10mMTris-HCl
1mMEDTA
pH8.0
15-25℃,稳定
终止颜色反应
试剂盒工作溶液的制备
下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：
溶液
成分/制备方法
储存/稳定性
用途
封阻溶液
用马来酸缓冲液按照1：
10的比例将10×封阻液（10号瓶按体积比10%溶解）稀释成1×工作溶液
一直新鲜制备
封阻膜上非特异结合位点
抗体溶液
每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP（8号管）10000rpm离心5分钟。
然后从表面小心吸取所需用量。
用封阻溶液按照1：
5000（150mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP
2-8℃，12h
与地高辛标记的探针结合
底物显色液
取40μLNBT/BCIP（9号管）
于2ml检测缓冲液中混匀
注意：
避光保存
即配即用
操作步骤
此表描述了完成一张100cm2膜的免疫检测方法。
注意：
所有的孵育均是在15-25℃下，振荡完成的。
如果膜还需要再次与探针杂交，那么任何时候都不要让膜干。
步骤
操作
1
杂交和严谨洗涤后，将膜简单的用洗涤缓冲液冲洗1-5分钟
2
在100mL封阻液中孵育30分钟
3
在20mL抗体溶液中孵育30分钟
4
用100mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟
5
在20mL检测缓冲液中平衡2-5分钟
6
将膜上带有DNA的一面朝上，放入盛有10ml底物显色液的盒子中，避光，15-25℃中孵育5分钟
注意：
不能摇动；颜色可在数分钟内显现，持续16h；可适当打开盒子观察染色情况
7
待显色到适合的效果后用50mlTE缓冲液洗膜5min，扫描
3.8DNA印记的洗脱和再次探针杂交
主要信息印记中的碱性标记形式的DIG-11-dUTP能够更容易更有效的被洗脱，以用于再一次的杂交实验。
所需附加的仪器和试剂
DMF
2×SSC
0.2NNaOH,0.1%SDS
操作步骤
此操作描述的是膜的洗脱。
注意：
如果计划印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能干。
步骤
操作
1
用大烧杯水浴加热DMF到50-60℃
将膜放入其中直到蓝色颗粒从膜上脱落
双蒸水充分洗涤
2
在37℃条件下，用含有0.1%SDS的0.2MNaOH洗涤两次，每次20分钟，以去除地高辛标记的探针
3
用2×SSC充分洗涤5分钟
4
空气中干燥或用另一个探针进行预杂交和杂交
洗脱后的膜需要的储存条件
一旦膜被洗脱，可以将膜放在马来酸缓冲液中或者2×SSC中准备再用。
5附录
20×SSC
成分及终浓度
配制1L溶液各成分的用量
300mmol/L柠檬酸三钠（二水）
3mol/L氯化钠
水
88.2g
175.3g
补足1L
溶解柠檬酸三钠（二水）和氯化钠于约0.9L水中，调pH为7.0，用水补足体积至1L。
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