体内药物分析实验.docx

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体内药物分析实验

1.体内药物分析实验

1.1目的要求

1.把握血浆样品的前处理方法。

2.熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评判。

3.熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评判内容。

1.2要紧实验材料与仪器

山奈酚（Kaempferol）及其对比品，黄苓素（baicalein）,抗坏血酸，肝素，卜葡萄糖醛酸苜酶（p-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase）,分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙瞇，色谱纯乙膳；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min台式离心机，不同规格移液枪（5,20,50,100,200,1000pL）和容量瓶（10,25mL）,5〜10mL

1.3实验原理

山奈酚吸取进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苗和硫酸酯的形式存在。

由于山奈酚葡萄糖醛酸苗和硫酸酯的对比品难以获得，故采纳加入硫酸酯和葡醛酸甘水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苛元山奈酚的浓度。

实验以黄苓素为内标，HPLC法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评判。

1.4实验方法

1.色谱条件：

Ci8柱（250mmx4.6mm,5pm）,配爱护柱，柱温40°C；乙㈱0.5%冰醋酸（35:

65）为流淌相，流速ImL/min；检测波长370nm；进样量20pL°

2.溶液配制：

取山奈酚对比品约2.5mg,周密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。

周密吸取适量，分不用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20和30pg/mL的标准系列溶液，置4°C冰箱储存。

另取黄苓素适量，周密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL的溶液，周密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，得内标溶液，置4°C冰箱储存。

3•血浆样品处理:

取大鼠血浆样品120|.iL,加入甲醇20叫1%冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32肛、卜葡萄糖醛酸苗酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50卩L,37°C水浴温育30min后,加入内标溶液50pL,然后加无水乙瞇2mL,漩涡混合5min,于12000r/min离心5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用lOO^L甲醇复溶，12000i7min离心5min,取上清液进样分析。

4.专属性考察：

取空口血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品，按“血浆样处理"项下方法处理，照“色谱条件”项下方法进样测定。

比较所得色谱图，考察血浆内源性物质是否干扰测定，药物及内标是否达到基线分离。

若有必要，适当调整色谱条件，己达到专属性要求。

5.标准曲线制备：

周密吸取120pL大鼠空白血浆9份，分不加入20pL不同浓度的标准系列溶液，制得0.0（空白）、0.0（空白+内标）、0.05、0.1、0.5、1.5、3和5gg/mL的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度点平行3~5份）。

按“血浆样品处理”项下自“加1%冰醋酸32pL”起，同法处理后进样分析，记录峰面积。

以山奈酚与内标峰面积的比值

（R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回来（两个空白不计入回来曲线，仅作为对干扰的考察），求得回来方程（R=bC+a）和相关系数

（r）。

并取各浓度点实测值代入回来方程得回来值（C）,与标示值（C）比较，运算偏差（偏差%=£z£xioo%）和准确度（准确度=C7Cxl00%）o依照上述结果确定线性范畴与定量下限（LLOQ）o

6.回收率和周密度试验：

周密吸取120pL大鼠空白血浆，分不加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制低、中、高（0.1、1、4pg/mL）三种浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，按“标准曲线制备”项下方法进行处理、测定。

将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线,求出测得浓度。

运算测得浓度与加入浓度的比值，得方法回收率，并运算各浓度点的相对标准差（RSD）,作为日间周密度；于不同日（至少3d）重复上述测定，运算日间周密度。

7.萃取回收率试验：

周密吸取120吐大鼠空白血浆，分不加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制0.1,1和4卩g/mL浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，按“标准曲线制备”项下方法进行处理，记录山奈酚峰和内标峰而积，作为萃取后的测定值。

另取上述低、中、高同样浓度的山奈酚甲醇液，加同样量内标溶液，混合，直截了当于氮气流下挥干，残留物用lOOgL甲醇复溶，12000r/min离心5min,取同样量上清液进样分析，获得山奈酚峰和内标峰面积，作为未萃取的测定值。

采纳外标法运算萃取后山奈酚峰而积与相应浓度的未经萃取的山奈酚峰而积比值，得山奈酚萃取回收率；同法运算内标的萃取回收率。

8.稳固性实验：

周密吸取120pL大鼠空白血浆，按“回收率和周密度试验''项下方法配低、中、高浓度的山奈酚血浆样品。

考察其在室温下放置24h（6,12,24h取样）、-20°C下长期冻存1个月（10,20,30d取样）、反复冻融（-20°C—室温）3次的稳固性，将测得结果与0时的结果进行比较，运算RSDo并考察测定溶液的稳固性，即样品制备后到进样分析的放置时刻（6,12,24,36,48h）的稳固性。

9.血浆样品测定：

将山奈酚按lmg/kg的剂量尾静脉给予禁食12h的SD大鼠，于给药前（Omin）和给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240min分不从眼眶采0.4mL血，8000r/min离心5min,分离血浆。

按“血浆处理方法”项下方法处理后，在HPLC上进样分析，记录峰而积。

将山奈酚与内标峰而积比值代入标准曲线,运算血浆中山奈酚的浓度，绘制药-时曲线。

1.5注意事项

1.山奈酚和内标多为多疑基化合物，对光、热不稳固，测定时应注意避光操作。

2.大鼠眼眶采血容易操纵采血的时刻周期，采血质量高，而且不受是否尾静脉注射给药的阻碍，故这种采血方法相对优于尾静脉注射。

3.当线性范畴较宽时，宜采纳加权最小二乘法进行回来运算，以使低浓度结果较正确。

LLOQ偏离标准浓度应三20%，其他各点偏离标准浓度应三15%,「M0.09.山奈酚和内标的萃取回收率应接近，差异不超过±10%。

1.6参考文献

田杨,蒋学华，杨平，等.HPLC测定大鼠血浆中山奈酚.华西药学杂志,2018,23（3）:

357.

2HPLGM5US法测定人尿中左氧氟沙星浓度

2.1目的要求

1•把握尿样测定的前处理方法。

2.把握LC-MS测定中基质效应和专属性的考察方法。

3.熟悉LC-MS分析中质谱条件的选择。

2.2要紧实验材料与仪器

盐酸左氧氟沙星胶囊（O.lg或0.2g）,左氧弑沙星（levofloxacin）和环丙沙星（ciprofloxacin）对比品，色谱纯甲醇、甲酸，分析纯醋酸彼；液相色谱■质谱联用仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，不同规格移液枪（5,20,50,100,200,1000pL）和容量瓶（10,25mL）,10ml具塞离心管若干。

2.3实验原理

以环丙沙星为内标，建立尿中左氧氟沙星的LC-MS/MS测定方法，着重考察方法的专属性和基质效应，选择最佳色-质条件。

质谱测定方法采纳多反应离子监测（MRM）方式。

2.4实验方法

1.色谱和质谱条件:

色谱柱为C]8柱（100mmx2.1mm,3.5pm）；甲g?

-lmmol/L醋酸镀溶液-甲酸（35：

65：

0.01）为流淌相，流速0.25mL/min；进样量IO^iLo电喷雾（ESI）离子源，正离子电离模式，多反应离子监测（MRM）的MS扫描方式，左氧氟沙星和内标环丙沙星的检测离子对划分不为362.2—318.2和332.2—288.20（m/z）；MS参数:

毛细管电压5.5kV,加热温度400°Co

2.标准溶液配制：

取约5mg左氧氟沙星对比品，周密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，周密吸取适量，用甲醇分不稀释成5、10、25、50、100、150、250和500pg/mL的标准系列溶液，置4°C冰箱储存。

取5mg环丙沙星，周密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。

取适量用甲醇稀释成200pg/mL,即得内标溶液,置4°C冰箱储存。

3.尿样处理：

取ImL人尿液样品，加入lOyL内标溶液，再加入2mL水（依照实测浓度调整稀释倍数，同时考察调整后的基质效应），混匀，用0.45pm孔径的偏氟膜过滤，取10pL滤液进样分析。

4.专属性考察：

取人空白尿样、添加左氧氟沙星和内标的空口尿样、健康受试者口服盐酸左氧氟沙星胶囊后的尿样（加内标），按“尿样处理”项下自“再加入2mL水”起，依法处理后，在选定的条件下进样分析，比较三者图谱，考察方法专属性。

必要时对色谱、质谱条件作适当调整。

5.基质效应的评判：

取人空白尿液l.OmL,加入2.0mL水，混匀，用0.45pm孔径的偏氟膜过滤得滤液。

在滤液中分不加入不同浓度的左氧氟沙星标准溶液，使其终浓度分不为0.5,1.5和4pg/mL每浓度点平行3份。

另用纯水代替空白尿液，同法操作。

将上述溶液分不进样测定，获得相应的峰面积。

以同浓度下两种不同处理方法的样品峰而积（A外水）的比值来评判基质效应。

6.标准曲线制备：

周密量取不同浓度的标准系列溶液10yL,置氮气流下挥干，周密加入人空白尿液l.OmL,漩涡混合，制成浓度分不为0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5和5pg/mL的氧氟沙星尿液标准溶液，每浓度点平行2份。

按“尿样处理”项下方法处理后，进样分析，记录峰面积。

以左氧氟沙星与内标峰而积的比值对左氧氟沙星尿样浓度进行线性回来，得回来方程。

7.尿液样品的测定：

健康男性理想者单剂量口服0」〜0.2g盐酸左氧氟沙星胶囊，在服药前和服药后不同时刻段收集尿液，记录体积。

按“尿样处理"项下方法处理后，进样分析，记录峰面积。

将左氧氟沙星与内标的峰而积比值代入标准曲线，运算尿药浓度。

2.5注意事项

1.尿液要紧成分是水、尿素、盐类，易长细菌，宜4°C冷藏或加防腐剂。

2.左氧氣沙星要紧以原型自肾排泄，在体内代谢甚少。

口服48h内尿中排出量约为给药量的80%~90%。

尿中浓度随给药量变化而变化，尿中达峰时刻约为2h,可先进行预试，依照尿中实际浓度，调整尿液稀释倍数。

3.不同型号的LC-MS仪、色谱柱，测定条件可能有较大差异，需要进行优化。

2.6参考文献

施爱明，潘杰，张全英，等.LC-MS/MS法测定人血浆中左氧氟沙星浓度.药学进展，2018,32（5）:

228.

3GC-MS法测定大鼠肝脏组织中盐酸克伦特罗浓度

3.1目的要求

1•把握固相萃取法的原理和方法。

2.熟悉组织样品的前处理方法。

3.熟悉GC-MS质谱条件的选择。

3.2要紧实验器材与仪器

盐酸克伦特罗（clenbuterolhydrochloride）样品和对比品，分析纯双甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）,甲醇、甲苯、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠等。

GC-MS联用仪、涡旋混合器、恒温干燥箱、高速冷冻离心机、组织匀浆机、阳离子交换萃取小柱。

SD大鼠（180~220g）。

盐酸克伦特罗

3.3实验原理

利用盐酸克伦特罗的碱性，采纳碳酸钠碱性条件下使盐酸克伦特罗游离，用有机溶剂乙酸乙酯萃取。

然后在有机相中加入稀盐酸酸化,使克伦特罗离子化而溶于酸水中，进一步采纳阳离子交换固相小柱去除杂质。

再与BSTFA衍生化，用GC-MS进行检测。

3.4实验方法

1.色谱和质谱条件：

GC色谱柱为HP-5MS毛细管柱（30mx0.25mmx0.25pm）；程序升温：

初始柱温70°C（保持lmin）,以20°C/iiiiii升至180°C（保持lmin）,以5°C/iiiin升至220°C（保持2min）,以25°C/inin升至260°C（保持2min）；进样口温度280°C；不分流进样，进样量l.OpL；载气高纯He：

l.OniLdiiiiioEI源，源温度200°C；传输线温度280°C；电离电压为70eV；四级杆温度160°C；测定方式为全扫描和选择离子检测，条件如下：

0~3.5min为溶剂延迟时刻,3.5~15.0min,全扫描范畴（m/z50~400）,监测离子（m/z86）,15.Omin〜最后，关闭灯丝。

2.标准溶液的配制：

周密称取lOmg盐酸克伦特罗于lOOmL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得盐酸克伦特罗标准储备液。

然后用甲醇配制0.5、1、5、15、50和200pg4nL浓度系列的标准溶液。

3.组织样品的处理

（1）稀酸提取：

取大鼠肝脏约lg,周密称定，加水5mL,匀浆,在匀浆液中加入20mL乙酸乙酯（定量转移至50mL离心管中），再加入15%碳酸钠溶液2mL,超声15min后，于高速冷冻离心机上以6000r/min离心5min,收集上层有机相，再加入10mL乙酸乙酯于离心管中，超声提取15min后，收集合并有机相。

在收集的有机相中加入0.2mol/L的稀盐酸溶液2mL,旋涡混合后，于5000r/min离心5min,吸取下层水相，重复萃取一次，合并两次萃取的水相，用稀NaOH溶液调剂pH至5.5。

（2）阳离子交换萃取小柱净化:

将阳离子交换小柱依次通过5mL甲醇、5mL水和5mL20mmol/L稀盐酸活化，然后将处理好的稀酸提取液上样至小柱，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗柱子，抽干小柱,再用5mL5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液5mL的刻度试管中。

（3）衍生化：

洗脱液与50°C水浴氮气流下吹干，周密加入200yL的甲苯和lOOpL的BSTFA,充分旋涡混合30s,在80°C的烘箱中加热衍生lh（反应容器加盖盖紧）。

衍生完毕待冷却后转移入进样品中，进行GC-MS检测。

4.标准曲线的制备：

分不取大鼠空白肝脏lg,加水5mL,匀浆,在匀浆液中分不加入不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液10pL,使匀浆液中终浓度分不为5,10,50,150,500和2000ng/g组织，混匀。

照“组织样品处理''项下自“在匀浆中加入20mL乙酸乙酯”起，依法进行稀酸提取、阳离子交换萃取小柱净化和衍生化处理，GC-MS测定。

以盐酸克伦特罗浓度对相应的峰而积进行线性回来，获得标准曲线。

5.样品测定：

取盐酸克伦特罗样品，按50pg/kg给药剂量灌胃给予SD大鼠。

在给药后lh,处死大鼠。

肝脏以生理盐水灌流，并用滤纸吸干水分。

周密称取肝组织lg,按“组织样品处理''项下方法进行测定。

将获得的峰面积代入标准曲线，运算肝组织中盐酸克伦特罗的浓度。

3.5注意事项

固相萃取小柱使用前需要进行活化，一样先用甲醇，再用水冲洗。

关于阳离子或阴离子交换小柱还需用酸或碱进一步活化。

3.6参考文献

[1]王红.气相色谱■质谱法检测动物肝脏组织中盐酸克伦特罗.中国卫生检验杂志，2007,17（8）:

1409.

[2]吴银良，李晓薇，杨挺，等.气相色谱-质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺.分析化学，2006,34（8）:

1083.

4•原子吸取分光光度法测定头发中锌含量

4.1目的要求1•把握消化法处理生物样品的方法。

2.熟悉原子吸取分光光度法检测原理和方法。

4.2要紧实验材料与仪器

色谱纯锌，优质纯硝酸，分析纯盐酸、高氯酸、氨水。

原子吸取分光光度计、锌空心阴极灯、电热板

4.3实验原理

采纳硝酸-高氯酸对头发进行消解处理，使微量锌以金属离子状态转入溶液溶液，用原子吸取分光光度法测定。

样品溶液进入火焰后,待测元素的基态原子吸取来自同种元素空心阴极灯发射的共振线，其吸取强度在一定范畴内与待测元素浓度成正比，采纳标准曲线法进行定量。

4.4实验方法

1.仪器参数：

检测波长213.9nm；光谱通带0.4~0.8nm；灯电流3~4mA；空气流量5~6L/min；乙烘流量lL/min；火焰高度6~12mm°

2.锌标准溶液的制备：

取金属锌lg,周密称定，置200mL烧杯中，加入6mol/L盐酸溶液30〜40mL,使锌溶液，待溶解完全后，加热煮沸数分钟，冷却，定量转移至1000mL量瓶中，用蒸镭水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为lmg/mL的锌标准储备液；周密移取10mL锌储备液于100mL量瓶中，用蒸镭水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为lOOyg/mL的锌标准溶液；周密移取10mL锌标准溶液于100mL量瓶中，用蒸憎水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为10pg/mL的锌标准溶液。

3.样品处理

（1）发样洗涤：

取头发0.3g左右，用剪刀剪成l~2cm的小段，置50mL烧杯中，用5%氨水（pH置8.0~8.5）浸泡30min,用自来水漂洗3~4次，再用二次去离子水冲洗4~5次，置于65°C烘箱中干燥4h,取出后放入干燥器中储存备用。

（2）消化处理：

取通过洗涤处理的头发0.2g,周密称定，置于lOOmL烧杯中，加入5mL浓硝酸，盖上表而皿，在电热板上加热消解，待完全溶解后取下，冷却至室温，加入高氯酸lmL,再在电热板上连续加热，冒白烟至溶液剩余l~2mL时（切不可蒸干）取下，冷却后加入适量蒸镭水，定量转移至lOOmL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀待测。

同时按相同步骤制备1份空白溶液。

4.标准曲线的制备：

周密吸取浓度为10Mg/niL的锌标准溶液0,2,4,6,8,10mL,分不置于6个lOOmL量瓶中，用1%高氯酸溶液稀释至刻度，摇匀。

于213.9nm波长下测定吸光度值，以浓度对吸光度值做线性回来，获得标准曲线。

5.样品测定：

取头发适量（3份），按“样品处理”项下方法操作,照标准曲线测定条件测定样品溶液的吸光度，将测得的吸光度值代入标准曲线，运算供试液中锌浓度，并依照头发取样量求得发样中锌含量（pg/g）0

4.5注意事项

1.木实验采纳硝酸-高氯酸消解法对头发进行处理，这是湿法有机破坏的常用消解液，其破坏力强，适用于生物样品的破坏，所得无机金属离子为高价态。

由于硝酸和高氯酸均具有氧化性，破坏反应猛烈，切勿将溶液蒸干，以免爆炸。

消化操作应在通风柜内进行。

2.乙烘（燃气）■空气（助燃气）流量比对锌测定有较大阻碍，应通过实验选择。

此外，光谱通带、灯电流、火焰高度等均对测定有一定阻碍，需要进行选择。

4.6参考文献

[1]黄高超，孙林超.人体头发中锌含量分析研究•农产品加工•学刊，2007,11:

87.

[2]马威，袁英贤.原子吸取法测头发中锌含量的方法探讨.河南科学,2003,21（6）:

722.

[3]张桂文.原子吸取光谱法测定儿童头发中锌含量.辽宁化工，2018,38（10）:

770.

5双氯芬酸钠的生物利用度

5.1目的要求

1•把握药物生物利用度测定的实验设计和数据处理方法。

2.把握大鼠眼眶采血技术和常用给药技术。

5.2要紧实验材料与仪器

双氯芬酸钠（diclofenacsodium），布洛芬（ibuprofen）,肝素,色谱纯甲醇，分析纯KH2PO4；13000r/min离心机，高效液相色谱仪;SD雄性大鼠（180~220g）。

5.3实验原理

用甲醇沉淀血浆蛋口，以布洛芬为内标，HPLC法测定大鼠血浆中双氯芬酸钠浓度。

依照静脉注射给药和灌胃给药的药动学参数

（AUC）和给药剂量（D）运算双氯芬酸钠的生物利用度。

5.4实验方法

1.色谱条件:

分析柱为Cig（250mmx4.6mm,5pm）；流淌相为甲醇-20mmol/LKH2PO4溶液（pH3）（50：

50）；检测波长282nm；进样量20gLo

2.标准曲线的制备:

取双氯芬酸钠适量,用甲醇配制出浓度为lmg/mL的储备液，然后用甲醇稀释至200,100,50,10,5,2和lpg/mL的溶液作为标准溶液。

取布洛芬适量，用甲醇溶解并稀释制成

浓度为20ggiiiL的溶液，作为内标溶液。

取空白大鼠血浆100pL,分不加入上述双氯芬酸钠标准溶液10gL和布洛芬溶液10gL,混匀，再加入250pL甲醇溶液，混匀，在lOOOOpiiiin下离心10min,取上清液20pL进样测定。

将双氯芬酸钠的峰而积与内标峰面积的比值与双氯芬酸钠浓度进行线性回来，获得标准曲线。

3.血样采集：

取SD雄性大鼠12只，随机分成2组，将其中一组

按20mg/kg的给药剂量灌胃给药，另一组按2mg/kg的给药剂量尾静脉注射给药。

分不在给药前和给药后5,10,15,30,45,60,90,120,240,360和480min,眼眶取血250pL,置于肝素离心管中,5000r/min离心，取100卩L血浆，4°C放置备用。

4.样品分析：

取大鼠血浆样品100卩L,加入内标溶液10|.iL,加入甲醇260pL,混匀，在lOOOOr/min离心lOmin,取上清液20pL进样。

将双氯芬酸钠与内标的峰面积比值代入标准曲线中，运算相应的浓度。

5.数据分析：

灌胃给药和静脉注射给药各大鼠不同时刻点的血药浓度按表1和表2填写。

采纳药动学分析软件DAS2.0运算药物动力学参数。

并按以下公式运算生物利用度：

生物利用度F=A££^x—X100%

AUCivDpo

5.5注意事项

1.运算药物动力学参数的软件有专门多，如3P97,DAS2.0等。

可依照实验室己有的软件进行运算。

开始运算前，需保证时刻和浓度的单位一致。

在进行运算时，有两种拟合模型，分不是房室模型和统计柜模型。

当采纳房室模型拟合时，可能显现同一组动物数据中显现不同房室模型的情形，使数据处理显现偏差。

因此，常用的拟合模型为统计矩模型。

2.静脉注射组开始几个时刻点的样品浓度有可能超出标准范畴的上限，显现这种情形时，应将样品用空口大鼠血浆稀释后测定。

表1灌胃给药各大鼠不同时刻点的血药浓度（pg/niL）

时刻

鼠号

（min）1

2

34

56

5

10

15

30

表2静脉注射给药大鼠不同时刻点的血药浓度（yg/mL）

时刻

鼠号

（min）1

2

34

56

5

10

15

30

5-6参考文献

[l]Leon-ReyesMR,Castaneda-HernandezG,OrtizeML

Pharmacokineticofdeclofenacinthepresenceandabsenceof

glibenclamideintherat.JPharmPharmaceutSci2018,12（3）:

280・

[2]MusmadeP,SubramanianGSrinivasanKK,High-performanceliquidchromatographyandpharmacokinethcsofaceclofenacinrats.

AnalyticalChmicaActa.2007,585:

103.

6.血浆蛋白结合率测定

6.1目的要求

1.把握超滤法测定蛋口结合率的方法。

2.熟悉实验条件的考察与选择。

6.2要紧实验材料与仪器

龙胆苦昔（gentiopicroside,GPS）,正常人血浆,色谱纯甲醇,分析纯磷酸盐；超滤管（10k）,可控温高速离心机，Eppendor（EP）离心管，高效液相色谱仪；昆明种小鼠。

6.3实验原理

将龙胆苦苛与