脱落酸结合蛋白ABAR受体功能的鉴定.docx

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脱落酸结合蛋白ABAR受体功能的鉴定

脱落酸结合蛋白ABAR受体功能的鉴定

中国农业大学博士学位论文脱落酸结合蛋白ABAR受体功能的鉴定姓名:

王小芳申请学位级别:

博士专业:

果树学指导教师:

张大鹏20060501摘要之前我们实验室从蚕豆（,;,,,,,,）中纯化到,,,结合蛋白，发现它可能参与了,,,诱导的气孔响应，将其假定为,,,受体,,,,（,,,,,,,,,,,;,,,;,,;,,,,;,,,,,），根据,,,,的序列信息克隆到相应的;,,,片段序列（基因登录号:

,,,,,,,），这段序列编码推定的镁螯合酶,亚基（,,,,）;端大约,,,个氨基酸。

在酵母中表达拟南芥,,,,,,,,,基因;,,,，表达并纯化得到的,,,,,,,,,蛋白能够特异结合,,,。

所以我们在拟南芥（,,,,,,,,,,,,,,,,,,,）中进一步研究了,,,,,,,,,介导,,,信号的功能。

利用拟南芥中的,,,,,,,,,基因;,,,序列片段，构建反义（,,,,,,,,,）和,,,,（,,,,,,,,,,,,,;,）抑制基因表达载体，然后转化拟南芥。

目的在于通过降低,,,,蛋白的表达，从而研究,,,,基因的生理功能。

筛选得到的阳性植株中有个别株系叶片的叶绿素含量降低，多数株系同野生型叶绿索含量相近。

转基因植株中,,,,,和,,,,,,,含量降低，但内源,,,含量没有变化。

转基因植株在种子萌发、幼苗生长和气孔实验中，表现出对,,,不敏感。

抗旱实验以及离体叶片失水实验结果表明，转基因植株对失水和干旱胁迫较野生型敏感。

进一步的生理学研究结果表明，,,,,,,,,,特异介导,,,信号转导而不参与其它激素信号转导过程。

为了证明,,,,,,,,,的受体功能独立于叶绿素合成和质体（核之间信号转导功能，我们对叶绿素合成路径中的叶绿素酸酯氧舍酶（,,,）突变体（;,,（,）和质体（核信号转导解偶联（,,,，,,,,,,,,,;,,,,,,）突变体（,,,,,,,,，,,,,,,,,，,,,,，,,,,）,,,响应表现型进行了研究。

结果表明这些突变体植株中,,,,,,,,,表达量没有发生变化，虽然多数突变体中叶绿素含量有所降低，但都对,,,处理没有脱敏的表现型。

由此证明,,,,,,,,,,受体功能独立于叶绿素合成以及质体一核信号转导路径。

;;,是,,,,,,,,,基因单核苷酸突变体，也是一个,,,突变体，与,,,,突变体有相同的袁型，但它对,,,不敏感，而且,,,,,,,,,的表达量降低。

由此进一步证实了，反义和,,,,抑制删基因表达所导致的植物对,,,脱敏的表现型是可靠的。

在拟南芥野生型植株的微粒体组分和可溶性蛋白组分中均有,,,,,,,,,蛋白存在，而且这种蛋白在花、角果、叶片、根、茎以及正在萌发的种子当中均有表达。

,,,,,,,,在不同器官中的转录水平基本是相当的。

以上实验结果为,,,,的,,,受体功能提供了可靠的遗传学证据。

,,,的遍在性表达显示它可以在植株整体水平上介导,,,信号。

关键词:

脱落酸，结合蛋白，受体，功能鉴定,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（,,;,,,,,,）,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?

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缩略语表英文缩写英文名称中文名称,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（苄基腺嘌呤,,,,,,;,,,;,;,,脱落酸,,,,,,,,,,;,,,,,:

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（（;,,,,,,,,,,;,,,（氨基环丙烷（,（羧

酸,,，,,,,,,,,,,,;,,,,,,,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,一溴,氯,,（吲哚磷酸甲苯胺蓝,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,（二叔丁基对羟基甲苯,,,,,,,,,,,,,,,,,油菜素内酯,,,,,,,,,,,,?

,,,,,,,,,牛血清白蛋白,,,,十六烷基三乙基溴化铵,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,焦碳酸二乙脂,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,二甲基亚砜,,,,,,,,,,,,,,,,,二硫苏糖醇,,,,,,,,,,,,;,;,,赤霉酸,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,磷酸葡糖酸脱氢酶,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,谷胱甘肽（,一转移酶,,,,,,,（,,,,,,,,,,,,,,）,,,,,,,,,,,?

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,,丙磺酸，,,,异丙基硫代,,（,,半乳糖苷,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,一（,,,,,,,,,,,）,,,,,,,,,,,,,;,;,,,（吗啉代乙基磺酸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,镁卟啉?

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奈乙酸,,,,,,,,磺酸,,,,,,,,,,,,;,,,;,;,,

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一四甲基乙二胺“,,,,,,,,,,（,,,,,,,,,,,,,）一,，,,,,,,,,,,,,,三羟甲基氨基甲烷独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书褂霉牟牧稀,胛乙煌ぷ鞯耐径员狙芯克龅娜魏喂毕拙言诼畚闹凶髁嗣?

确的说明并表示了谢意。

研究生签名:

工?

小豸时间:

耐年,月旷日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:

学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

（保密的学位论文在解密后应遵守此协议），研究生签名:

五小芍时间:

如,年„月，，日导师签名:

、、弘么鸭时间么《年乡月，,一日第一章文献综述,（,脱落酸（,,,）研究进展脱落酸（,,,）是植物体内合成的一类植物激素，它在植物生长和发育的很多方面都起到重要的作

用。

,,,司,调控种子成熟和萌发过程，包括种子干旱抗性、休眠以及贮藏蛋白合成（,,;,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,;,，,,,,）;,,,可以调节植物对环境胁迫的适应性，作为中间信号介导水分胁迫相关的胁迫响应，引起干旱诱导的气孔关闭（,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,;,,,,,（，,,,,）;此外，,,,还可以调控果实发育（,,,,,,，,,,,;,,,,,,，,,,,），对于刺激果实中糖份积累、改良果实的产量和品质等果实生理方面起到重要作用（,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,,,,以，,,,,）。

在过去的十几年中，,,,信号转导过程被，“泛研究（,,,,,,,,,,,（，,,,,，,,,,;,,,,,,,,,（，,,,,，,,,,;,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,;,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,

,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,

;,,,,,,,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,,,,,,,（，,,,,,，,,,,,;,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,（，,,,,），国内外对,,,的研究主要集中在三个方面:

一是以寻找,,,受体为目的的受体研究;二是研究,,,,,植物抗逆基因表达、调控的研究;三是,,,信号转导通路中的细胞内中间信使。

（,（,脱落酸（,,,）受体的研究进展受体是指在细胞膜上或细胞内能首先与信号分子（激素、药物等）相互作用的蛋白质分子。

它具有三个级联的功能:

（,）对信号分子进行识别并与之结合;（,）将信号向细胞内下游转导;（,）产生相应的生物效应。

从受体与信号分子配体结合的角度来看，它还具有以下几个特征:

（,）高亲和力和低容量;（,）可饱和性和可逆性;（,）专一性。

即有一定的立体选择性。

植物通过,,,信号分子感知逆境，并进行自身适应性调整的过程分为两步:

一是,,,信号分子的产生，即在有关组织中合成,,,，并将其运到效应部位;二是效应部位细胞对,,,信号的响应（进而诱导抗逆性。

作为植物激素信号粒拢潦紫扔Ω猛ü诨蛘甙獾奶匾煳坏悖ㄊ芴澹?

幌赴兄ǎ停椋悖瑁幔澹欤幔睿洌郑幔欤澹妫椋幔保梗梗常唬牵椋颍幔酰洌幔簦澹簦幔欤

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,,,,,,,,,，,,,,），然后址认（受体复合物激活胞内信使，将,,,信号传递到靶酶或靶基因，产生短期或长期的生理效应（,,,,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,（，,,,,）。

在,,,诱导的一系列反应过程中，,,,受体蛋白对,,,信号的识别过程是关键的一步（,,;,,,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,,,,（，,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,）。

如果,,,受体蛋白功能出现障碍，细胞,,,信号不能进行有效的识别，即使,,,数量增加，也不会产生相应的生理效应;相反，,,,受体蛋白数量的增加或对,,,信号亲和力的增强，可极大的增强细胞对,,,的敏感性，使植物在低浓度的,,,,及时地

或较早地获得对干旱的抗性。

可以说，,,,受体识别过程控制着植物抗逆性的形成，,,,受体蛋白是调控植物抗逆性的关键的功能蛋白。

因此，,,,受体研究,作的开展，对于人们了解,,,的作用机制，进而人为地调控植物对中国农业大学博士学位论文第一章文献综述环境的适应能力，意义重大。

国内外通常采用以下两种方法筛选,,,受体:

一是通过筛选突变体，定位基因，克隆基因;二是利用生化方法，分离,,,结合蛋白，克隆基因，鉴定其受体性质。

但是迄今为,,，并没有筛选到,,,突变体植株，推测或许由于,,,受体突变是致死的，或者由于,,,受体的多元化，导致单一受体突变体难以表现出来，所以研究,,,受体的方法就集中在通过,,,结合蛋白进一步鉴定其是否为受体。

因此一系列的方法被用于检测并鉴定,,,结合位点（或,,,结合蛋白），并将其作为假想的,,,受体进一步研究其对,,,信号的感知（,,,,,,,,,，,,,,）。

（,（,（,脱落酸（,卧）结合蛋白的研究进展,,,结合蛋白的研究始,,年代，,,,,,,（,,,,）和,,,,,,,,,（,,,,）最早认为,,,在气孔反应上其作用位点可能位于质膜上，,,;,,,,等（,,,,）首次利用放射配基结合分析法证明蚕豆叶片亚细胞组分中存在,,,的特异结合活性，随后,,,,,,,,和,,,,,,（,,,,）用蚕豆保卫细胞原生质体为材料，证明保卫细胞质膜存在高亲和的蛋白质结合位点，并计算出每哪,保卫细胞原生质体质膜有,,,,多个,,,结合位点。

遗憾的是自从,,,,年以后，有关,,,结合蛋白的研究在相当长的时间内没有突出进展。

近年来随着,,,生理功能的揭示，人们对,,,结合蛋白的研究又出现了一个新的高潮。

,,,,,（,,,,）用放射免疫法证明小麦茎切段胞质部分存在着能与,,,高亲和结合的蛋白质;,,,,等（,,,,）用放射配基结合法分析水稻幼叶粗膜组分发现了与,,,高亲和力的结合蛋白，其反应平衡常数为,（,,×,,,,,,,,;,,,,和,,,（,,,,）在玉米根中也发现存在有,,,结合位点;,,,,,,等（,,,,）将,,,偶联到载体蛋白上，并利用这些亲和探针检测和纯化,,,结合蛋白，发现在拟南芥叶片微粒体组分中存在,,,结合蛋白，并且定位在质膜组分中:

,,,,等（,,,,，,,,,）在葡萄和苹果果实中发现,,,结台蛋白，并且研究了,,,结合蛋白在果实中的性质及分布情况，苹果果实的微粒体组分和可溶蛋向组分中均可以检测到,,,结合蛋白。

这些结果对于研究,,,结合蛋白的性质提供了许多有价值的线索，但是一直没有纯化到,,,结合蛋白和克隆到,,,受体基因的相关报道，长期的实验经验说明，通过遗传学的方法很难得到,,,受体，因而纯化,,,结合蛋白成为分离,,,受体进而研究,,,信号感知机制的关键步骤。

,,,年，,,,,,等（,,,,）通过亲和层析的方法首次从蚕豆（,,,,如,,）叶片下表皮中纯化得到,,,,结合蛋白，通过,,,凝胶电泳、等电聚焦电泳以及双向电泳等手段确定纯化蛩,,,,结台蛋白为单一蛋白，分子量为,,,,，等电点为,（,,。

玄,,,,结合蛋白具有可饱和性、可逆性和高亲和性等特性，几乎满足其作为,,,受体的所有基本要求（,,,,,，,,,,），但要确定其受体功能还有待丁，克隆,,,,,蛋白的基因序列并进行进一步的生理功能研究。

,,,,等（,,,,）纯化到受,,,诱导的并在大麦糊粉层中表达的,,,,,蛋白,,,,,，并克隆,,,,,,的基因序列（,,,,,,,,,,;;,,,,,,,,,

,,,,,,,,,,、。

,（,（,脱落酸（,,,）受体的发现,,,,年，,,,,,等（,,,,）根据其在,,,,年纯化到的,,,结合蛋白,,,,,的序列信息（,,,,,,,,,（，,,,,），发现其氨基酸序列与拟南芥中调控花期的,,,氨基酸序列相似，,,,作,中国农业大学博上学位论文第一章文献综述为核,,,结合蛋白已经被公认的功能是通过阻，,,,,（一种抑制开花的,,,,转录因子）,,,,积累从而促进开花，但是还没有研究表明,,,具有结合,,,的特性。

,,,,等（,,,,）证实,,,同,,,有很高的亲和性，并且作为受体参与了,,,代谢及花期的调控。

这表明植物中,,,受体以及信号转导机制具有复杂性和多样性的特点（,,,,,,,,,（，,,,,）。

但是已经鉴定的,,,受体,,,只参与了对花期的调控，参与调控种子成熟、萌发、萌发后生长、气孔运动以及植株对干旱响应等功能的,,,受体仍然是未知的。

（,（,脱落酸（,,,）信号转导的研究,（,（,（,,,,调节气孔运动以及气孔中,,,的信号转导机制两个保卫细胞首尾连接形成气孔，气孔开、关是保卫细胞渗透收缩或膨胀的结果。

在水分胁迫下，细胞内、外,,,的增加，是降低膨压导致气孔关闭的激发因素。

与其他组织不同，成熟的保卫细胞间没有胞间连丝。

这一特点为研究,,,积累、信号传导及其他生理效应，提供了有利的单细胞系统。

现有证据表明，保卫细胞至少有两类,,,感知位点（,,,,,,,，,,,,:

,,,,,,,,,,,（,,,,:

,,,,

,（，,,,,,（，,,,,）。

一类位于质膜上（,,,,,,,,,,,,,:

,,,,,,,,（，,,,,），一类位于细胞内部。

,,是一种兼