支气管肺泡灌洗BAL的临床应用与实验室检查.docx

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支气管肺泡灌洗BAL的临床应用与实验室检查

支气管肺泡灌洗（BAL）的临床应用与实验室检查

一．定义：

支气管肺泡灌洗（bronchoalveolarlavage,BAL）是一种经纤维支气管镜获取肺泡的细胞与生化成份的广为实用而安全的方法。

注意:

BAL的操作规范

BAL灌洗液的处理规范

BAL的非细胞成份指标尚不能作为有用的临床参考

二．用途：

●疾病诊断：

特异性诊断；重要诊断工具。

●疗效与预后评价

●治疗

●研究

Ø对于某些特殊疾病，BAL可以做出特异性的诊断

●机会性肺部感染：

卡氏肺囊虫性肺炎，巨细胞病毒性肺炎，肺结核，肺真菌感染

●尘肺，石棉肺，肺出血

●铍肺（阳性淋巴细胞转换试验）

●支气管肺泡细胞癌，恶性淋巴瘤等（肿瘤细胞）

●肺泡蛋白沉着症（对氨基水扬酸－阳性小体）

●组织细胞增多症X（HistiocytosisX）

Ø对于一些间质性肺病，BAL是重要诊断手段

结节病，外源性过敏性肺泡炎，闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎（BOOP），特发性肺纤维化（IPF），慢性嗜酸细胞肺炎等。

三．应用指征

1.间质性渗出改变：

结节病，外源性过敏性肺泡炎，药物性肺泡炎，特发性肺纤维化，胶原血管疾病，组织细胞增多症X，尘肺，癌性淋巴管炎等。

2.肺泡渗出改变：

肺炎，肺泡出血，肺泡蛋白沉着症，BOOP，嗜酸细胞肺炎等

3.免疫缺陷病人并肺渗出病变：

HIV感染，化疗或放疗，免疫抑制剂治疗，器官移植

四．BAL副反应：

发生率为0-2.3%，当同时进行经支气管镜肺活检（TBLB），副反应为7%，尚无因BAL死亡报道，因TBLB死亡0.2%，因开肺活检（OLB）死亡1.8%。

1.副反应发生形式与时间

肺泡渗出

<10%，多于48小时后消失

爆裂音

２４小时内，于相关肺野

喘息

高敏病人1-2周

发烧

10-30%BAL几小时后，可能与TNF-介导有关

肺功能损害

FEV1,VC,PEF,PaO2短时降低

PaCO2短时增加（COPD）

支气管痉挛

少，高敏病人相对多

气胸

只发生在经支气管肺活检同时进行

支气管反应性

无变化

上皮完整性

支气管纤毛摆动短时降低，

但BAL进行24小时后，上皮细胞通透性无影响

出血

不明显

2.副反应的预防：

副反应随着灌注量及灌注肺段的增加而增加，仔细操作，特别注意能使并发症减少到最小程度。

●全面了解病史，进行肺功能试验，血气分析，血小板计数，出凝血时间，心电图，胸部放射片

●ECG，氧饱和度监测并予吸氧

●BAL后24小时观察

●限制灌洗量到最小需要量

●适当的操作前用药，必要时使用ß-受体激动剂等

●特殊病人严格掌握适应征

3.BAL时副反应发生的危险因素

●>50%的肺野渗出实变PaO2<60mmHg

●SaO2<90%，支气管反应性PC20<2ug/ml乙酰甲胆碱

●FEV1<60%预计值，或FEV1<1LProthrombintime<50%

●血小板计数低于20,000/ml明显异常的ECG

●对镇静剂敏感或不能耐受严重的伴发症

PC20：

FEV1降低20%所需的最低乙酰甲胆碱浓度

五．ＢＡＬ操作

绝大多数在局麻下使用纤维支气管镜进行。

BAL总是在其它纤支镜操作之前，以免造成BAL的不纯。

1.操作前用药：

●镇静剂:

以便病人合作；

●胆硷能受体抑制剂：

减低迷走反射，支气管分泌，可增加BAL回吸收。

2.局部麻醉：

必须彻底，防止咳嗽，因咳嗽致损伤，出血及灌洗液丢失。

但进行BAL前应将利多卡因吸走以免影响细胞回收，活性及功能。

3.灌洗部位：

常规为右中叶，左舌叶。

中叶易于操作及嵌顿，回收的BAL较灌洗下叶多20%；

对于大多数弥漫性间质性肺病病人，一个部位灌洗应该能代表全肺并能提供足够的临床资料；

局部病变如肿瘤，炎性渗出等需行局部病变部位灌洗。

4.灌洗液：

无菌生理盐水，370C或室温。

5.灌注和回收方法：

20-50ml／次，总量100-300ml／肺段。

临床上较实用而安全的灌洗量：

5x20ml。

6.回收方法：

每次灌注后立刻经朔料注射器手动回抽或吸引器低压轻轻吸引（25-100mmHg）；

通常回吸收40-70%，<25%时，BAL不可靠；

回收的液体必须收集在朔料或硅化的注射器或容器内，防止巨噬细胞附着；

可借助于导管进行灌注，嵌顿后将导管从活检孔送至支气管镜尖端，再行灌注有利于注射器的变化，同时降低死腔。

7.BAL操作关键：

局麻充分；防止病人咳嗽；无急性支气管炎；支气管镜嵌顿。

六．ＢＡＬ液的实验室处理

1．细胞计数与活性

1）所有回收液经两层纱部过滤，移去粘液，充分混匀

（若使用20ml／次，因第一管回收的液体及细胞占总量比例很小，计入总量内，对结果影响不大）。

2）观测性状，测定液体量

如BAL液呈混浊奶白色，提示肺泡蛋白沉着症，需进行PAS染色，电镜检查。

如BAL液呈橘黄色，提示出血，需行铁染色。

3）离心1500rpmx10min

●上清液保存在-800C冰箱，以作生化成份分析。

至目前为止，尚无一个可靠的参考定量标准．故尚无法用于临床。

●细胞沉淀用2mlMBE充分混匀后，等分装在两个eppendorf管内，1管用作细胞分类计数，另1管用作细胞免疫分析。

*如果是血性ＢＡＬ，需先进行梯度离心分离淋巴细胞，加1mlFicoll液于前述留作细胞免疫分析用的1ml细胞悬液的底部，梯度离心3000rpmx3min+2000rpmx5min，让离心机慢慢减速而停止．小心吸取细胞环，用ＭＢＥ2ml悬浮，洗涤。

*如怀疑石棉肺：

则先混匀所有回收液（过滤离心前），从中取出10ml+30ml蒸馏水混匀，室温静置约一小时，破坏细胞，有利于被巨噬细胞吞噬的石棉小体释放。

轻轻摇晃，经石棉小体过滤装置（Millipore）真空过滤，过滤后，0.45um微孔膜空气干燥，注意避免打折

小心转移滤膜至圆形玻片上，用Histokitt封片

因用Histokitt封片后，亮度足够镜下观察，故没有必要用丙酮溶解滤膜。

光镜（10x或40x）下计数整张滤膜上的所有石棉小体．被过滤的BAL毫升数（如10）除，得结果：

石棉小体数/mlBAL

4）细胞总数与活性测定

●细胞总数:

10ul上述细胞混悬液+200mlTurck溶液，充分混匀，取适量填充于血细胞计数板内计数或采用自动计数仪计数。

血细胞计数板（Neubauercellchamber）数四角大方格（16x4个小方格）内细胞数，计算公式为：

细胞总数=细胞数x52.5（计数板溶积）x2000ul（含所有细胞）

106

=细胞数x0.105=?

（x106细胞）

●细胞活性:

50ul上述细胞混悬液+10ul台盼蓝（Typanblue）溶液，充分混匀，取适量填充于血细胞计数板内，5-10分钟内计数100个细胞内存活细胞的百分率％，死细胞染成蓝色。

通常于320倍放大下计数。

通常活性在80-95%,<50%细胞活性，细胞形态及功能明显受影响。

2.细胞分类检查：

1）细胞涂片方法：

●常规手推片：

简单，能适用于大多数需要，尤其适应于要进行肿瘤细胞鉴定的BAL及血性BAL．将上述留作细胞学检查的细胞混悬液离心后进行涂片，空气干燥。

合格涂片细胞密度适当，细胞分布均匀。

●细胞离心涂片：

每张片5-20x104细胞。

细胞保存液，离心速度，时间均可影响细胞分类。

细胞离心涂片降低淋巴细胞分类。

当细胞总数<1x106时，通常采用细胞离心涂片，当细胞总数<1x106时，经验稀释法如下：

细胞总数（x106）

细胞悬液

+

MBE

<0.5

0.6

500ul

+

250ul

0.7

400ul

+

300ul

0.8

350ul

+

350ul

0.9

350ul

+

400ul

1.0

300ul

+

450ul

将细胞充分混合后，每管200ul于细胞离心机离心650rpmx2min

●微孔过滤：

每张过滤纸200,000细胞，让其进行重力引流（gravitydraining）涂片。

保持样本湿化是关键，干燥将产生严重的细胞变性．适合于改良的Haematoxylin-eosin,Papanicolaou染色，后者较好地显示细胞核与细胞浆，有利于瘤细胞，病毒包含体的鉴别，与细胞离心涂片比较，淋巴细胞比例增加，嗜中性粒细胞比例降低

●点吸涂片：

将上述留作细胞学检查的细胞混悬液离心后，调节细胞数不要>106细胞/ul进行点吸涂片，取一滴（约10ul）细胞液滴于玻片，即刻回吸，形成一细胞圈；重复上述操作，做成四个细胞圈排列于玻片一端，空气干燥。

*每份BAL样本通常做3张涂片，一张做普通染色，另二张备做特殊染色。

当怀疑机会性肺部感染，需做抗酸染色，甲苯胺蓝染色时，应加做点吸涂片二张．　

2）细胞染色：

●常规染色（供做细胞分类）：

May-Grunwald-Giemsa（MGG）染色

●特殊染色：

Fe染色（Berlinbluestain）

PAS染色，过碘酸雪弗染色（PeriodicacidSchiff'sstain）

甲苯胺蓝染色（Toluidinestain）

苏丹染色，脂肪染色（SudanIIIstain）

抗酸染色（Ziehl-Neelsenstainforacid-fastbacillistain）

3）细胞分类计数：

●ＭＧＧ染色涂片于光学显微镜下观察，计数至少６００个白细胞求分类百分比。

●半定量估计上皮细胞，红细胞，如上皮细胞>5%提示支气管成份的混入。

●另外观察细胞形态，巨噬细胞内吞噬体，尘粒，石棉小体，红细胞片段，CMV包含体，卡氏肺囊虫（PCP），细菌，霉菌，异形上皮及肿瘤细胞。

3.免疫细胞学分析

●免疫细胞化学法，如过氧化酶抗过氧化酶反应

●免疫荧光或流式细胞仪分析（Immunofluorescenceorflowcytometry）

免疫荧光优点：

流式细胞仪自动测定，双标计有利于研究两种不同表面抗原的平行表达

免疫荧光缺点：

非参数计录，非细胞形态显示，巨噬细胞的自动荧光干扰

免疫化学方法优点：

光学显微镜，永久保存，形态学观察，敏感性高

免疫化学方法缺点：

虽双标记可能，但耗时间

4.过氧化酶抗过氧化酶方法（perioxidase-antiperioxidasemethod）

是进行ＢＡＬ细胞免疫分析常使用的方法。

优点：

所需细胞少，20,000细胞／反应区，所需用抗体少

细胞形态保存好（因为避免了干燥，离心，丙酮固定，因此优于经空气干燥的细胞离心涂片所进行的免疫化学染色）

1）细胞的准备：

●将前述留作免疫细胞分析的细胞用ＭＢＥ洗3次，离心1500rpmx3min

●再用ＭＥＭ洗3次，离心1500rpmx3min

●稀释至适当的细胞浓度，一般10x106/ml，若巨噬细胞多，使用二倍MEM稀释，若淋巴细胞细胞多，使用1/2倍MEM稀释

2）细胞附着：

●吸附玻片用温水洗去绿色保护层，再用ＮＫＨ溶液冲洗（注意不要损坏反应区带正电的薄膜，因其吸附带负电的细胞）。

●将混匀的细胞悬液10ul（20,000细胞）加于每个反应区，显微镜下监控细胞密度．如细胞层过厚，需进一步稀释，如太薄，需加更多细胞．细胞于湿合内室温下静置10分钟，防止细胞干燥。

3）细胞固定：

●真空吸去MEM，加10ul0.05%戊二醛于每个反应区，让其反应5分钟，吸走固定液，用NKH洗三次。

（固定有利于细胞形态保存，细胞附着，阻止细胞表面的Fc受体）。

4）加10ul准备好的MAG-Sweine于每反应区，震荡浮化15分钟，吸走MAG-Sweine。

（以避免免疫球蛋白连接于玻片表面）

5）加特异的单克隆抗体10ul，震荡浮化15分钟。

*到此，反应可以斩停，细胞片放于40C冰箱保存。

6）过氧化酶抗过氧化酶反应：

*用NKH喷雾清洗多于抗体，相继先后在三个盛有NKH的玻璃器皿内漂洗3次，仔细从侧边吸走过剩的NKH。

●加10ul准备好的RAM到每个反应区，于震荡器上震荡浮化5分钟，用NKH清洗玻片同上述。

●加10ul准备好的SAR溶液于反应区，于震荡器上震荡浮化5分钟，用NKH清洗玻片同上述。

●加10ul准备好的PAP溶液于每反应区，震荡浮化5分钟，同前用NKH清洗后，再让玻片留于第三瓶NKH内震荡清洗5分钟。

7）DAB反应：

●移去过度的NKH，加DAB10ul于每反应区，反应10分钟，用NKH喷雾洗去DAB，再将玻片放于新鲜的NKH溶液钟震荡清洗5分钟。

（注意：

DAB是致癌物，需保护性操作，一定要在排风装置下，戴口罩，手套操作，DAB废物特殊存放，特殊处理）

8）Osmium反应：

●移走多余的NKH，加10ulOsmium于每反应区，置于湿合内于冰上反应10分钟进行后固定，用蒸馏水清除过剩的Osmium，玻片短时置于蒸馏水的器皿中。

（注意：

Osmium是有毒物，需保护性操作，一定要在排风装置下，戴口罩，手套操作，Osmium废物特殊存放，特殊处理）

9）封盖玻片：

●移走过量的蒸馏水，滴玻片覆盖液适量，加盖玻片，轻轻挤压移去多量覆盖液，不要留气泡，不要挤压细胞，清洗表面，轻轻试干，用无色指甲油封片。

10）光学显微镜下计数至少200个淋巴细胞或巨噬细胞（包括阳性和阴性细胞），求出阳性反应细胞的百分率。

5.细胞染色方法

1）May-Grunwald-Giemsa（MGG）染色:

●空气中凉干的细胞涂片于浓缩的May-Grunwald溶液中染色3-5分钟

●蒸馏水短时冲洗

●1:

100Giemsa蒸馏水混合液中染色15分钟

●自来水短时冲洗，空气中凉干，加Histokitt封片

2）Fe染色（Berlinblue染色）：

注意：

禁止使用含Fe的镊子和容器

●空气中凉干的细胞涂片于纯甲醇（methanol）中固定5分钟

●配制PotassiumHexacyanoferrateII溶液：

1gPotassiumhexacyanoferrateII3H2O

+100ml蒸馏水

+1ml37%HCL

（盐酸加入使之易氧化，由无色清亮变为绿色,特殊废品处理）

●玻片于新鲜的PotassiumHexacyanoferrateII溶液中作用8分钟

●于Mayer氏苏木精明矾（Mayer'shaemalaun）染液中染色2-5分钟（染核）

●蒸馏水中清洗最多10分钟显蓝色

●空气干燥，滴玻片覆盖液如Histokitt，加盖玻片。

3）甲苯胺蓝（Toluidineblue）染色：

●点吸细胞涂片空气干燥至少半小时

●准备醋酸硫酸混合液：

30ml浓醋酸（concentratedaceticacid）

+10ml浓硫酸（concentratedsulphicacid）

使用前冷却10分钟

●细胞涂片放于准备好的醋酸硫酸混合液中浮化5分钟，轻轻摇晃至少3次，以促进细胞更好溶解。

●自来水流动清洗5分钟

●甲苯胺蓝瓶中封盖染色5分钟

●自来水流动清洗3分钟

●玻片先后在96%和100%乙醇（ethanol）中浸蘸约10秒

●空气干燥，滴玻片覆盖液如Histokitt，加盖玻片

ＰＡＳ染色

●涂片空气干燥至少2小时

●蒸馏水短暂冲洗

●玻片于过碘酸（periodicacid）溶液中浸泡5分钟

●蒸馏水短暂冲洗

●放玻片于Schiff's试剂中10分钟

●蒸馏水短暂冲洗

●放玻片于SO2水中5分钟

●蒸馏水短暂冲洗

●Mayer'shaemalaun染液中30秒对照染色

●自来水中清洗5分钟至显蓝色

●蒸馏水短暂冲洗

●玻片先后于96%和100%乙醇各5秒钟脱水

●空气中凉干，加Histokitt封片

SO2水配制：

0.6gNa-disulphite

+100ml自来水

+5ml1NHCL

4）SudanIII染色（脂肪染色）

●细胞涂片空气干燥至少半小时

●蒸馏水中短暂浸蘸，50%乙醇（ethanol）中固定5分钟

●SudanIII溶液中封盖染色30分钟

●50%乙醇（ethanol）中固定10秒，蒸馏水短暂冲洗

●Mayer'shaemalaun染液中5分钟对照染色

●蒸馏水中清洗5分钟至显蓝色，空气中凉干，加Histokitt封片

5）抗酸染色：

●手推细胞涂片或点吸涂片空气中干燥至少半小时，加热固定

●玻片用浓缩的石炭酸品红液（carbolfuchsin）覆盖，加热蒸发过多染料至少5分钟

●自来水冲洗，玻片用盐酸酒精（HCL-alcohol）彻底脱色

●用自来水冲洗，美蓝（Methyleneblue）对照染色至多45秒

●自来水冲洗，空气中凉干，加Histokitt封片

6）肥大细胞染色：

●细胞涂片空气中干燥至少1小时，10分钟固定

●固定液组成：

50ml纯酒精（100%ethanol）

+40ml氯仿（chloroform）

+10ml醋酸（aceticacid）

●自来水流动冲洗5分钟

●甲苯胺蓝（Toluidineblue）溶液中染色20分钟

●自来水流动冲洗5分钟

●在96%乙醇（ethanol）中浸蘸2次，空气中凉干，加Histokitt封片

6.试剂配制

1）正常人血清（ABserum）分离

非抗凝血于560C浮育30分钟

40C冰箱静置2小时，离心5000rpmx20min

分离的血清按200ul分装，置于-200C冰冻保存

2）兔抗鼠免疫球蛋白原液（rabbitanti-mouse,RAMstocksolution）1:

50

50ul兔抗鼠免疫球蛋白（RAM）

+200ul正常人血清（ABserum）

+200ul猪血清（swineserum）

+2500ulMAG

40C冰箱储存可用二周

3）猪抗兔免疫球蛋白（swineanti-rabbit,SAR）

50ul猪抗兔免疫球蛋白（SAR）

+100ul人血清（ABserum）

40C冰箱孵化至少一天后待用，可存放4周

4）DAB（排风装置下，戴口罩，手套操作）

0.5gDAB

+50mlNKH（无Hepes，无酚红）

+5mlHepes（pH8.0）

+2ml明胶（gelantine）370C加热溶化

混合后，按2ml分装，置于-200C保存

DAB使用液：

2mlDAB+20ul3%H2O2

DAB-PAP探针试验:

5ulPAP+50ulDAB反应显棕色，40C冰箱保存可使用二天。

5）Osmium（排风装置下，戴口罩，手套操作）

250mgOsmium

+100mlSorensen-PBS（0.1M/L,pH7.4）

避光封装，40C冰箱保存

6）Latex

1000ulMEM（应用液）+50ul22%BSA+5ulLatex

溶液于370C水浴预热15分钟

7）ＢＡＬ细胞转送液

50mlMEM（应用液）+2.5ml22%BSA

8）抗体

各种冻干抗体按说明溶解

分装：

20ul抗体液+10ul液体石蜡，-200C冰冻保存

应用时，抗体室温解冻后，用MAG进行稀释，稀释倍数因抗体而异，如1:

50或1:

100

9）盐酸酒精溶液（HCL-alcohol）

270ml蒸馏水+700ml酒精+30ml37%HCL

10）过碘酸溶液（Periodicacidsolution）

3.75g过碘酸（H5IO6）+500ml蒸馏水

11）甲苯胺蓝（Toluidineblue）溶液

0.15g甲苯胺蓝0（Toluidineblue0）

+30ml蒸馏水

+70ml纯乙醇（100%ethanol）

+1ml37%HCL

12）SudanIII溶液

1gSudanIII+100ml70%乙醇（ethanol）

于350C水浴震荡溶解，冷却后过滤，避光保存

13）MAG（M=MEM,A=Albumin,G=Gelatine）

50ml浓缩MEM

+2mlHepes（pH8.0）

+500ul22%BSA（牛血清白蛋白）

+2ml5%Gelatine（明胶）（需水浴溶化）

+500ul10%NaN3（叠氮钠）（有害物，注意保护性操作）

配制好的MAG于40C冰箱保存可用一周左右

14）5%EDTA

5gTitriplexIII先用70-80mlNKH（无Hepes，无酚红，pH4-5）溶解，用NaOH调节pH为7.4，用同上NKH配成100ml．40C冰箱保存可达4-8周。

15）05%戊二醛（glutaraldehyde）

200ul25%戊二醛（有毒性）

+100mlSoerensenPBS（pH7.8）

+2.5ml40%葡萄糖

40C冰箱保存

16）5%明胶（Gelatine）

5g明胶先用80ml蒸馏水于500C溶解，加1mlNaN3，用1NNaOH调节pH至7.4，用蒸馏水配成100ml，按2ml分装，40C冰箱保存

17）1M/LSoerensen磷酸缓冲液，SoerensenPBS（Soerensenphosphatebuffer）

3.4gKH2PO4+250ml蒸馏水

7.7gNa2HPO4+500ml蒸馏水

加磷酸二氢甲溶液（0.1M/L）到磷酸氢二钠溶液至所需要的pH值

（如pH7.8，加约87ml）

*pH7.4为配制Osmium和玻片覆盖液准备

*pH7.8为配制戊二醛准备

分装，-200C冰冻保存

18）Hepes缓冲液1M/L

23.83gHepes先用80ml蒸馏水溶解

用1M/LNaOH调节pH至7.4或8.0，用蒸馏水配成100ml

*　HepespH7.4为配制NKH溶液准备，HepespH8.0为配制MEM使用液准备

19）免疫细胞片覆盖液（coversolution）

80ml甘油（Glycerin）

+15mlSoerensenPBS（0.1M/L，pH7.4）

+5ml25%戊二醛（glutaraldehyde）（毒性，排风装置下操作）

20）需每天新鲜配制的应用液

a）MEM（miniumessentialmedium）应用液

5ml浓缩MEM

2mlHepes（pH8.0）

加蒸馏水配制成50ml

b）MBE（M=MEM,B=BSA,E=EDTA）

30mlMEM应用液

250ul22%BSA（牛血清白蛋白）

600ul5%EDTA

c）NKH（N=Natriumchlorid,K=Kaliumchlorid,H=Hepes）

8gNaCL　＋　0.4gKCL　

＋　1L蒸