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生物化学实验

生物化学实验讲义

化学工程与技术学院

基础部

实验一酪蛋白的制备

一、目的

学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

二、原理．

牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

三、器材

1、离心机2、．抽滤装置

3、精密pH试纸或酸度计4、电炉

5、烧杯6、温度计．

四、试剂与材料

1、牛奶2500mL

2、95％乙醇1200mL

3、无水乙醚1200mL

4、0.2mol／LpH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL

5、．乙醇—乙醚混合液2000mL

五、操作

1、将100mL牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL。

用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心15分钟（3000r／min）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2、用水洗沉淀3次，离心10分钟（3000r／min），弃去上清液。

3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。

5、准确称重，计算含量和得率。

含量：

酪蛋白g／100mL牛乳（g％）

得率：

思考题

1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？

实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较

一、目的

1.学习分光光度计的原理和使用方法。

2.学习测定淀粉酶活力的方法。

3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。

二、原理

种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。

淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。

2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11

麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。

后者可用分光光度计测定。

休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。

本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。

三、器材

1.25mL刻度试管2.吸管

3.离心管4.乳钵

5.分光光度计6.恒温水浴

7.离心机

四、试剂和材料

1、小麦种子

2、o.1％标准麦芽糖溶液

精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

3.pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液

0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。

4、1％淀粉溶液

1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。

5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂

将1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml2ML1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。

6、1％氯化钠溶液

五、实验操作

1、种子发芽小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。

2、酶液提取取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。

在室温下放置20分钟，搅拌几次。

然后将提取液离心（1500r/min）6—7分钟。

将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。

进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。

取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上）。

3、酶活力测定

（1）取25mL刻度试管4支，编号。

按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟）

试管标号

试剂

干燥种子的酶提取液

发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液

标准管

空白管

酶液（mL）

0.5

—

标准麦芽糖溶液（mL）

—

0.5

—

1％淀粉溶液（mL）

水（mL）

—

0.5

将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL。

（2）取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。

冷却至室温，加水稀释至25mL。

并混匀。

在A500nm处测定各管的吸光度。

填入表中

试管号

干燥种子的酶提取液

发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液

标准管

空白管

A500nm吸光度

4、计算

根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，

本实验规定：

25℃时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（u）。

酶活力计算公式为：

式中：

C酶酶液麦芽糖的浓度，V酶提取酶液的总体积，n酶酶液稀释倍数。

思考题

1、为什么此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？

而测酶的活力时要在25预保温？

反应后又放入沸水浴中？

2、实验结果说明什么？

实验三纸层析法分离鉴定氨基酸

一、目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：

…

在一定的条件下某种物质的只Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、器材

1.层析缸2.毛细管3.喷雾器4.培养皿5.层析滤纸（新华一号）

四、试剂

1、扩展剂650mL

4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。

将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。

取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。

2、氨基酸溶液0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5％）。

各5mL

3、显色剂50～100mL

1.1％水合茚三酮正丁醇溶液。

五、操作

1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2.取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。

在纸的—端距边缘2～3cm处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。

3.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。

每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

4.扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。

将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。

待溶剂上升15—20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5.显色用喷雾器均匀喷上O.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6.计算各种氨基酸的只Rf值。

思考题

1、何谓纸层析法?

2、何谓片Rf值?

影响Rf值的主要因素是什么?

3、怎样制备扩展剂?

3、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？

实验四酶的特性

一、目的

加深对酶的性质的认识。

二、内容

本实验由温度对酶活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专—性4组实验组成。

（一）温度对酶活力的影响

1、原理

酶的催化作用受温度的影响。

在最适温度下，酶的反应速度最高。

大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50～60℃。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。

有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性井无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。

低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

2、器材

（1）试管及试管架

（2）恒温水浴（3）冰浴（4）沸水浴

3、试剂和材料

（1）0.2％淀粉的0.3％氯化钠溶液150mL需新鲜配制

（2）稀释200倍的唾液50mL

用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200倍（稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整），混匀备用。

（3）碘化钾—碘溶液50mL

将碘化钾20g及碘l0g溶于100mL水中。

使用前稀释10倍。

4、操作

淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。

糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。

最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。

在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

取3支试管，编号后按下表加入试剂：

管号

淀粉溶液（mL）

1.5

稀释唾液（mL）

—

煮拂过的稀释唾液（mL）

—

摇匀后，将1、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放人冰水中。

10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾—碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。

记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放人37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何?

（二）pH对酶活性的影响

1、原理

酶的恬力受环境pH的影响极为显著。

不同酶的最适pH值不同。

本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。

2．器材

（1）试管及试管架

（2）吸管（3）滴管（4）50mL锥形瓶5）恒温水浴3、试剂和材料

（1）新配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液250mL

（2）稀释200倍的新鲜唾液100mL

（3）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液600mL

（4）0.1mol/L柠檬酸溶液400Ml

（5）碘化钾—碘溶液50mL

（6）pH试纸pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四种

4、操作

取4个标有号码的50mL锥形瓶。

用吸管按下表添加0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0～8.0的4种缓冲液。

锥形瓶号码

0.2mol／L磷酸氢二钠

0.1mol/L柠檬酸

5.15

4.85

5.0

6.05

3.95

5.8

7.72

2.28

6.8

9.72

0.28

8.0

从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5％淀粉溶液2mL和稀释200倍的唾液2mL。

向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。

将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。

待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。

待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。

添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。

观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。

三）唾液淀粒酶的活化和抑制

1、原理

酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。

氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。

2、器材

（1）恒温水浴

（2）试管及试管架

3、试剂和材料

（1）0.1％淀粉溶液150mL

（2）稀释200倍的新鲜唾液150mL

（3）1％氯化钠溶液50mL（4）1％硫酸铜溶液50mL

（5）1％硫酸钠溶液50mL（6）碘化钾—碘溶液100mL

4、操作

管号

0.1％淀粉溶液（mL）

1.5

稀释唾液（mL）

0.5

l％硫酸铜溶液（mL）

0.5

—

1％氯化钠溶掖（mL）

—

0.5

—

1％硫酸钠溶液（mL）

—

0.5

—

蒸馏水（mL）

—

0.5

37℃恒温水浴、保温10分钟

碘化钾—碘溶液（滴）

2～3

现象

解释结果；说明本实验第3管的意义。

（四）酶的专一姓

1.原理

酶具有高度的专一性。

本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。

淀粉和蔗糖无还原性。

唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。

蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。

用Benedict试剂检查糖的还原性。

2、器材．

（1）恒温水浴

（2）沸水浴（3）试管及试管架

3、试剂和材料

（1）2％蔗糖溶液150mL

（2）溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液150mL需新鲜配制

间隔各为1分钟。

将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒

温水浴中保温。

（3）稀释200倍的新鲜唾液100mL

（4）蔗糖酶溶液100mL

将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2～3次（离心法），然后放在滤纸上自然干燥。

取干酵母100g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。

离心，将上清液保存于冰箱中备用。

（5）Benedict氏试剂200mL

无水硫酸铜17.4g溶于100mL热水中，冷却后稀释至150mL。

取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600mL水共热，溶解后冷却并加水至850mL。

再将冷却的150mL硫酸铜溶液倾入。

本试剂可长久保存。

4、操作

（1）淀粉酶的专一性

管号

1％淀粉溶液（滴）

—

2%蔗糖溶液（滴）

—

稀释唾液（mL）

—

煮沸过的稀释唾液（mL）

—

蒸馏水（mL）

—

37℃恒温水浴15分钟

Benedict试剂（mL）

沸水浴2—3分钟

│现象

解释实验结果（提示：

唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶）。

（2）蔗糖酶的专一性

管号

1％淀粉溶液（滴）

—

2%蔗糖溶液（滴）

—

蔗糖酶溶液（mL）

—

煮沸过的蔗糖酶溶液（mL）

—

蒸馏水（mL）

—

37℃恒温水浴15分钟

Benedict试剂（mL）

沸水浴2—3分钟

│现象

解释实验结果。

思考题

1、什么是酶的最适温度及其应用意义?

2、什么是酶反应的最适pH?

对酶活性有什么影响?

3、什么是酶的活化剂?

4、什么是酶的抑制剂?

与变性剂有何区别?

5、本实验结果如何证明酶的专一性?

实验五菜花中核酸的分离和鉴定

一、目的

初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和RNA、DNA的定性检定。

二、原理

用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。

最后用浓盐溶液（10％氯化钠溶液）和0.5mol／L高氯酸（70℃）分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。

由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。

1、核糖的测定测定核糖的常用方法是苔黑酚（即3，5—二羟甲苯法）。

当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟甲苯在沸水浴中加热10—20分钟后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠

醛，后者再与3，5—二羟甲苯作用产生绿色物质。

DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。

2．脱氧核糖的测定测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。

含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。

这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω—羟基—6—酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。

100℃

DNA+二苯胺试剂蓝色物

此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。

上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。

三、器材

1．恒温水浴2．电炉3，离心机4．布氏漏斗装置

5．吸管6．烧杯7．量筒8．剪刀

四、试剂和材料

1、新鲜菜花2、95％已醇600mL3、丙酮400mL

4、5％高氯酸溶液200mL5、0.5mo1/L高氯酸溶液200mL

6、10％氯化钠溶液400mL

7、标准RNA溶液（5mg／l00mL）50mL

8、标准DNA溶液（15mg／100mL）50mL9．粗氯化钠250g

10．海砂5g11．二苯胺试剂60mL

将1g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入2.75mL浓硫酸（置冰箱中可保存6个月。

使用前，在室温下摇匀）。

12．三氯化铁浓盐酸溶液25mL

13．苔黑酚乙醇溶液200mL

1、核酸的分离

（1）取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL95%乙醇和400mg海砂，研磨成匀浆。

然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。

（2）滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。

（3）再向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5分钟后抽干（用力压滤渣，尽量除去丙酮）。

（4）在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL5％高氯酸溶液中。

搅拌，抽滤，弃去滤液。

（5）将滤渣悬浮于20mL95％乙醇中，抽滤，弃去滤液。

（6）滤渣中加人20mL丙酮，搅拌5分钟，抽滤至于，用力压滤渣尽量除去丙酮。

（7）将干燥的滤渣重新悬浮在40mL10％氯化钠溶液中。

在沸水浴中加热15分钟。

放置，冷却，抽滤，留滤液。

并将此操作重复进行一次。

将两次滤液合并，为提取物一。

（8）将滤渣重新悬浮在20mL0.5mol／L高氯酸溶液中。

加热到70℃、保温20分钟（恒温水浴）后抽滤，留滤液（提取物二）。

2．RNA，DNA的定性检定

（1）二苯胺反应

管号

蒸馏水（mL）

DNA溶液（mL）

RNA溶液（mL）

提取物一（mL）

摄取物二（mL）

二苯胺试剂（mL）

放沸水浴中10分钟后的现象

（2）苔黑酚反应

管号

蒸馏水（mL）

DNA溶液（mL）

RNA溶液（mL）

提取物一（mL）

摄取物二（mL）

三氯化铁浓盐酸溶液（mL）

苔黑酚乙醇溶液（mL）

0.2

放沸水浴中10分钟后的现象

思考题

1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?

本实验是怎样除掉的?

2．实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合物?

DNA产生

蓝色物质?

实验六紫外分光光度法测定核酸的含量

一、目的

1.了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

2.学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。

二、原理

核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。

RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波长处。

一般在A260nm波长下，每mL含1µgDNA溶液的光吸收值约为0.020，每mL含1µgRNA溶液的光吸收值约为0.022。

故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。

此法操作简便，迅速。

若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法预先除去。

三、器材

1.分析天平2.离心机

3.容量瓶4.紫外分光光度计

5.吸管6.冰浴或冰箱

四、试剂

1、5%～6%氨水

2、钼酸铵—高氯酸试剂（沉淀剂）如配制200mL可在193mL蒸馏水中加入7mL70%高氯酸和0.5g钼酸铵。

五、操作

1.用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。

然后用5%～6%氨水调至pH7，定容到50mL。

2.取2支离心管，向第一支管内加人2mL样品溶液和2mL蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。

混匀。

在冰浴或冰箱中放置30分钟后离心（3000r／min，10分钟）。

从第一管和第二管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。

用光程为1cm的石英比色杯，于260mn波长处测其光吸收值（A1和A2）。

六、计算

如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液（20～50µg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。

实验七总氮量的测定—凯氏定氮法

一、目的

学习凯氏定氮法的原理和操作技术。

二、原理

常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸）的含氮量。

含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

此过程通常称为“消化”。

但是，此反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。

甘氨酸的消化过程表示如下：

CH2NH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+NH3

2NH3+H2SO4—————（NH4）2SO4

弄浓

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸留到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据使用的标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。

三、仪器

1.50mL消化管或100mL凯氏烧瓶

2.改进型凯氏定氮仪

3．50mL容量瓶4．3mL微量滴定管

5．分析天平6．烘箱7．电炉8．1000mL蒸馏烧瓶

9.小玻璃珠10．远红外消煮炉

四、试剂

1.消化液（过氧化氢：

浓硫酸：

水二3：

2：

1）200mL

2．粉末硫酸钾—硫酸铜混合物16g

K2S04与CuS04·5H20以3：

1配比研磨混合。

3．30％氢氧化钠溶液1000mL

4．2％硼酸溶液500mL

5．标准盐酸溶液（约0

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