除非另有规定,RSD不能超过下表中的值。
此规定不适用于相关物质检测。
RelativeStandardDeviationRequirents
进样次数
314
5
6
B%
RSD上限
对称因子AS用于衡量峰的对称性,全对称时值为1。
拖尾越严重,
(见图4)。
偶尔也会有值小于果对称因子与1的差值越大,度越差。
信噪比(S/N)是系统适应性的一个重要参数,计算公式如下(图5):
系统适应性测试的数据通过重复进样标准品或者特定文件中规定的对照溶液而得到,
此文件中对相关参数的定义同样适用于其它操作条件,以下情况可做相应调整:
标准品(包括参考物质)对适应性测试中的所有化合物均适用
在系统适应性测试中为改进色谱系统性能而作适当调整
对色谱系统的调整不能弥补柱子和系统本身的缺陷。
HPLC:
以下调整限度适用于流
(比例小于等于50%。
这些组
30%范围内调整。
但是不能超过
为满足系统适应性要求而对分析方法调整时,除非另有规定,以下每个变量的最大值都应考虑;这些调整需要附加有效数据。
为验证新方法的系统适应性,需要对改变条件后的分析方法重新评价。
多处改动会对系统性能产生积累效果,在分析之前能仔细考虑。
在梯度洗脱中不推荐改变流动性组成,如果必须改变,则只对溶剂体积或滞后体积改变。
流动相pH(HPLC:
在配备流动相时,水相缓冲液的pH波动范围在正负0.2个单位缓冲液盐浓度(HPLC:
在满足pH值条件下,缓冲液中盐的浓度波动范围在士10%流动相的组成(动相中的小组分分的量可在正负总流动相的10%下面是两相体系和三相体系组分的调整范围。
两相体系:
溶剂比为50:
50时,50的30%!
15%超过了10%的限度,因此流动相比例只能在40:
60到60:
40范围内调整。
容积比为2:
98时,2的30%寸0.6%,因此改变范围在1.4:
98.6至q2.6:
97.4三相体系:
溶剂比为60:
35:
5时,第二组分35的30%时10.5%,超过10%的限度,只能在25%到45%的范围内改变。
第三组分5的30%!
1.5%。
加上组分一共同构成洗脱体系。
因此三相体系的比例变化范围是50:
45:
5至q70:
25:
5或者58.5:
35:
6.5至U
61.5:
35:
3.5。
紫外-可见光检测器的波长:
操作过程中不允许波长有误差,厂家或者其它机构对检测器波长的校正误差不超过3nm
固定相:
柱长:
可变范围为原柱长的士70%
柱内径(HPLC:
如果线速度恒定可做适当调节,
见流速项(HPLC下.
柱内径(GC:
调整范围为原柱内径的士50%薄膜厚度(毛细管GC:
调整范围为-50%到100%粒径(HPLC:
填料颗粒尺寸可以减小50%但
是不能增大。
粒径(GC:
在满足色谱系统适应性要求的情况下,粒径由大换小或者由小换大都可以,调料的粒径比率由最大颗粒的直径除以最小颗粒的直径而来。
流速(GC:
流速可调范围在士50%
流速(HPLC;柱子尺寸改变时,流速可由下式计算:
22
F2=F1|2d2/l1d1
F1是文件中规定的流速,单位是mL/min,F2是调整后的流速;l1是文件中规定的柱长,12是使用柱长;d1为文件中规定的柱内径,d2为使用柱内径。
流速可变范围是士50%进样体积(HPLC:
只要满足精密度和检测限,进样体积可以适当减少,但不能增加。
进样体积和分流体积(GC:
检测器和重现性较好时可做适当调整。
柱温(HPLC:
柱温波动范围在士10o进样口温度(GC:
可调范围士10o程序升温(GC:
温度可做适当改变,需要保持一定温度或者改变到另一温度值时,温度变化做大容许范围是士20o0
除非另有规定,系统适应性参数由待测物峰的数据计算、
样品的Rr,RF,tR实测值应与对照品的实测值一致,文件中给的相对保留时间值是为了方便峰的指认,对于相对保留时间没有评判标准。
适应性测试时为了确保最终操作结果的有效性。
实验过程中为确保系统适应性,进样前应做适当的准备工作。
配置待测溶液时,溶液中包括一定量的待测物和一些其它物质(如药品辅料或者杂质)。
当
色谱系统有显著变化时,或者要用特殊试剂,则要重新做系统适应性实验,否则不能进行样品分析。
欧洲药典
2246色谱分离技术
色谱分离技术是一种多级分离方法,品在固定相和流动相之间多次分配,态平衡。
固定相一般是附在硅胶或者其它固体载体上的固体或液体,可填充在层析柱上或铺在薄层版/薄膜上,流动相可以是气体、液体或者超临界流体。
分离原理包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱等,也可根据样品分子的大小、空间体积、
质量等物理化学性质来分离。
本章介绍了系统适应性测试涉及的参数定义及计算方法,分析方法和仪器介绍等已分别在以下章节做了介绍:
纸色谱2.2.26
样达到动
薄层色谱气相色谱液相色谱排阻色谱
分离度)。
操作人员有责任确认该计算方法是否符合欧洲药典要求,如果有差别,应对该方法做适当调整以符合药典规定。
色谱图
反应检测器的响应信号、洗脱剂浓度或体积
与时间的关系等。
理想的色谱图是在平稳的基线上各色谱峰彼此分离,呈高斯分布。
色谱峰
色谱柱中洗脱的单个组分或者未分离的多
个组分在检测器上的响应信号,是色谱图的一部分。
一般用峰面积、峰高h和半高峰宽州、峰高h和峰宽w等参数来描述色谱峰。
高斯峰有如下关系(图2.2.46-1):
M=1.18wi
保留时间tR
组分从进样到出现最大峰所需时间
保留体积Vr
组分从进样到出现最大峰所需的流动相体
积,可用保留时间乘以流速
Vr=tRXF
F。
死时间tM
Figuie2.2.46.-1.
不被固定相滞留的组分,从进样到出现最大
定义
下面分别介绍系统适应性和验收标准的相关参数定义。
有些仪器的软件系统包含了一些特定参数的计算方法(例如性噪比、
k'或者分配比Dm表示,计
K==kc
也叫平衡分配系数
Vm=tMXF
排阻色谱中用Vo表示(见下面)。
保留因子k有时用容量因子
算公式如下:
Kc表示分配常数,vs表示固定相体积VM表示流动相体积在色谱系统中某组分的保留因子也可按下式计算:
K=
流动相总时间tt,当组分粒径小于固定相胶体孔径的最小尺寸时,该组分从进样到出现最大峰所需时间(图2246-2)流动相总体积Vt,当组分粒径小于固定相胶体孔径的最小尺寸时,该组分从进样到出现最大峰所需流动相体积,可按下式计算
Vt=ttXF
滞留时间to:
当组分粒径大于固定相胶体孔径的最大尺寸时,该组分从进样到出现最大峰所需时间
滞留体积Vo:
当组分粒径大于固定相胶体孔径的最大尺寸时,该组分从进样到出现最大峰所需体积,可按下式计算
V0=t0XF
分配常数ko:
表示排阻色谱中某一组分的洗脱能力,也叫分配系数,可用下式计算:
Ko=
滞留因子Rf:
在平面色谱中也叫保留因子
LCandGC
decode更*0$应口
Time
Figure2.246.-2.
Rf,表示组分在板上的点到原点之间的距离与溶剂前沿到原点的距离的比值(图2.2.46-3)。
记录吸光度到达最大值的50%时的时间to.5
(图2.2.45-4)
D=tdXF
厂O——B
A.mobilephaseh-ontR.gtC.lineof-opplicjtiDn
Figure224E3
B是分析物的移动距离
A是溶剂前沿的移动距离
塔板数N:
可反映柱效,又叫理论塔板数,计算公式如下:
2
N=5.54()
tR是组分的保留时间,Wh是该物质的半高峰宽
色谱柱类型、柱温、流动相以及化合物类型都会影响理论塔板数的值
滞后体积D:
也叫梯度延迟体积,指从流动
tD=t0.5-tG,
tG预设为20min
F为流速,单位为对称因子A色谱峰的对称因子算
ml/min
(图2246-5)按下式计
As=
W0.05表示在二十分之一峰高处峰宽
d表示二十分之一峰高处到峰顶点投射到水
平线之间的距离
As值为1表示峰绝对对称,大于1则为拖尾峰,小于1则为前置峰
相混合点至柱头的系统体积,
可用以下方法
两组分之间的分离度(2.2.46-1
)计算公式
计算:
如下
色谱柱:
用适当的毛细管(如
1mx0.12mm
Rs=
代替
tR2>tR1
流动相:
A相是水,
B相是0.1%(V/V)的丙
tR1和tR2是色谱峰的保留时间
酮水
州1和W12是半高峰宽
流速F:
能达到足够的反压为准
(如2ml/min)
在定量平面色谱中,用移动距离代替保留时
时间minA相体积百
B相体积百
间来计算两组分之间的分离度,
计算公式如
分比
分比
下:
0-20
100T0
07100
艮=
20-30
0
100
Rf1和R2是色谱峰的阻滞因子
检测器:
检测波长
265nm
W和W12是半高峰宽
分离度RS
a是溶剂前沿到基线的距离
峰谷比(p/v)
做有关物质的系统适应性测试时,如果两峰之间的基线分离效果不好,可以用峰谷比作为评价依据(图2.2.46-6)。
峰高或者
p/v=p/v
H表示基线以上最小峰的最高点到基线的距离
HV表示基线以上最小峰和主峰之间的最低点到基线的距离
相对标准偏差的百分数。
计算公式如下:
Sr(%=
yi表示内部标准方法中的峰面积、面积比的值表示平均值n表示值的个数
FlgmI'2
相对保留因子r
相对保留因子的计算公式如下:
r=
tRi表示待测峰的保留时间tRst表示参照峰的保留时间tM表示滞留时间
未调整相对保留因子rG计算公式如下:
rG=
除非另有规定,相对保留因子和未调整的相对保留因子的值基本一致
在平面色谱中,用滞留因子Rst和RFi代替保留时间tRst和tRi
信噪比(S/N)
小的噪音峰会影响定量分析的精密度。
信噪
比计算公式如下:
S/N=
H表示组分的峰高,在参比溶液的色谱图中,测量从信号峰的最高点到基线之间的距离。
该信号峰的峰宽至少大于半高峰宽的5倍
(图2.2.46-7)。
h表示色谱图中噪音峰的最高点到最低点之
间的距离系统重现性系统重复性表示至少连续进样三次后,所得
系统适应性
用于测试的成分应该明确,能满足系统性能
和含量测定的要求。
系统适应性测试反映了色谱系统的性能,是
建立分析方法不可或缺的一部分。
柱效、保
留因子、分离度、相对保留因子和对称因子等参数用来描述柱子的性能。
这些参数可能从以下方面影响色谱行为:
-流动相的组成、离子强度、温度和pH值
-流速、色谱柱尺寸、柱温和柱压
-固定相特性,包括填充剂类型、填充剂粒径、孔径、比表面积
-反相材料类型或者对固定相表面进行
其它的结构修饰
除非另有规定,还需满足以下要求:
-在相关物质测定或含量测定中,用于定量的参照色谱峰,其对称因子取值范围必须在0.8到1.5之间
-如果某成分的纯度为100%则可容许的参比溶液的相对标准偏差最大值计算公式如下:
Sr(%max=
K是常数0.349,由公式K=计算而来,表示当B=1.0时,六次进样后的相对标准偏差百分数
B表示方法中规定的含量上限减去100%
n表示进样次数(36)
t90%,n-1表示双侧检验、置信度为90%自由
度为n-1时的t值
除非另有规定,可允许的相对标准偏差最大值不能超过下表(表2.2.46-1)的值,此规定不适用于有关物质测试。
表2.2.46-1重复性要求
进样次数
3
4
5
6
B(%
最大容许标准偏差
2.0
0.41
0.59
0.73
0.85
2.5
0.52
0.31
092
1.06
3.0
0.62
0.89
1.10
1.27
测试有关物质时,定量限度与此表相等或小于表中数值测试员要根据一些致变因素来选择合适的方案验证色谱系统,以保证在测试过程中色谱系统的适应性不受影响。
色谱条件的调整
为满足系统适应性,在不对分析方法做根本改变的情况下,可对色谱参数做适当调整。
在梯度洗脱时,改变洗脱条件会导致基线漂移,不利于色谱峰的划分识别,甚至会出现假峰和延长洗脱时间。
因此要改变梯度洗脱的条件时,需重新验证方法的有效性。
系统适应性是定性分析或含量测定结果的有效保障。
市售液相色谱柱的固定相材料类型多样,可满足不同色谱行为需要,为满足系统适应性要求,可对色谱条件做适当调整。
但是在反相色谱系统中,调整色谱参数不能总是达到既定要求,这时可选择替换色谱柱。
网站EDQM上有各种柱子的性能信息,可根据分析需要选择合适的色谱柱。
一般文件会明确规定一些重要参数以满足系统适应性。
薄层色谱和纸色谱
展开剂的组成:
对其中较少的组分,调整范围为相对差值±30%或绝对差值±2%可选其中较大的一种,但任何组分的绝对差值不得超过±10%例如含量为10%勺组分,按相对差值±30%十算其可调范围在绝对差值±2%十算可调范围在按相对差值计算的范围来调整。
7%-13%按
8%-12%固可
假如一组分
含量为5%按相对差值计算其可调范围在
3.5-6.5%,按绝对差值计算其可调范围在3-7%,此时可按绝对差值范围调整,但是改变范围绝对不能超过10%
除非另有规定,流动相水相pH值可调范围在±0.2个单位,非离子溶剂可调范围在±1个单位。
缓冲溶液中的盐浓度可调范围在±10%点样体积:
如果薄层板或层析纸的粒度良好
(2-10卩m),点样体积可为规定的10-20%液相色谱:
等度洗脱
30%或绝对差值±2%可选其
但任何组分的绝对差值不得
流动相水相pH值可调范围
流动相组成:
对其中较少的组分,调整范围为相对差值±中较大的一种,超过±10%除非另有规定,在±0.2个单位,非离子溶剂可调范围在±1个单位。
缓冲溶液中的盐浓度可调范围在±10%
流速:
一般可在±50%范围内调整,如果改用大尺寸的柱子,调整范围可适当加大。
色谱柱参数固定相:
-不能改变固定相填料类型(例如不能用C8柱替换C18柱)
-粒径:
最多可将粒径减小到原来的50%,
但是不能增加填料粒径
色谱柱尺寸:
-长度:
可调范围±
-内径:
可调范围±如果色谱柱尺寸改变,做适当调整:
50%
25%
流速也需按以下公式
F2=F1
F1:
方法中规定的流速,单位ml/min
F2:
改变后的流速,单位ml/min
I1:
方法中规定的柱长,单位mm
I2:
改变后的柱长,单位mm
d1:
方法中规定的柱内径,单位mm
d2:
改变后的柱内径,单位mm
柱温:
±10C,除非另有说明,操作时的柱温需明确规定
检测波长:
不能改变
进样体积:
在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积,但不能增加进样体积液相色谱:
梯度洗脱
梯度洗脱不像等度洗脱,要改变洗脱条件的话需要慎重考虑流动相:
只有在满足下列条件时才可对流动相组成做微小调整:
-满足系统适应性要求
-主峰的洗脱时间改变范围不超过方法中规定的±15%
-改变后的流动相洗脱能力不能比方法中规定的差
如果改变条件不能满足系统适应性要求,需考虑滞留体积和换色谱柱滞留体积:
实验仪器的布局能显著改变分离度、保留时间和相对保留时间等。
如有此情况,可能是滞留体积过大。
在开始梯度洗脱程序之前,会有一段等度洗脱过程。
考虑到规定的方法与实际使用方法中的滞留体积有差异,可在等度洗脱时调整开始梯度洗脱的时间。
测试员有责任使等度洗脱时间适应所用的分析仪器。
如果方法中规定了滞留体积,梯度洗脱的开始时间可根据下面公式换成实际开始时间:
tc=t-
D:
滞留体积,单位ml
D:
实际滞留体积,单位ml
F:
流速,单位ml/min
如果没有等度洗脱这个步骤也不影响数据的有效性,那么此步骤可以省略流动相pH,不能改变缓冲液盐浓度:
不能改变
流速:
色谱柱尺寸改变时可改变流速(公式
见前面)色谱柱参数固定相:
-不能改变填料类型
-不能改变粒径大小色谱柱尺寸:
-长度:
可调范围±
-内径:
可调范围±如果色谱柱尺寸改变,做适当调整:
70%
25%
流速也需按以下公式
F2=Fi
Fi:
方法中规定的流速,单位ml/min
F2:
改变后的流速,单位ml/min
11:
方法中规定的柱长,单位mm
l2:
改变后的柱长,单位mmdi:
方法中规定的柱内径,单位mm
d2:
改变后的柱内径,单位mm柱温:
±5C,除非另有说明,操作时的柱温需明确规定检测波长:
不能改变进样体积:
在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积,但不能增加进样体积气相色谱色谱柱参数固定相:
-粒径:
(填充柱)最多可减少50%不能增大粒径尺寸
-薄膜厚度:
(毛细管柱)可调范围从-50%到+100%
色谱柱尺寸:
-长度:
可调范围±
-内径:
可调范围±
流速:
±50%柱温:
±10%进样体积和分流体积:
70%
50%
在满足检测限和重现
性的情况下可做适当调整超临界流体色谱流动相组成:
填充色谱中,对其中较少的组分,调整范围为相对差值±30%或绝对差值
±2%可选其中较大的一种,但是毛细管色谱系统不能调整流动相。
色谱柱参数固定相:
-粒径:
(填充柱)最多可减少50%不能增大粒径尺寸色谱柱尺寸:
-长度:
可调范围±
-内径:
可调范围±
可调范围±
70%
525%(填充柱)
50%(毛细管柱)
流速:
一般可在±50%范围内调整柱温:
±5C,除非另有说明,操作时的柱温需明确规定进样体积:
在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积,但不能增加进样体积定量分析定量分析中,流动相中各溶剂或者试剂产生的色谱峰可以忽略。
-检测器灵敏度。
检测器灵敏度是指单位
浓度或质量的物质在检测器上的信号输出。
相对检测响应因子,一般叫响应因子,表示某组分与标准物质的绝对响应因子之比,也称作校正因子
-外标法。
通过比较待测物质和参考物质的色谱峰面积来计算待测物浓度
-内标法。
将一定重量的纯物质作为内标
物加到分析样品混合物和参照物中的分析方法。
内标物的选择要符合一些要求:
不与待测物发生化学反应,性质稳定,能与其它杂质有效分离,该物质色
谱峰不会与杂质或待测物质色谱峰重
合。
通过比较测试液中待测物与内标物的峰面积/峰高比和参比液中待测物与内标物的峰面积/峰高比来计算待测物浓度
-标准化程序。
某物质的百分含量为该峰
的峰面积占所有峰的峰面积的比例,计
算时应排除溶剂峰和流动相中所含物质的色谱峰,还有检测限以下的峰。
-校正程序。
某物质测量值/预测值与量
(浓度、质量等)的关系符合校正函数。
待测物质的分析结果可根据校正函数
的反函数计算。
用外标法做有关物质测定时,如果用测试液的稀释液做对照,并采用标准化程序测试,就采用方法中规定的校正因子(例如:
响应
因子不在0.8-1.2的范围内)有关物质测定中,指定总杂质或有杂质的定量测定时,选择合适的起始点和条件对峰面积的积分非常重要。
在此类测试中,报告限
(峰面积小于等于此限度就忽略),一般设
为0.05%。
因此系统设定的数据收集限度至少大于报告限的二分之一。
任何不能完全与主峰分离的杂质峰积分范围为基线以上峰谷到峰谷之间的面积。