核酸的生物合成.docx

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核酸的生物合成

第九章核酸的生物合成

一、知识要点

在细胞分裂过程中通过..DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发育过程中遗传信息由..DNA传递到..RNA，最后翻译成特异的蛋白质；在..RNA病毒中..RNA具有自我复制的能力，并同时作为..mRNA，指导病毒蛋白质的生物合成；在致癌..RNA病毒中，..RNA还以逆转录的方式将遗传信息传递给..DNA分子。

这种遗传信息的流向称为中心法则。

复制是指以原来..DNA分子为模板，合成出相同..DNA分子的过程；转录是在..DNA（或..RNA）分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的..RNA（或..DNA）的过程；翻译是在以rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体上，以..mRNA为模板，根据每三个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由..tRNA运送氨基酸，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。

（一）..DNA的生物合成

在..DNA复制时，亲代..DNA的双螺旋先行解旋和分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链，这样从亲代..DNA的分子可以精确地复制成..2个子代..DNA分子。

每个子代..DNA分子中，有一条链是从亲代..DNA来的，另一条则是新形成的，这叫做半保留复制。

通过..14N和15N标记大肠杆菌实验证实了半保留复制。

..

1．复制的起始点与方向..

DNA分子复制时，在亲代分子一个特定区域内双链打开，随之以两股链为模板复制生成两个子代..DNA双链分子。

开始时复制起始点呈现一叉形（或..Y形），称之为复制叉。

..DNA复制要从..DNA分子的特定部位开始，此特定部位称为复制起始点（..originofreplication），可以用..ori表示。

在原核生物中复制起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有一个起始点。

真核生物的染色体是在几个特定部位上进行..DNA复制的，有几个复制起始点的。

酵母基因组与真核生物基因组相同，具有多个复制起始点。

复制的方向可以有三种不同的机制。

其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方向生长出一条新链，形成两个复制叉。

其二是从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。

其三是从一个起始点开始，沿两个相反的方向各生长出两条链，形成两个复制叉。

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2．DNA聚合反应有关的酶及相关蛋白因子..

DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了需要酶的催化之外，还需要适量的..DNA为模板，..RNA（或..DNA）为引物和镁离子的参与。

催化这个反应的酶也有多种：

..DNA聚合酶、..RNA引物合成酶（即引发酶）、DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因子参与。

..

3．DNA的复制过程..

DNA的复制按一定的规律进行，双螺旋的..DNA是边解开边合成新链的。

复制从特定位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。

由于..DNA双链的合成延伸均为..5′→3′的方向，因此复制是以半不连续的方式进行，即其中一条链相对地连续合成，称之为领头链，另一条链的合成是不连续的，称为随后链。

在..DNA复制叉上进行的基本活动包括双链的解开；..RNA引物的合成；..DNA链的延长；切除..RNA引物，填补缺口，连接相邻的..DNA片段。

（二）逆向转录

在逆转录酶作用下，以..RNA为模板，按照..RNA中的核苷酸顺序合成..DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从..DNA到RNA的方向相反，故称为逆向转录。

逆转录酶需要以..RNA（或..DNA）为模板，以四种..dNTP为原料，要求短链..RNA（或..DNA）作为引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子..Mg2+和Mn2+，沿..5′→3′方向合成..DNA，形成RNA-DNA杂交分子（或..DNA双链分子）。

逆转录酶是一种多功能酶，它除了具有以..RNA为模板的..DNA聚合酶和以..DNA为模板的..DNA聚合酶活性外还兼有..RNaseH、DNA内切酶、..DNA拓扑异构酶、..DNA解链酶和..tRNA结合的活性。

几乎所有真核生物的..mRNA分子的..3′末端都有一段多聚腺苷酸。

当加入寡聚..dT作引物时，..mRNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的..DNA，称为..cDNA。

（三）DNA突变..

DNA突变是指..DNA的碱基顺序发生突然而永久性地变化，从而影响..DNA的复制，并使..DNA的转录和翻译也跟着改变，表现出异常的遗传特征。

..DNA的突变可以有几种形式

（1）一个或几个碱基对被置换；

（2）插入一个或几个碱基对；（3）一个或多个碱基对缺失。

置换和插入的变化是可逆的，缺失则是不可逆的。

最常见的突变形式是碱基对的置换。

嘌呤碱之间或嘧啶碱之间的置换称为转换，嘌呤和嘧啶之间的置换称为颠换。

突变有自发突变和诱发突变。

在..DNA的合成中，自发突变的机率很低，大约每..109个碱基对发生一次突变；各种..RNA肿瘤病毒具有很高的自发突变频率。

诱发突变可以由物理因素或化学因素引起，物理因素如电离辐射和紫外光等均可以诱发突变。

化学因素的诱变，如脱氨剂和烷化试剂可诱发突变。

亚硝酸为强脱氨剂，可使腺嘌呤转变为次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤，胞嘧啶转变为尿嘧啶，而导致碱基配对错误。

烷化剂如硫酸二甲酯（..DMS）可使鸟嘌呤的..N7位氮原子甲基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团，减弱..N9位上的..N-糖苷键，至使脱氧核糖苷键不稳定，发生水解而丢失嘌呤碱，以后可被其它碱基取代，或引起..DNA的链断裂。

（四）..DNA损伤与修复

某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能引起生物突变和致死。

因为它们均能作用于..DNA，造成其结构和功能的破坏。

但细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去..DNA上的损伤，恢复..DNA的正常双螺旋结构。

目前已经知道有四种修复系统：

光复活，切除修复，重组修复和诱导修复。

后三种机制不需要光照，因此又称为暗修复。

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1．光复活

光复活的机制是可见光（最有效波长为..400nm左右）激活了光复活酶，它能分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。

光复活作用是一种高度专一的修复方式。

..

2．切除修复

又称为复制前修复。

所谓切除修复，即是在一系列酶的作用下，将..DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使..DNA恢复正常结构的过程。

这是比较普遍的一种修复机制，它对多种损伤均能起修复作用。

参与切除修复的酶主要有：

特异的核酸内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶。

..

3．重组修复

遗传信息有缺损的子代..DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从完整的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。

此过程称为重组修复，因为发生在复制之后，又称为复制后修复。

参与重组修复的酶系统包括与重组有关的主要酶类以及修复合成的酶类。

重组基因..ecA编码的蛋白质，具有交换..DNA链的活力。

..recA蛋白被认为在..DNA重组和重组修复中均起着关键的作用。

..recB和recC基因分别编码核酸外切酶..V的两个亚基，该酶亦为重组和重组修复所必需。

修复合成时需要..DNA聚合酶和连接酶。

..

4．诱导修复

许多能造成..DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（..SOSresponse）。

SOS反应包括诱导出现的..DNA损伤修复效应、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等等。

（五）RNA的生物合成

以DNA的一条链为模板在..RNA聚合酶催化下，以四种核糖核苷磷酸为底物按照碱基配对原则，形成..3′→5′磷酸二酯键，合成一条与..DNA链的一定区段互补的..RNA链的过程称为转录。

..RNA的转录起始于..DNA模板的一个特定位点，并在另一位点处终止。

在生物体内，..DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，这称为转录的不对称性。

用作模板的链称为反义链，另一条链称为有义链，因为有义链的脱氧核苷酸序列正好与转录出的..RNA的核苷酸序列相同（只是..T与..U的区别），所以也称编码链。

但各个基因的有义链不一定位于同一条..DNA链。

..RNA的合成沿..5′→3′方向进行（..DNA模板链方向为..3′→5′），5..未端为核糖核苷三磷酸，即..5..位保留..PPP。

在真核生物细胞里，转录是在细胞核内进行的。

合成的..RNA包括..mRNA、rRNA和tRNA的前体。

..rRNA的合成发生在核仁内，而合成..mRNA和tRNA的酶则定位在核质中。

另外叶绿体和线粒体也进行转录。

原核细胞中转录酶类存在于细胞液中。

..

1．RNA聚合酶

原核细胞大肠杆菌的..RNA聚合酶研究的较深入。

这个酶的全酶由..5种亚基（α..2β..β..δω）组成，还含有..2个..Zn原子。

在..RNA合成起始之后，δ因子便与全酶分离。

不含δ因子的酶仍有催化活性，称为核心酶。

δ亚基具有与启动子结合的功能，β亚基催化效率很低，而且可以利用别的..DNA的任何部位作模板合成..RNA。

加入δ因子后，则具有了选择起始部位的作用，δ因子可能与核心酶结合，改变其构象，从而使它能特异地识别..DNA模板链上的起始信号。

真核细胞的细胞核内有..RNA聚合酶..I、II和III，通常由..4～6种亚基组成，并含有..Zn2+。

RNA聚合酶..I存在于核仁中，主要催化..rRNA前体的转录。

..RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ存在于核质中，分别催化..mRNA前体和小分子量..RNA的转录。

此外线粒体和叶绿体也含有..RNA聚合酶，其特性类似原核细胞的..RNA聚合酶。

..

2．RNA的转录过程..

RNA转录过程为起始位点的识别、起始、延伸、终止。

起始位点的识别：

..RNA聚合酶先与..DNA模板上的特殊启动子部位结合，σ因子起着识别..DNA分子上的起始信号的作用。

在σ亚基作用下帮助全酶迅速找到启动子，并与之结合生成较松弛的封闭型启动子复合物。

这时酶与..DNA外部结合，识别部位大约在启动子的..-35位点处。

接着是..DNA构象改变活化，得到开放型的启动子复合物，此时酶与启动子紧密结合，在..-10位点处解开..DNA双链，识别其中的模板链。

由于该部位富含A-T碱基对，故有利于..DNA解链。

开放型复合物一旦形成，..DNA就继续解链，酶移动到起始位点。

..

3．起始：

在起始位点的全酶结合第一个核苷三磷酸。

第一个核苷三磷酸常是..GTP或ATP。

形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷酸掺入的位置称为转录起始点。

这时σ亚基被释放脱离核心酶。

..

4．延伸：

从起始到延伸的转变过程，包括σ因子由缔合向解离的转变。

..DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与..DNA的结合松弛，核心酶可沿模板移动，并按模板序列选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的..RNA链的..3′-OH端，催化形成磷酸二酯键。

转录延伸方向是沿..DNA模板链的..3′→5′方向按碱基酸对原则生成..5′→3′的..RNA产物。

..RNA链延伸时，..RNA聚合酶继续解开一段..DNA双链，长度约..17个碱基对，使模板链暴露出来。

新合成的..RNA链与模板形成..RNA-DNA的杂交区，当新生的..RNA链离开模板..DNA后，两条..DNA链则重新形成双股螺旋结构。

..

4．终止在..DNA分子上有终止转录的特殊碱基顺序称为终止子（..terminators），它具有使..RNA聚合酶停止合成..RNA和释放..RNA链的作用。

这些终止信号有的能被..RNA聚合酶自身识别，而有的则需要有ρ因子的帮助。

ρ因子是一个四聚体蛋白质，它能与..RNA聚合酶结合但不是酶的组分。

它的作用是阻..RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的..RNA链。

对于不依赖于ρ因子的终止子序列的分析，发现有两个明显的特征：

即在..DNA上有一个..15～20个核苷酸的二重对称区，位于..RNA链结束之前，形成富含..G-C的发夹结构。

接着有一串大约..6个A的碱基序列它们转录的..RNA链的末端为一连串的..U。

寡聚..U可能提供信号使..RNA聚合酶脱离模板。

在真核细胞内，..RNA的合成要比原核细胞中的复杂得多。

（六）转录后加工

在转录中新合成的..RNA往往是较大的前体分子，需要经过进一步的加工修饰，才转变为具有生物学活性的、成熟的..RNA分子，这一过程称为转录后加工。

主要包括剪接、剪切和化学修饰。

..

1．mRNA的加工在原核生物中转录翻译相随进行，多基因的..mRNA生成后，绝大部分直接作为模板去翻译各个基因所编码的蛋白质，不再需要加工。

但真核生物里转录和翻译的时间和空间都不相同，..mRNA的合成是在细胞核内，而蛋白质的翻译是在胞质中进行，而且许多真核生物的基因是不连续的。

不连续基因中的插入序列，称为内含子；被内含子隔开的基因序列称为外显子。

一个基因的外显子和内含子都转录在一条很大的原初转录本..RNA分子中..,故称为核内不均一..RNA（hnRNA）。

它们首先降解为分子较小的..RNA再经其它修饰转化为..mRNA。

真核细胞..mRNA的加工包括：

（1）hnRNA被剪接，除去由内含子转录来的序列，将外显子的转录序列连接起来。

（2）在..3′末端连接上一段约有..20～200个腺苷酸的多聚腺苷酸（..polyA）的“尾巴”结构。

不同..mRNA

的长度有很大差异。

（3）在..5′末端连接上一个“帽子”结构..m7GpppmNP。

（4）在内部少数腺苷酸的腺嘌呤..6位氨基发生甲基化（..m6A）.

2．tRNA的加工原核生物的..tRNA基因的转录单元大多数是多基因的。

不但相同或不同的..tRNA的几个基因可转录在一条..RNA中，有的..tRNA还与..rRNA组成转录单元，因此..tRNA前体的加工过程包括剪切、剪接，在..3′-末端添加..CCAOH、以及核苷酸修饰转化为成熟的..tRNA。

tRNA中含有许多稀有碱基，所有这些碱基均是在转录后由四种常见碱基经修饰酶催化，发生脱氨、甲基化、羟基化等化学修饰而生成的。

..小碎片→..5SrRNA原核生物..16SrRNA和23SrRNA含有较多的甲基化修饰成分，特别是..2-甲基核糖。

一般5SrRNA中无修饰成分。

在真核细胞中..rRNA的转录后加工与原核细胞类似，但更为杂。

..rRNA在核仁中合成，生成一个更大..35～45S前体..rRNA。

前体分裂而转变为..28S、

3．rRNA的加工原核细胞首先生成的是..30S前体..rRNA，经核糖核酸酶作用，逐步裂解为..16S、23S和5S的rRNA，其裂解过程可归纳如下：

..17.5S→16SrRNA30S25S→23SrRNA18S和5.8S的rRNA分子。

真核生物..5SrRNA前体是由独立于上述三种..rRNA之外的基因转录的。

真核生物..rRNA中与含有较多的甲基化成分。

有关..RNA剪接、剪切机制的研究不仅发现了..RNA分子本身具有催化功能，这种具有剪接功能的..RNA催化剂命名为核酶。

目前已发现的具有催化功能的..RNA有磷酸二酯酶（核糖核酸酶）、磷酸单酯酶、核苷酸转移酶、磷酸转移酶、..RNA限制性内切酶、..tRNA5′端成熟酶、α..-1,4-葡聚糖分支酶和肽基转移酶等。

目前研究表明核酶催化..rRNA、..tRNA、mRNA的剪接机理是不相同的。

..RNA内含子有四种类型，即Ⅰ型自我拼接内含子、Ⅱ型自我拼接内含子、核..mRNA内含子和核..tRNA内含子。

（七）

RNA的复制

大多数生物的遗传信息贮藏的..DNA中，遗传信息按中心法则由..DNA转录成..RNA，再由..RNA翻译成蛋白质的。

对..RNA病毒的研究表明，某些..RNA病毒是以..RNA作模板复制出病毒..RNA分子。

..Qβ噬菌体..RNA的复制可分为两个阶段：

（1）当..Qβ噬菌体染大肠杆菌细胞后，其单链..RNA充当..mRNA，利用宿主细胞中的核糖体合成噬菌体外壳蛋白质和复制酶β亚基；

（2）当复制酶的β亚基和宿主细胞原有的α、γ、δ亚基自动装配成..RN复制酶以后，就进行..RNA复制。

以侵染的噬菌体..RNA作模板，通过..RNA复制酶合互补的RNA链。

常把具有..mRNA功能的链称为正链，与它互补的链称为负链。

在噬菌体异的复制酶装配好后不久酶就吸附到正链..RNA的3′末端，以它为模板合成出负链，至合成结束，然后负链从正链模板上释放出来。

同一个酶又吸附到负链..RNA的3′末端，合成出病毒正链..RNA，正链..RNA与外壳蛋白装配成噬菌体颗粒，所以正链和负链的合成方向都是由..5′→3′。

（八）基因工程的操作技术

1．目的基因

体外操作..DNA的主要步骤之一是提取载体..DNA和所需要的外源目的基因。

在细胞中..DNA并非以游离态分子存在，而是和..RNA及蛋白质结合在一起形成复合体。

..DNA纯化的基本步骤是：

（1）从破坏的细胞壁和膜里释放出可溶性的..DNA；

（2）通过变性或蛋白质分解，使..DNA和蛋白质的复合体解离；（3）将..DNA从其它大分子中分离出来；（4）DNA浓度和纯度的光学测定。

..

2．载体

外源..DNA片段（目的基因）要进入受体细胞，必须有一个适当的运载工具将带入细胞内，并载着外源..DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体。

载体必须具备下列条件：

（1）在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。

所以载体本身必须是一个复制单位，称复制子（..replicon），具有复制起点。

而且插入外源..DNA后不会影响载体本身复制的能力。

（2）易于鉴定、筛选。

也就是说，容易将带有外源..DNA的重组体与不带外源..DNA的载体区别开来。

（3）易于引入受体细胞。

常用的载体主要有以下几类：

细菌和酵母的质粒，λ噬菌体和M13以及病毒。

..

3．连接

外源DNA与载体DNA之间可以通过多种方式相连接，主要有以下几种

（1）粘性末端连接；

（2）平头末端连接；（3）接头连接等。

..

4．转化

任何外源DNA重组到载体上，然后转入受体细胞中复制繁殖，这一过程称为DNA的克隆。

外源..DNA进入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程称为转化。

转化作用是将外源DNA引入细胞的过程。

..

5．筛选由于细胞转化的频率较低，所以从大量的宿主细胞中筛选出带有重组体的细胞并不是很容易的，当前，在实验室中，常用的筛选手段有以下几种：

（1）插入失活；

（2）菌落原位杂交；（3）免疫学方法．此外，对重组体转化的鉴定还可以采用表现型的鉴定；对重组质粒纯化并重新转化；限制性酶切图谱的绘制；重组质粒上的基因定位等更深入的方法。

二、习题

（一）名词解释

1．半保留复制：

双链DNA的复制方式，其中亲代链分离，每一子代DNA分子由一条

亲代链和一条新合成的链组成。

2．不对称转录：

转录通常只在DNA的任一条链上进行，这称为不对称转录。

3．逆转录：

Temin和Baltimore各自发现在RNA肿瘤病毒中含有RNA指导的DNA聚

合酶，才证明发生逆向转录，即以RNA为模板合成DNA。

4．冈崎片段：

一组短的DNA片段，是在DNA复制的起始阶段产生的，随后又被连接

酶连接形成较长的片段。

在大肠杆菌生长期间，将细胞短时间地暴露在氚标记的胸

腺嘧啶中，就可证明冈崎片段的存在。

冈崎片段的发现为DNA复制的科恩伯格机理

提供了依据。

5．复制叉：

复制DNA分子的Y形区域。

在此区域发生链的分离及新链的合成。

6．领头链：

DNA的双股链是反向平行的，一条链是5/→3/方向，另一条是3/→5/方向，

上述的起点处合成的领头链，沿着亲代DNA单链的3/→5/方向（亦即新合成的DNA

沿5/→3/方向）不断延长。

所以领头链是连续的。

7．随后链：

已知的DNA聚合酶不能催化DNA链朝3/→5/方向延长，在两条亲代链起

点的3/端一侧的DNA链复制是不连续的，而分为多个片段，每段是朝5/→3/方向进

行，所以随后链是不连续的。

8．有意义链：

即华森链，华森..克里格型DNA中，在体内被转录的那股DNA链。

简写为Wstrand。

9．光复活：

将受紫外线照射而引起损伤的细菌用可见光照射，大部分损伤细胞可以恢

复，这种可见光引起的修复过程就是光复活作用。

10．重组修复：

这个过程是先进行复制，再进行修复，复制时，子代DNA链损伤的对

应部位出现缺口，这可通过分子重组从完整的母链上，将一段相应的多核苷酸片段

移至子链的缺口处，然后再合成一段多核昔酸键来填补母链的缺口，这个过程称为

重组修复。

11．内含子：

真核生物的mRNA前体中，除了贮存遗传序列外，还存在非编码序列，

称为内含子。

12．外显子：

真核生物的mRNA前体中，编码序列称为外显子。

13．基因载体：

外源DNA片段（目的基因）要进入受体细胞，必须有一个适当的运载

工具将带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载

体。

14．质粒：

是一种在细菌染色体以外的遗传单元，一般由环形双链DNA构成，其大小

从1.200Kb。

（二）填空题

1．DNA复制是定点双向进行的，股的合成是，并且合成方向和复制叉移动方向相同；股的合成是的，合成方向与复制叉移动的方向相反。

每个冈崎片段是借助于连在它的末端上的一小段而合成的；所有冈崎片段链的增长都是按方向进行。

..

2．DNA连接酶催化的连接反应需要能量，大肠杆菌由供能，动物细胞由

供能。

..

3．大肠杆菌RNA聚合酶全酶由组成；核心酶的组成是。

参与识别起始信号的是因子。

..

4．基因有两条链，作为模板指导转录的那条链称链。

..

5．以RNA为模板合成DNA称，由酶催化。

..

6．DNA或UpGpCpA分别经0.3NKOHR、NaseT1和牛胰RNaseI处理所得结果：

..

DNA:

0.3NKOH：

；RNaseT1：

；RNaseI：

;UpGpCpA：

0.3NKOH：

；RNaseT1：

；RNaseI：

。

..

7．基因突变形式分为：

，，和四类。

..

8．亚硝酸是一个非常有效的诱变剂，因为它可直接作用于..DNA，使碱基中基氧化成基，造成碱基对的。

..

9．所有冈崎片段的延伸都是按方向进行的。

..

10．前导链的合成是的，其合成方向与复制叉移动方向；随后链的合成是的，其合成方向与复制叉移动方向。

..

11．引物酶与转录中的..RNA聚合酶之间的差别在于它对不敏感，并可以作为底物。

..

12．DNA聚合酶I的催化功能有、、、

和。

..

13．DNA回旋酶又叫，它的功能是。

..

14．细菌的环状DNA通常在一个开始复制，而真核生物染色体中的线形DNA可以在起始复制。

..

15．大肠杆菌..DNA聚合酶Ⅲ的活性使之具有功能，极大地提高了..DNA复制的保真度。

..

16．大肠杆菌