论文题目小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺.docx
《论文题目小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《论文题目小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
论文题目小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺
论文题目：
小型猪牙齿相关干细胞介导的实验性牙周炎骨缺损修复及生物牙根再生体内实验研究
作者简介：
刘怡，女，1972年9月出生，2003年8月师从于首都医科大学口腔医学院王松灵教授，于2006年6月获博士学位
中文摘要
牙周炎很常见，常引起牙周骨缺损，是导致牙齿缺失的主要原因之一。
目前临床上牙周炎致骨缺损的治疗是一个难题。
牙齿缺失也很常见，目前临床上均是赝复体修复，缺乏真正意义上的生物修复。
牙齿相关干细胞及组织工程技术为新的生物性修复再生牙周组织及其牙齿提供了可能。
本研究利用与人类牙颌系统相似的小型猪作为大型动物模型，首先分离培养小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞，研究其生物学特性，并建立稳定可靠的牙周炎骨缺损模型，探讨牙周膜干细胞修复实验性牙周炎骨缺损的能力；同时利用牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞复合生物支架材料进行生物牙根再生。
本研究旨在为利用牙齿相关干细胞结合组织工程技术进行牙周再生修复及生物性牙齿再生修复提供大型动物的实验依据。
本研究包括以下三部分。
第一部分小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞体外分离培养及生物学特性研究
目的：
分离培养小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞，研究其生物学特性，为利用干细胞进行牙周及牙根组织工程打下基础。
方法：
选取3只成年小型猪，无菌条件下拔除尖牙，剥离牙根外牙周组织及根尖牙乳头组织，参照以往关于人牙齿相关干细胞的培养方法及条件分离培养小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞，并通过倒置显微镜、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞仪、透射电镜、扫描电镜等对其生长特性及在三维支架材料羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）上的生长情况进行观察。
结果：
原代培养的小型猪牙周膜干细胞生长良好，呈多角形或梭性，克隆形成率为1～23个/105，根尖牙乳头干细胞克隆形成率为20～130个/105。
免疫荧光结果表明，分离培养的第3代牙周膜干细胞中部分细胞Stro-1、Nestin及ALP表达阳性，流式细胞仪结果表明牙周膜干细胞Stro-1表达阳性率为5.6%，Nestin为12.5%，ALP为15.0%。
根尖牙乳头干细胞中约有7.6%的细胞抗Stro-1抗体阳性。
第2代牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞的倍增时间最快，生长曲线呈“S”型。
透射电镜下可见，第1～3代牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞生长良好，胞浆内线粒体、高尔基体和粗面内质网丰富，随着培养时间的延长，分泌的细胞外基质增多。
并且牙周膜干细胞分泌的胶原纤维比相同条件下培养的根尖牙乳头干细胞更多，更厚。
扫描电镜观察结果表明，牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞在HA/TCP三维支架上生长良好，充分伸展，并分泌大量细胞外基质。
结论：
小型猪牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞可被成功的分离培养，在体外表现出良好的生长状态，有望为牙周组织再生和生物牙根再生提供有用的细胞来源。
本部分研究内容在JournalofEndodontics发表论文两篇（2008,34
（2）:
166-171；2008,34（6）:
645-651）。
第二部分牙周膜干细胞介导修复实验性牙周炎骨缺损的小型猪体内研究
目的：
建立稳定可靠的牙周炎模型，探讨利用牙周膜干细胞在小型猪体内修复实验性牙周炎骨缺损的可行性。
方法：
采用4种骨缺损加结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型，分别在术后4周、12周和16周进行临床指标（菌斑指数、龈沟出血指数、牙周探诊深度、附着丧失）和影像学观察，确定可靠的建立牙周炎骨缺损模型的方法。
用分离培养的第3代牙周膜干细胞与HA/TCP混合后回植于小型猪实验性牙周炎骨缺损部位。
用临床指标、影像学及组织病理学结果评价牙周组织修复效果。
同时，为了追踪回植牙周膜干细胞在小型猪体内的转归，在体外采用RV-GFP标记牙周膜干细胞，回植于小型猪牙周炎骨缺损处，回植12周后取标本作硬组织切片，荧光显微镜下观察GFP阳性牙周膜干细胞的转归。
结果：
本研究所采用的骨缺损加结扎丝线的方法可形成稳定的小型猪实验性牙周炎模型。
各组在实验前和建模后牙周状况基本相似，基线可比。
治疗12周后，牙周膜干细胞组附着丧失为3.3+0.6mm，HA/TCP组为5.3+0.3mm，对照组为6.3+0.5mm,单因素方差分析结果表明,附着丧失在三组有显著性差异（P<0.01）。
两两比较结果表明，牙周膜干细胞组与HA/TCP组,牙周膜干细胞组与对照组，HA/TCP组与对照组间均有显著性差异（均为P=0.000）。
CT薄层冠状扫描图显示治疗12周后，牙周膜干细胞组有明显的新生骨质影像，而HA/TCP组和对照组的骨再生不明显。
正常牙周组织中，结合上皮位于釉牙骨质界处,牙槽嵴顶位于釉牙骨质界下约2mm，龈沟上皮由扁平的复层上皮组成，上皮下结缔组织内没有明显炎症细胞浸润,牙周膜间隙窄，Sharpey’s纤维是牙周膜内的典型结构。
治疗12周后,牙周膜干细胞组结合上皮位于釉牙骨质界下0.5～1mm，牙周袋不深，牙槽嵴顶位于釉牙骨质界下约3～4mm，龈沟上皮也由复层上皮组成，但比正常龈沟上皮厚，上皮下结缔组织内也没有明显炎症细胞浸润,牙周膜间隙比正常牙周膜略宽，仍可见Sharpey’s纤维结构。
对照组可见结合上皮位于釉牙骨质界下约4mm，牙槽嵴顶明显低于正常组和牙周膜干细胞组,牙周袋的袋内上皮也由复层上皮组成，但上皮下结缔组织内有大量炎症细胞浸润，上皮钉突增生明显，并交织成网状,牙周组织由大量无序排列的纤维组织组成，纤维组织附着在牙根表面，无Sharpey’s纤维样结构，形成纤维愈合。
新骨形成高度在牙周膜干细胞组为3.5+0.7mm，HA/TCP组为1.6+0.4mm，对照组为0.4+0.7mm，统计学分析表明，牙周膜干细胞组明显高于HA/TCP组和对照组（F=125.917,P=0.000）。
GFP示踪结果表明部分GFP阳性牙周膜干细胞分化成为成骨细胞，参与牙周骨缺损的重建与再生。
结论：
利用牙周膜干细胞进行牙周组织再生可获得较好的效果，为临床应用提供大型动物的实验依据。
本研究内容发表于StemCells2008,26（4）:
1065-1073。
第三部分根尖牙乳头及牙周膜干细胞介导再生生物牙根小型猪体内实验研究
目的：
提出生物牙根再生的新理念，利用根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞复合生物支架在小型猪体内探讨生物牙根再生的可行性。
方法：
选取5只成年小型猪，分离培养小型猪根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞，将1×108培养至第3代的根尖牙乳头干细胞与牙根形三维支架材料HA/TCP复合，牙周膜干细胞与明胶海绵复合包裹其外，分别回植于小型猪上、下颌骨内，共回植生物牙根8个。
观察3～9月，定期摄X线片和CT，观察回植物在体内的生长情况。
在回植后9个月收集标本，组织学观察生物牙根牙齿硬组织形成、牙周膜结构、支架材料结构等。
采用H5KS型压力测试系统测试再生生物牙根抗压强度。
回植6月后，将再生的生物牙根取出，平均分成3等分，分别测定每部分的抗压强度，取平均值，以正常小型猪中切牙牙根及HA/TCP生物支架材料作为对照。
并在回植6月后，在再生生物牙根上制作人工牙冠，追踪观察人造牙冠的保留情况。
结果：
在回植初期，牙根材料表面可见到不规则的吸收影像，回植牙根轮廓尚清晰，周围牙槽骨的密度降低。
回植3月时，牙根密度增加，与周围牙槽骨间有类似牙周膜影像的低密度透光区。
在回植第9个月时，回植材料仍为类似牙根的形状，但尺寸比最初植入时减小。
组织像显示再生的牙根组织有类似牙本质、牙骨质样结构，并有类似Sharpey’s纤维的结构插入正在形成的类似牙本质或牙骨质样结构。
桩冠修复后，牙龈组织愈合良好，4周后牙龈组织的色、形、质基本恢复正常，人造牙冠与临牙基本协调。
力学分析结果表明，正常小型猪中切牙牙根的抗压强度为44.66MPa，再生生物牙根为31.87MPa，HA/TCP为4.12MPa。
统计学结果表明，正常牙根及再生牙根的抗压强度均与HA/TCP支架材料有显著差异，再生生物牙根的抗压强度达到正常牙根的70%，说明再生生物牙根的强度足够承受一定的压力，能够满足口腔临床修复的需要。
结论：
利用根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞复合HA/TCP在小型猪体内能形成类似牙根形态的结构，生物牙根再生的理念可行，有望应用于临床。
本研究内容在2006年第一期的PLoSONE发表2006,1
（1）:
e79:
1-8。
小结：
本研究首次利用牙周膜干细胞介导牙周组织再生，并在大型动物上获得成功，为临床修复牙周炎骨缺损提供新思路及实验依据；提出“生物牙根再生”的新理念，并在大型动物上利用牙齿相关干细胞实现了生物牙根再生，为临床修复缺失牙提供了新的思路；首次成功分离培养小型猪牙齿相关干细胞，为在大型动物小型猪上研究干细胞介导的口腔组织工程打下基础；建立了稳定的小型猪牙周炎骨缺损模型，为研究牙周组织修复再生提供了基础。
申请者以第一作者在StemCells发表论著一篇（影响因子为7.924）；以并列第一作者在PLoSONE（为国际著名的医学新杂志）发表论著一篇；以第二、第三作者发表论著两篇（StemCells影响因子为7.924，JournalofEndodontics影响因子为3.369）；以第二、第三作者发表英文综述论文两篇（OralDisease影响因子为1.945，JournalofEndodontics影响因子为3.369）。
关键词：
小型猪，干细胞，组织工程，再生修复，牙周炎，牙根
PeriodontalBoneDefectRegenerationandToothRootRegenerationMediatedbyToothRelatedStemCellsinMiniaturePig
LiuYi
ABSTRACT
Periodontitisisaverycommondiseaseandoftencausesdefectsofperiodontalbone,beingoneofmajorreasonsoftoothloss.Currently,itisstillverydifficulttoregeneratetheperiodontalbonedefects.Toothlossisverycommon,andtherestorationmethodsinclinicareartificialandnon-biological.Theadvancesoftooth-relatedstemcellsandtissueengineeringtechniquemakethenewbiologicalreparationmethodspossible.Inpresentstudy,alargeanimalmodel,miniaturepig（minipig）wasused,andwetestedregenerationofperiodontalbonedefectsandtoothrootmediatedbytoothrelatedstemcellsincludingperiodontalligamentstemcells（PDLSCs）andstemcellsfromapicalpapilla（SCAP）.Theresultsmayprovidethelargeanimalexperimentalevidencesfortheperiodontalbonedefectregenerationandtoothrootregenerationmediatedbytoothrelatedstemcells.Thisstudyincludesthreeparts.
Part1CharacterizationofthePDLSCsandSCAPofminiaturepiginvitro
Objective：
TodevelopaculturemodelforPDLSCsandSCAPofminiaturepigandinvestigatethebiologicalcharacteristicsinvitro.Methods：
Thedevelopingcuspidsof3miniaturepigswereextracted,PDLSCsandSCAPwereseparatedandculturedreferringtothemethodsofhuman’srelatedstemcells.Thegrowthcharacteristicsandultrastructureofthesestemcellswereobserved.Then,the3rdpassagecellswereculturedonthree-dimensionscaffoldsofHA/TCP,andthebiologicalcharacteristicsofthecellswereobservedthroughthescanningelectronmicroscope.Results：
TheculturedPDLSCsandSCAPfromsinglecoloniesshowedtypicalfibroblast-likecellsunderlightmicroscope.Thecolonyformingunits-fibroblastsofPDLSCsandSCAPwere1to23units/105,20to130units/105,respectively.ImmunocytochemicalstainingusingStro-1,NestinandALPinPDLSCsshowedpositivestaining.Approximately5.6%ofthethird-passagePDLSCsstainedpositivelyforStro-1,12.5%forNestin,and15.0%forALPthroughflowcytometricanalysis.PositivestainingofStro-1wasfoundin7.6%ofSCAP.Morphologically,PDLSCswerefusiform-shaped,withmanyshortandlongramificationsunderascanningelectronmicroscope,andthesecretedextracellularmatrixwerearoundthem.BothPDLSCsandSCAPcontainedabundantorganelles,suchasmitochondria,ribosomeandroughendoplasm,asassessedbytransmissionelectronmicroscopy.TheminiaturepigPDLSCsproducedabundantcollagenfibers.ThequantityofcollagensproducedbyPDLSCswasmuchgreaterthanthatproducedbySCAPfromthesameanimalunderthesamecultureconditions.PDLSCsandSCAPgrewverywellonthescaffoldofHA/TCPinvitro.Conclusion：
TheminiaturepigPDLSCsandSCAP,whichcanbeculturedsuccessfullyinvitro,maybeusefulcellsourcesfortheregenerationofperiodontalandtoothtissues.TherelatedpapersaboutthispartwerepublishedinJournalofEndodontics（2008,34
（2）:
166-171；2008,34（6）:
645-651）.
Part2PeriodontalbonedefectregenerationmediatedbyPDLSCsinminiaturepig
Objective:
ToregenerateperiodontalbonedefectbyusingthePDLSCsinconjunctionwithHA/TCPinminiaturepig.Methods:
Fourkindsofdifferentmethodswereusedandevaluatedtoestablishthereliableexperimentalperiodontitismodelinminiaturepig.Then,fourteenminiaturepigswereusedinthestudy.Twoofthemwerechosenasnormalcontrol,andtheother12miniaturepigswerechosenasexperimentalgroups.PDLSCsofthe12miniaturepigswereseparatedandculturedinvitro,andalveolarbonewasremovedusingsurgicalburtocreateexperimentalperiodontaldefectsinthemesialregionofthemaxillaandmandibularfirstmolars.Thecreatedalveolarbonedefectwas3mminwidth,7mminlength,and5mmindepth,andnotch-shapedmarksweremadeontherootsurfaceatthelevelofthetopofthealveolarcrestandthefloorofdefect.Intotal,48defectswerecreatedin12miniaturepigs.Aftertheoperation,4-0silkligamentwassuturedaroundthecervicalportionofthefirstmolars.Afterthegenerationofperiodontitismodels,the48defectswererandomlyassignedtothreedifferenttreatmentgroups:
（a）controlgroup,notreatment;（b）HA/TCPgroup,flapsurgery,transplantationofHA/TCPscaffolds,andcoveringofthedefectswithgelatinmembranes;and（c）PDLSCgroup,flapsurgery,transplantationofapproximately2.0×107oftheexpandedthirdpassageautologousPDLSCscombinedwithHA/TCP,andcoveringofthedefectswithgelatinmembranes.Inthefollowing12week,theclinicalexamination,X-rayfilmsandCTfilmswereperformed,andthehistologicalstructuresoftheregenerationperiodontaltissueswereobservedthroughhematoxylinandeosinstaining（HE）slidesatthe3rdmonth.TotracedirectlythedistributionanddifferentiationofPDLSCsinvivo,therecombinantretroviralvectorwithgreenfluorescentprotein（GFP）wasusedtolabelthethird-passagePDLSCsandtransplantedintotheperiodontalbonedefects.Results:
Allofthefourmethodsestablishedstableexperimentalperiodontitismodelinminiaturepig.At12weekspost-transplantation,theattachmentloss（AL）was3.3+0.6mminthePDLSC-mediatedgroup,5.3+0.3mmintheHA/TCPgroup,and6.3+0.5mmintheuntreatedcontrolgroup.StatisticalanalysisindicatedthatPDLSCtreatmentsignificantlyimprovedperiodontaltissueregenerationincomparisonwiththeHA/TCPandcontrolgroups.CTscananalysesshowedthattheheightofperiodontalalveolarboneinthePDLSC-mediatedgrouprecoveredtoapproximatelythenormallevels.Incontrast,theHA/TCPgroupandthecontrolgroupshowedverylimitedornoboneregeneration.Althoughthepositionofjunctionalepitheliumwasbelowthecemento-enameljunctioninhistopathologicalphotomicrographs,theperiodontaltissueregenerationinPDLS
升级会员 