牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用.docx

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牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用

牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用

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___________单位:

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【摘要】目的:

利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域（LBD）片段,纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。

方法:

以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段,与原核表达载体pGEX4T1相连,构建原核表达质粒pGEX/β6LBD,测序确认开放阅读框正确后,转化感受态细胞BL21（DE3）,以IPTG诱导表达重组牛β6LBD融合蛋白。

SDSPAGE和Westernblot鉴定后提取包涵体,电泳分离纯化重组融合蛋白,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,以ELISA、琼脂扩散实验、免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。

结果:

重组牛β6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量（Mr）约为45000。

制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上,该抗体可与牛舌上皮细胞中的抗原分子结合,具有很好的特异性。

结论:

实现了牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的原核表达和抗体制备,为研究受体β6亚基在牛体内的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。

【关键词】牛FMDV受体β6LBD多克隆抗体免疫组化　　口蹄疫是由口蹄疫病毒（footandmouthdiseasevirus,FMDV）引起偶蹄动物（牛、猪、羊、骆驼等）共患的一种急性、热性、接触性传染病,世界动物卫生组织（OIE）和中国政府分别将该病列为A类和一类动物传染病之首。

FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属。

完整的病毒由衣壳包裹一个分子的RNA组成,衣壳由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的60个不对称原粒构成,其中VP1、VP2和VP3位于衣壳表面,而VP4则完全位于衣壳里面。

由VP1140～160位的氨基酸形成的GH环突出于表面,GH环含有高度保守的RGD基序。

整合素（integrin）分子可与含有RGD基序的蛋白配体结合,这是整合素成为FMDV受体的分子基础[1]。

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的一个决定因素[2]。

目前已发现至少有αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ6四种整合素是FMDV的受体[3,4],且αvβ6是主要的功能受体[5]。

β6是异源二聚体αvβ6的一个亚基,单独存在时并不能介导FMDV感染。

β6亚基胞外域中的168个氨基酸参与构成了配体结合域（ligandBindingdomain,LBD）[6]。

FMDV具有严格的宿主范围,自然条件下其感染对象是猪、牛、羊及其他家养和野生偶蹄动物[7]。

FMDV受体的发现均是以人源整合素基因进行受体重建实验的。

已有实验表明,与人源整合素相比较,FMDV能更加有效地利用牛源整合素[6],本研究组继制备了兔抗牛αvLBD多克隆抗体后[8],其试验实现了牛β6LBD的高效表达并制备了兔多克隆抗体。

　　1材料和方法　　1.1材料含有牛FMDV受体β6亚基基因的重组质粒pGEMβ6由本研究组构建（该基因在GenBank中的登录号为DQ867017）;限制性内切酶、T4DNA连接酶、IPTG、TaqDNA聚合酶、核酸marker、DNA片段纯化试剂盒均购自宝生物（大连）工程公司;低分子量蛋白marker购自中国科学院上海细胞生化所;大肠杆菌菌株DH5α（克隆宿主）、BL21（DE3）（表达宿主）、原核表达载体pGEX4T1、FMDV实验感染牛舌组织均由本室保存;溶菌酶、弗氏佐剂均为Sigma公司产品;硝酸纤维素（NC）膜、透析袋为Pharmacia公司产品;HRP标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒、GST单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

健康新西兰大白兔（3月龄,雄性,体质量约2.5kg）由兰州兽医研究所实验动物场提供。

　　1.2方法　　1.2.1引物设计参考Duque等[8]的文献报道设计引物,上游引物P1为5′GTGGGATCCCCTCAAAGCTTGGCTCTTAA3′;下游引物P2为5′CGACTCGAGGTCCGCGTCACTCACAAAGA3′,P1和P2引物的5′端分别引入了酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,这对引物用于扩增牛β6LBD片段,预期大小为504bp。

　　1.2.2重组质粒的构建以重组质粒pGEMβ6为模板,P1和P2为扩增引物进行PCR反应。

扩增得到的片段经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后与同样酶切处理的pGEX4T1载体连接,转化大肠杆菌DH5α,随机挑取单个菌落小剂量制备质粒,PCR、酶切鉴定重组质粒,将初步确定为阳性的重组质粒pGEX/β6LBD委托宝生物（大连）工程公司测序。

　　1.2.3重组蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒pGEX/β6LBD转化大肠杆菌BL21（DE3）,挑取单菌落接入10mLLB/Ampr培养基中,37℃振摇培养过夜,次日按1∶100将菌液接入LB/Ampr培养液,37℃振摇培养2～4h至A600值达到0.3～0.5时,加IPTG至终浓度1mmol/L,继续培养4～6h后进行SDSPAGE分析目的蛋白的诱导表达情况。

同时进行Westernblot,将表达的蛋白经SDSPAGE并膜转移后,用50g/L脱脂奶粉封闭1h,一抗为GSTmAb,二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG,依次加入DAB和H2O2显色。

　　1.2.4可溶性分析和纯化取单个克隆阳性表达菌接入200mLLB/Ampr培养液中,按上述方法诱导表达,离心收集沉淀。

加细菌裂解液,于冰浴上进行超声破碎,超声时间10s,间隔时间10s,功率400W,超声次数40次,4℃15000r/min离心20min,分别取上清和沉淀用于SDSPAGE分析。

沉淀加适量1×上样缓冲液,重悬后沸水煮5min后上样,电泳结束后用预冷的0.1mol/LKCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带,在相应位置切下目的条带放入透析袋内,将透析袋置于水平电泳洗脱装置内,60V洗脱7h,然后反转电极向相反方向洗脱3～5min。

取出透析带内凝胶,PEG20000包埋浓缩透析袋内液体至一定体积,取样进行SDSPAGE电泳,鉴定重组蛋白的纯度和浓度。

　　1.2.5多克隆抗体的制备以纯化的牛β6LBD融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔。

免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前血清对照。

初次免疫用500μg重组蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀后于背部皮下多点注射。

4周后第1次加强免疫用250μg重组蛋白,与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。

之后隔2周加强免疫1次,并于2次加强免疫后第10天经心脏大量采血,按常规方法分离制备血清。

以重组蛋白包被96孔板,间接ELISA方法测定抗血清效价。

　　1.2.6多克隆抗体的免疫组化染色从-20℃取出FMDV实验感染牛舌组织冰冻切片,复温后置于4℃预冷的丙酮固定10min,PBS漂洗3次后,滴加H2O2甲醇,室温孵育10min,滴加1∶200稀释的兔抗牛β6LBD融合蛋白多克隆抗体,4℃孵育过夜。

PBS洗片后加入1∶100稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG,37℃孵育1h,PBS洗片后进行DAB显色,苏木素复染,返蓝后中性树脂封片,显微镜下观察并拍照记录结果。

　　2结果　　2.1重组原核表达质粒的构建以pGEMβ6为模板PCR扩增出了牛β6亚基LBD504bp的片段,编码168个氨基酸。

将该片段克隆至pGEX4T1原核表达载体,PCR、酶切结果显示目的片段与预期大小一致,测序结果显示重组质粒pGEX/β6LBD含有正确的开放阅读框。

　　2.2重组融合蛋白的诱导表达和纯化将重组质粒pGEX/β6LBD转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达重组β6LBD蛋白。

SDSPAGE分析表明,重组菌经IPTG诱导后在45000处可看到一条特异的蛋白条带,与预期表达的目的蛋白大小一致,未经IPTG诱导的阴性对照在此位置未见该条带。

Westernblot分析显示,GSTmAb与表达菌体中的重组融合蛋白形成了特异的抗原抗体反应带。

细菌沉淀经超声裂解获得其包涵体,表明重组融合蛋白以包涵体形式存在于菌体中。

包涵体经SDSPAGE后切胶电泳洗脱纯化,获得了高纯度的重组融合蛋白（图1）。

　　图1表达产物的SDSPAGE和Westerblot检测（略）　　1:

未诱导对照;2-4:

分别为IPTG诱导3h,4h,5h表达产物;M:

蛋白marker;5:

纯化的目的蛋白;6:

目的蛋白Westerblot分析.　　2.3多克隆抗体的鉴定以牛β6LBD融合蛋白3次免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

以2mg/L的重组蛋白包板,间接ELISA法测定兔抗血清效价在1∶12800左右。

牛舌组织免疫组化实验表明,牛整合素β6亚基仅分布于舌上皮细胞,尤其在棘细胞层表达量较大,在固有层与肌层无分布（图2）,这与Monaghan等[5]报道的牛αvβ6分布于舌上皮组织的结论相一致。

　　图2牛β6LBD多克隆抗体免疫组化结果（略）　　A:

阴性血清对照（×200）;B:

抗牛β6LBD多克隆抗体免疫组化染色（×200）;C:

抗牛β6LBD多克隆抗体免疫组化染色（×400）.　　3讨论　　整合素广泛分布于生物体的组织细胞中,具有广泛的生物学活性,在细胞的生长、移行、增殖和分化等许多方面发挥重要作用。

许多病毒能利用整合素分子作为病毒受体或共受体（coreceptor）进入宿主细胞。

整合素是一类由α和β亚基以非共价键结合形成的膜蛋白家族,该家族包括由18种不同的α亚基和8种β亚基形成的24种αβ复合物。

在这些复合物中,αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8、αvβ5、α5β1、α8β1、αⅡbβ38种整合素能够识别精氨酸甘氨酸天冬氨酸（ArgGlyAsp,RGD）序列而与其配体相互作用[9],已发现前4种是FMDV的受体,后4种尤其是αvβ5和α5β1已被许多实验证实并非FMDV受体[10]。

整合素的α和β链的氨基末端形成的球形部分为细胞外配体结合域,该结合域在细胞信号转导过程中扮演重要角色,但是,整合素作为FMDV的受体在病毒感染细胞过程中引发何种信号转导途径目前尚无证据。

　　Jackson等[4]发现正常情况下不感染FMDV的人SW480细胞在转染了人整合素β6cDNA后,即变得对FMDV易感,且这种介导作用可被抗αvβ6的mAb所抑制,从而证实了αvβ6是FMDV的受体。

β6亚基仅形成一种异二聚体即αvβ6,人的子宫、膀胱、呼吸道和唾液腺等不同部位的上皮细胞都发现有αvβ6表达。

牛在感染FMDV后,αvβ6在病毒靶器官的上皮细胞表面持续性表达,却检测不到αvβ3的表达,这表明αvβ6可能在FMDV感染的初始阶段起重要作用[5]。

最新研究表明,αvβ6整合素不仅对FMDV吸附起作用,而且在病毒的脱壳、复制等过程中也发挥着重要作用[10]。

我们在克隆到FMDV受体牛β6亚基基因的基础上,选择以其配体结合域为研究切入点,实现了该结合域的高效表达并制备了兔多克隆抗体。

本研究中选用的表达载体为pGEX4T1,在该载体多克隆位点的NH2末端带有Mr为26000的谷胱甘肽转移酶（GST）标签,该标签有助于小Mr蛋白的高效表达。

对于一种蛋白质说来,抗体是研究其功能最有力的工具之一。

目前,市面上没有商品化的抗牛β6蛋白的抗体可以利用,这限制了人们对牛β6蛋白作为FMDV受体的相关研究。

我们制备的兔抗牛β6LBD蛋白多克隆抗体将有助于深入研究牛β6亚基在FMDV感染宿主细胞过程中的作用。

另外,FMDV具有明显的组织嗜性,动物发病时多见舌面、唇部、蹄部等的病变,导致这种表型的致病机理至今鲜有报道,兔抗牛β6LBD的多克隆抗体将为研究FMDV受体整合素β6亚基的组织分布及其病毒致病机制提供依据。

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