2徐龙龙 苜蓿中总黄酮提取工艺的优化.docx
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2徐龙龙苜蓿中总黄酮提取工艺的优化
毕业设计
题目名称
苜蓿中总黄酮提取工艺的优化
学院
文理学院
专业/班级
应用化学11101
学生
徐龙龙
学号
41311144
指导教师
陈兵兵张书奎
毕业设计任务书
题目苜蓿中总黄酮提取工艺的优化
专业应用化学
学生姓名徐龙龙
班级学号41311144
指导教师陈兵兵、张书奎
指导单位文理学院化学工程系
专业负责人罗桂林
日期2014.10.30
毕业设计（论文）题目
苜蓿中总黄酮提取工艺的优化
题目类型
科研类
题目来源
实验
毕业设计（论文）内容与技术要求
1、内容：
1、综述
2、实验准备
3、单因素考察
4、设计正交试验
5、稳定性测试
二、技术要求：
通过对不同条件下提取黄酮量的大小，找出最佳提取参数，设计正交试验，获取最佳提取工艺
毕业设计（论文）进度
第一阶段（2014年8月-2014年10月）：
文献查询
第二阶段（2014年10月-2014年11月）：
原料的预处理，准备实验
第三阶段（2014年11月-2015年1月）：
单因素考察
第四阶段（2015年1月-2015年2月）：
正交试验的设计
第五阶段（2015年2月-2015年3月）：
进行正交试验和稳定性测试
第六阶段（2015年3月-2015年4月）：
撰写论文的初稿
第七阶段（2015年4月-2015年5月）：
论文定稿，制作PPT准备答辩
第八阶段（2015年5月-2015年6月）：
论文答辩
参考资料
[1]高微微,何春年,佟建明.我国苜蓿属植物资源及应用概况[J].时珍国医国药,2006,17（5）:
680-683.
[2]赵祥.苜蓿产业化生产与加工利用[M].山西:
金盾出版社,2002,1-5.
[3]曹致中.优质苜蓿栽培与利用[M].北京:
中国农业出版社,2002,1-11.
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中国农业出版社,1995,1-10.
[5]EI-KhrisyEAM,AbdelHOM,KhattabA,eta1.ChemicalconstituentsofMedicagosativaL[J].Bu11.Natl.Res.Cent,1994,19
（2）:
l17-122.
[7]何春年,高微微,佟建明.苜蓿属植物的皂苷类化学成分[J].中国农业学报,2005,21（3）:
107-108.
[8]王东冬.大豆皂苷的提取纯化与分离检测[D].上海:
上海交通大学,2006.
注：
1.课题类型：
工程设计、技术开发、软件工程、理论研究和方法应用、管理模式设计等
2.课题来源：
教学、科研、生产、实验、其他
摘要
苜蓿是当今世界上种植面积最大、应用最广的多年生豆科牧草，素有“牧草之王”的美誉。
本论文主要研究宁夏石嘴山地区，盐碱地生长的紫花苜蓿中的黄酮类化合物。
首先，对紫花苜蓿的发展近况、性状、药理作用和黄酮类化合物的种类、理化活性、分离提取方法以及分析方法等作了论述。
其次，对提取黄酮的影响因素，如回流时间、固液比、浓度比、时间比、温度比做了单因素考察。
最后，分析了乙醇浓度、提取时间、固液比和提取温度等单因素实验结果，并在此基础上做了正交实验，得到了最佳提取工艺为：
回流时间6h、固液比为1:
40、乙醇浓度为50%、温度为70℃，在此条件下，紫花苜蓿总黄酮提取量为8.7813mg/g。
关键字：
紫花苜蓿；黄酮类化合物；单因素实验；正交试验
Abstract
Alfalfaisthelargestandmostwidelyperenniallegumewhereisgrownintheworld'sandhasknownasthe“kingofgrass”inworld.ThetechnologyforextractionoftotalflavonoidofMedicagosalivaL（alfalfa）plantoriginatedtoSaline-alkalifromNingxiatostudied.Firstly,Thispartofarticletoldthatthedevelopmentstatusofalfalfa、thetypetraits、pharmacologicaleffectsandflavonoids,physicalandchemicalactivity,separationandextractionmethod、analysismethodsandsoon.Secondly,Theflavonoidsextractedfactors,suchasrefluxingtime,solid-liquidratio,theconcentrationratio,thetimeratio,temperatureratiodidexperimentstoexplorerespectively.Takingethanolasextractionwasstudiedbyone-factorexperimentofethanolconcentration,extractiontimes,ratioofsolidtoliquid,andextractiontemperature;andtheorthogonalexperimentbasedontheone-factorexperiments.Theresultsshowthattheoptimalextractiontechnicswereethanolconcentrationat50％,ratioofsolidtoliquidat1:
40,extractiontimewas6h,andextractiontemperature70℃.Underthisconditiontheethanolextractedrateoftotalflavonoidinalfalfa8.7813mg/g.
Keywords:
MedicagosalivaL;flavonoids;singlefactor;orthogonaltest
目录
摘要I
AbstractII
第1章文献综述1
1.1概述1
1.1.1苜蓿的性状1
1.1.2苜蓿的发展及分布1
1.1.3苜蓿中的营养成分2
1.2黄酮类化合物结构及理化性质3
1.2.1黄酮类化合物的结构3
1.2.2黄酮类化合物的理化性质4
1.3黄酮类化合物的生物活性5
1.3.1抗氧化及消除自由基的作用5
1.3.2抗肿瘤、抗癌活性6
1.3.3抗炎、抗过敏8
1.3.4抗菌、抗病毒作用8
1.3.5抗疟原虫的活性9
1.3.6黄酮类化合物的其它活性10
1.4黄酮类化合物的提取、分离工艺11
1.4.1热水提取法11
1.4.2醇提法11
1.4.3碱性水或碱性稀醇提取法12
1.4.4微波提取法12
1.4.5超声波法13
1.4.6酶解法13
1.4.7半仿生法13
1.4.8大孔树脂吸附法13
1.4.9超临界流体萃取14
1.5黄酮类化合物的分析方法14
1.5.1薄层色谱法（TLC）15
1.5.2高效液相色谱法（HPLC）15
1.5.3紫外-可见分光光度法（UV）15
1.5.4高效毛细管电泳（HPCE）16
1.6研究黄酮类化合物的目的及意义16
第2章实验部分18
2.1仪器及试剂18
2.2实验内容18
2.2.1原料苜蓿的收集和预处理18
2.2.2最大吸光度的选择19
2.2.3标准曲线的制作19
2.2.5正交实验22
第3章结果与讨论24
3.1单因素结论分析24
3.1.1固液比对总黄酮提取影响结论24
3.1.2乙醇浓度对总黄酮提取影响结论24
3.1.3温度对总黄酮提取影响结论25
3.1.4时间对总黄酮提取影响结论25
3.1.5提取次数对总黄酮提取量影响结论26
3.2正交实验结论27
3.3稳定性测定28
3.4结果与讨论29
3.4.1结果分析29
3.4.2讨论与展望29
参考文献31
结束语34
致谢35
第1章文献综述
1.1概述
苜蓿在我国的发展已经有2000多年的历史了，因其产草量高、富含蛋白质、适口性好，适应性强等特点而被广泛种植，素有“牧草之王”的美誉[1]。
1.1.1苜蓿的性状
苜蓿是多年生宿根草本，主根长2米左右，根茎发达，多有蔓茎，其上有豆科植物的固氮小球。
茎高25-80厘米左右，有直立或匍匐生长，枝上多光滑，有分叉，叉多。
叶子多为三瓣，也有少数四瓣，叶片多椭圆形，长2-4厘米左右，有的叶片上部尖端有锯齿，有的叶片顶端中间突出；叶柄长且平滑，有托叶。
花梗由叶腋长出，花有3-5厘米左右的短柄；成簇状花，其中有10-30朵不等的紫色或白色小花；花多细长，有齿；花冠紫色居多。
荚果圆形，长有毛，灰褐色，不开裂。
种子多4-8粒，椭形，黄褐色，很小。
花期长，大约为2周左右。
目前紫花苜蓿有野生和栽培两种生长方式，分布很广。
通常研究的都是干苜蓿，以其叶、枝、花、果实、根等不同部位分开或一起粉碎成不同目数来研究。
图1.1原料苜蓿预处理流图
1.1.2苜蓿的发展及分布
苜蓿起源于伊朗等地，汉武帝时期开始引入中国。
由于其良好的特性而被广泛应用于饮食、畜牧、中药和肥田改土等方面[2]。
苜蓿可以防出血，清内热；历史上记载苜蓿的书籍有很多，如：
《本草纲目》对苜蓿描述如下：
“安中利入，可久食，利五脏、轻身健人，洗去脾胃间邪热之气，通小肠诸恶热毒”[3]。
曹致中[4]、耿华珠[5]等人对苜蓿的分类、生长环境、成分含量等做了深入的研究；紫花苜蓿在新疆、甘肃、宁夏等14个省市自治区均有分布，我国苜蓿种植面积已达到2000多万亩，年干草产量达到2000多万吨。
50年代宁夏种植苜蓿的面积为1.7万公顷，后来不断扩大，到了80年代种植面积已经达到了14万公顷。
苜蓿的种植面积是不断增大的，但是开发利用却主要集中在饲料价值和干草加工技术方面，对其生物活性方面研究很少，产品的经济附加值较低。
1.1.3苜蓿中的营养成分
苜蓿中的营养成分主要有皂苷类、黄酮类、生物碱、膳食纤维、多糖类、叶蛋白类、维生素E、香豆素类和有机酸类等[6]。
另外，苜蓿中还含有多种挥发油、氨基酸、维生素、类胡萝卜素、微量元素等成分[7]。
苜蓿中的黄酮类化合物，能有效清除人体自由基[8]，防止肾上腺素氧化，且有轻度雌激素样的作用，而且对畜禽有明显的促生长、提高繁殖力和增强机体免疫力、护肤和美容[7]等作用。
本文主要研究黄酮类化合物，在第二节将对其详细介绍。
从苜蓿中可以分离出43种皂苷类化学成分，主要结构特征为：
齐墩果烷型五环三萜[9]如图1.2的1，这些皂苷类化合物又名皂素、皂甙、皂角苷，普遍存在于植物体内，是重要生物活性天然次生代谢产物；能与水混合并搅拌后产生泡沫[10]。
皂苷由皂苷配基与苜蓿苷酸等其他有机酸组成如图1.2的2[11]。
皂苷大多分布在百合科、五加科、豆科等植物中，海洋生物如海参也有少量皂苷类化合物；人参、桔梗、甘草、柴胡等中草药的主要有效成分之一就是皂苷[12]。
皂苷的主要结构是以常春藤皂苷元如图1.2的3、大豆皂醇如图1.2的4等为母核[13]。
12
34
图1.2部分皂苷类化合物的主要成分
苜蓿多糖是紫花苜蓿自孕蕾期从茎、叶中提取的水溶性苜蓿多糖，是非淀粉多糖，浅黄色粉末，易溶于水，不溶于80%乙醇，性质稳定[14]。
苜蓿中的糖类是具有生物活性的多糖之一，它对畜禽有明显的促进生长作用，能增强免疫功能和抗感染，强化血管和降血糖，抗辐射和心肌梗塞等[15]。
刘晓峰[16]等人采用热水浸提法提取紫花苜蓿中多糖，并通过单因素试验和正交试验研究了浸提时间、浸提温度、浸提固液比、浸提次数对提取紫花苜蓿中多糖得率的影响。
得到紫花苜蓿中提取多糖的最佳提取工艺条件为浸提时间1h、浸提温度95℃、固液比1：
30、浸提3次。
在该最佳提取条件下，多糖的得率可达6.1％。
紫花苜蓿中的生物碱结构较简单，为氨基酸类衍生物。
从紫花苜蓿中可以分离出的生物碱有N-丙二酸单酰基色氨酸、高水苏碱和水苏碱等。
主要结构有吲哚环、吡啶环和毗咯环如图1.3[17]。
图1.3部分紫花苜蓿中的生物碱
1.2黄酮类化合物结构及理化性质
目前，已报道的黄酮类化合物超过4000种。
紫花苜蓿中可以分离出53种黄酮类化合物。
这些黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。
根据这些结构特点，可将黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、双苯吡酮类、查尔酮和双黄酮类等十五种。
1.2.1黄酮类化合物的结构
黄酮类化合物又称生物类黄酮，是指具有α或β-5苯基吡喃酮的一大类物质[18]，其特点是具有C6-C3-C6的基本骨架如图1.4。
通常认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。
黄酮类化合物种类丰富，结构多样；其主要原因是C6-C3-C6的骨架上有多个可取代位置，具有较强结构修饰活力，而分子中存在的氧代糖苷、羟基、碳代糖苷、苯并吡喃基（疏水基）、香叶基等取代基大大丰富了该类化合物的生物活性[19]。
紫花苜蓿中可以分离出多种黄酮类化合物，如黄酮及其苷类，黄酮醇及其苷类、异黄酮类、异黄烷类、二氢黄酮类、紫檀烷类等结构类型；各类黄酮化合物的母核主要有芹菜素、苜蓿素、槲皮素、山萘酚、维斯体素、蒜头素、花色素等，其中芹菜素、苜蓿素、木樨草素最常见[20]（图1.5）。
C6-C3-C6骨架查尔酮类黄酮类
黄烷酮类2-苯基色原酮色原酮
图1.4部分黄酮类分子的结构
苜蓿素能有效清除人体内的自由基，抗氧化、降血脂，预防心脑血管疾病。
从苜蓿中提取的大豆黄酮、苜蓿素有抗氧化作用，可防止肾上腺素的氧化，并有轻度雌激素样作用和抗癌作用[21]。
苜蓿素芹菜素花色素
图1.5紫花苜蓿中部分黄酮类化合物的母核结构
1.2.2黄酮类化合物的理化性质
大多数黄酮类化合物多是含有结晶水的固体，其中黄酮苷类多为无定型粉末[22]。
黄酮类化合物的理化性质主要体现在溶解性、旋光性、酸碱性和显色反应等方面。
溶解性：
黄酮类化合物的溶解性因其不同的结构和存在状态而异，一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于乙醇，乙醚等有机溶剂和稀碱溶液中；其中黄酮、黄酮醇、查耳酮因分子与分子间堆砌较紧密，分子间引力较大，故更难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面性分子，故排列不紧密，分子间引力降低,有利于水分子进入，溶解度稍大（如图1.6）。
黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。
花色苷元类虽也为平面性结构，但因以离子形式存在，具有盐的通性，故亲水性较强，水中溶解度较大。
黄酮类化合物的轻基糖营化后，水溶度即相应加大，而在有机溶剂中的溶解度则相应减小。
糖链越长，则水溶度越大。
黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。
图1.6二氢黄酮及二氢黄酮醇的非平面分子
酸碱性：
黄酮类化合物分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。
因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，当强酸过量时会溶解生成钅羊盐。
旋光性：
游离的苷元除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外,大多无光学活性，只有混入糖分子时大多才显示左旋性。
显色反应：
黄酮类化合物的显色反应多与分子中的酚羟基及r-吡喃酮环有关，显色反应结果可以定性地判断黄酮类化合物的存在及它们之间的区别[23]。
当黄酮遇盐酸和锌粉会变红，黄酮醇则会变紫红，二氯黄酮变紫红；遇醋酸镁，黄酮、黄酮醇和二氯黄酮都会变成黄色并带有银光；遇三氯化铝，黄酮会变黄，黄酮醇变黄绿，二氯黄酮变蓝绿，查尔酮和异黄酮会变黄，橙酮则会变浅黄。
这些显色反应无疑是前期研究黄酮类化合物重要的标志之一。
1.3黄酮类化合物的生物活性
黄酮类化合物的生物活性主要体现在抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等方面。
60年代末，人们发现黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。
到了70年代，又发现其在抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤作用方面有作用。
黄酮类化合物的生理活性是多种多样的，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌，降血糖，抗氧化，抗辐射，抗癌，抗肿瘤以及增强免疫能力等作用。
1.3.1抗氧化及消除自由基的作用
1996年胡春[24]对黄酮类化合物防止脂质氧化的可能性进行了探讨，特别是对抗氧化作用与黄酮类合物结构间的关系上进行了讨论，得到黄酮类化合物具有不容忽视的抗氧化能力，对于一些因氧自由基损伤所引起的疾病可能有治疗价值，对含脂食品的自动氧化的防止有一定的实用价值，是一类值得深入研究的天然产物。
2000年黄池宝[25]等人对黄酮类化合物抗氧化性（图1.7）及结构进行了研究，得出B-4-OH抗氧化活性强于B环其它羟基基团；C-3-OH无抗氧化性活性；双键的有无对抗氧化性无异。
2008年候滨滨[26]对金莲花中黄酮类化合物提纯及抗氧化性进行了研究，得出提取物对花生油的抗氧化能力随添加量的增大而增大，而且精致产品的抗氧化性明显强于未精致产品的抗氧化效果。
2012年方玉梅[27]对金针菇黄酮类化合物抗氧化性的作用做了研究，得出随着金针菇黄酮类化合物浓度的提高其抗氧化作用也逐渐增强，并在一定范围内黄酮类化合物与抑制率呈正相关。
可见：
提取物浓度是影响黄酮类化合物提取量的主要原因。
苜蓿总黄酮具有降血脂、降低低密度脂蛋白胆固醇、预防和减缓动脉硬化的作用，同时还具有抑制氧自由基损伤防止脂质过氧化的作用。
黄酮类化合物抗氧化及消除自由基的机理主要分为两个部分：
一是络合那些具有氧化作用的金属离子，形成鳌合物，从而降低金属的氧化作用；二是能和自由基进行反应，从而消除某些自由基的氧化作用。
图1.7部分抗氧化黄酮类化合物的结构式
1.3.2抗肿瘤、抗癌活性
2005年Ko[28]等人通过对36种黄酮类化合物的研究发现：
Myricetin对抑制金属蛋白酶（MMP-2）的抑制能力最强，如图1.8的5；其机制与抑制PKC转位、ERK磷酸化、TPA诱导的MMP-2活性有关。
2006年Quercetin[29]等人研究到图1.8的6是硫氧还原蛋白的抑制剂，对该没的IC50值为0.79umol/L，可使细胞生长周期停止在S期，细胞聚集在sub-GI期进而发生凋谢。
2008年杨博[30]等人在黄酮类化合物的抗肿瘤作用机制研究进展中得到：
黄酮类化合物的抗肿瘤靶点为周期依赖性激酶、硫氧还蛋白还原酶、基质金属蛋白酶等；其中周期依赖性激酶（CDK）比作细胞周期控的发动机，CDK可推进细胞周期的运行，有效阻止癌细胞的周期进程；有此作用机制的黄酮类化合物有flavopiridol，如图1.8的7、P276-00，如图1.8的8、Acacetin,如图1.8的9。
水果、蔬菜、中草药等植物中含有丰富的天然黄酮类化合物，部分天然黄酮类化合物具有抗肿瘤活性和抗癌活性，其机理为部分黄酮类化合物阻滞了肿瘤细胞和癌细胞的增殖周期，激活了内源性DNA内切酶，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抗癌的作用。
这种DNA内切酶一般是芳烃化酶，其活性作用可以对抗自由基或直接抑制癌细胞生长，也可对抗致癌促癌因子起到抗癌的作用；黄酮类化合物可以抑制肿瘤细胞增值，导致肿瘤细胞死亡，且对正常细胞毒副作用较小。
56
78
9
图1.8部分抗癌活性的黄酮类化合物的结构
1.3.3抗炎、抗过敏
大多黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏是的作用，而炎症、过敏反应的发生与体内的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞密切相关。
黄酮类主要通过影响分泌过程、有丝分裂及细胞间的相互作用而起效，多数黄酮可减少杀伤性T细胞产生等。
KuwanonC如图1.9的10，表现出适度的抑制活动对COX-2，其IC50值大于73.0μM/mL，当IC50值为19μM/mL时kuwanonC显示温和抑制12-LOX的活性[31]。
化合物如图1.9的11，是从桑干树皮中分离得到的，具有有效的抗炎活性，通过抑制大鼠中性粒细胞葡萄糖醛酸酶-β释放活性从而诱导血小板活化因子，其IC50值为10-5mol/L时抑制率为93.6％[32]。
从白毛藤中分离的lyratinB如图1.9的12，和lyratinC如图1.9的13，通过对大鼠白细胞中的β-葡萄糖醛酸酶显示出体外抗炎活性，当IC50值为10mm/mL时抑制率范围在30.3-38.6％[33]。
1011
1213
图1.9部分抗炎活性黄酮类化合物的结构
1.3.4抗菌、抗病毒作用
黄酮类化合物抗菌抗病毒作用己经得到医药界的肯定，这方面进行的研究较多，如黄芩苷、杨梅黄酮等均有抗病原微生物和抗病毒的作用，微量的黄芩素对HIV逆转录酶有抑制作用[34]。
二异戊烯基黄酮类化合物styracifolinA如图1.10的14和styracifolinB如图1.10的15分离于桑树的树皮对人肿瘤细胞枯否氏细胞（NFκB）和人成纤维细胞系（MRC-5）具有细胞毒性，化合物
（1）表现出较强的抵抗活性，两个细胞系的IC50值分别为5.6μM/mL和4.7μM/mL，化合物
（2）表现对细胞相对温和的活性，其IC50值为27.2μM/mL和31.7μM/mL[35]。
1415
图1.10部分抗毒活性黄酮类化合物的结构
1.3.5抗疟原虫的活性
疟疾是最危险的感染疾病之一，治疗疟疾的首选药物是复方青蒿素类药剂。
由于个体身体与生存环境的差异系，对这种药物的抗性也各不相同；因此新药物的开发就显得很必要了。
abyssinoneV如图1.11，是2012年YenesewaA[36]从刺桐根皮和茎叶中分离的黄酮类化合物；当IC50（英文为：
halfmaximalinhibitoryconcentration，是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度；其可以衡量药物诱导凋亡的能力，诱导能力越强该数值越低。
）值为0.97±0.2μg/mL和1.73±0.5μg/ml时刺桐的丙酮的粗提取物在体外对D6和W2疟原虫具有显著抗疟原虫的活动；分离纯化后对黄酮类化合物测试发现，当IC50值为5-7μM/mL时abyssinoneV在体外是最有效的抑制D6和W2疟原虫，它与干草黄酮的活性（licochalconeA）相媲美（IC50为5.6±0.6μM/mL）。
经检测粗提物的抑制活性比任何分离的纯化的化合物要强，可能是粗提取物中含有多种化合物的共同作用所导致的。
可见黄酮类化合物中还有未被分离出来抗疟疾分子在起着作用。
图
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