蛋白质分子量测定.docx
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蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法
目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：
年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱（GPC）法。
一、粘度法
一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。
通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量（粘均分子量）。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：
恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法
在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。
分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。
通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：
层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法
SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。
一般涉及到蛋白质纯化的实验室基本都具备。
但是精确程度相对较低，好的电泳图谱需要一定的技术。
SDS-凝胶电泳法所需设备：
微型凝胶电泳装置、电源（电压200V，电流500mA）。
四、凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法的分离原理与凝胶过滤层析法相同，只是利用高校液相色谱技术实现凝胶层析法分离和测定过程。
与凝胶过滤层析法相比凝胶渗透色谱法分离速度快、分析时间短、重现性好，但设备投入较大，价格较高。
凝胶渗透色谱法所需设备：
高效液相色谱仪、溶剂脱气设备、溶剂过滤器、样品过滤器件。
其中高效液相色谱仪可选用如下两种系统之一；
溶剂脱气设备可选用超声波清洗器：
江苏昆山KQ-100E。
两种备选高效液相色谱系统
大连伊利特P230型等度系统
基本配置：
P230型高压恒流输液泵：
1台
UV230+型紫外可见检测器：
1台
Rheodyne7725i高压六通进样阀：
1只
EC2000单通道色谱数据处理工作站：
1套
色谱柱：
根据测定蛋白质的分子量不同选取（可咨询色谱仪器公司）。
岛津高效液相色谱仪LC-10Avpplus（苏州岛津）
基本配置
LC-10ATVPPlus输液泵：
1台
SPD-10AVPPlus紫外可见双波长检测器：
1台
LCsolutionLite中文化LC工作站：
1套
CBM-10AVPPlus系统控制器：
1台
高压六通进样阀：
1只
色谱柱：
根据测定蛋白质的分子量不同选取（可咨询色谱仪器公司）。
一、粘度法
1.原理
分子量是表征化合物特征的基本参数之一。
但高聚物分子量大小不一，参差不齐，一般在103～107之间，所以通常所测高聚物的分子量是平均分子量。
高聚物在稀溶液中的粘度，主要反映了液体在流动时存在着内摩擦。
在测高聚物溶液粘度求分子量时，常用到下面一些名词。
如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。
特性粘度和分子量之间的经验关系式为：
式中，M为粘均分子量；K为比例常数；α是与分子形状有关的经验参数。
K和α值与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。
K值受温度的影响较明显，而α值主要取决于高分子线团在某温度下，某溶剂中舒展的程度，其数值解在0.5～1之间。
K与α的数值可通过其他绝对方法确定，例如渗透压法、光散射法等，从粘度法只能测定[η]。
在无限稀释条件下
获得[η]的方法有二种：
一种是以ηsp/C对C作图，外推到C→0的截距值；另一种是以lnηr/C对C作图，也外推到C→0的截距，两根线会合于一点。
方程为：
测定粘度的方法主要有毛细管法、转筒法和落球法。
在测定高聚物分子的特性粘度时，以毛细管流出法的粘度计最为方便。
若液体在毛细管粘度计中，因重力作用流出时，可通过泊肃叶公式计算粘度。
（m=1）。
对于某一只指定的粘度计而言，（4）可以写成下式
省略忽略相关值，可写成：
式中，t为溶液的流出时间；t0为纯溶剂的流出时间。
可以通过溶剂和溶液在毛细管中的流出时间，从（6）式求得ηr，再由图求得[η]。
2.仪器
恒温槽1套；乌倍路德粘度计1只；移液管（10mL）2只，（5mL）1只；秒表，吸耳球，螺旋夹；橡皮管；
3.步骤（以聚丙烯酰胺分子量测定为例）
测定所用的乌倍路德粘度计，又叫气承悬柱式粘度计。
他的最大优点是可以在粘度计里逐渐稀释从而节省许多操作手续。
（1）．先用洗液将仪器洗净，再用自来水、蒸馏水分别冲洗几次，每次都要注意反复流洗毛细管部分，洗好后烘干备用。
（2）．调节恒温槽温度至30.00℃，在粘度计的B管和C管上都套上橡皮管，然后将其垂直放入恒温槽，使水面完全浸没G球。
（3）．溶液流出时间的测定。
用移液管分别吸取已知浓度的聚丙烯酰胺溶液10mL和硝酸钠溶液（3mol·dm-3）5mL，由A管注入粘度计中，在C管处用洗耳球打气，使溶液混合均匀，浓度记为C1，恒温10min，进行测定。
测定方法如下：
将C管用夹子夹紧使之不通气，在B管用吸耳球将溶液从F球经D球、毛细管、E球抽至G球2/3处，解去夹子，让C管通大气，此时D球内的溶液即回入F球，使毛细管以上的液体悬空。
毛细管以上的液体下落，当液面流经a刻度时，立即开始计时，当液面降至b刻度时，停止计时，测得刻度a,b之间的液体流经毛细管所需时间。
重复这一操作三次，它们间相差不大于0.3s，取三次的平均值为t1。
然后依次由A管用移液管加入5mL,5mL,5mL,5mL硝酸钠溶液（1mol·dm-3），将溶液稀释，使溶液浓度分别为C2,C3,C4,C5，用同法测定每份溶液流经毛细管的时间t2,t3,t4,t5。
应注意每次加入硝酸钠溶液后，要充分混合均匀，并抽洗粘度计的E球和G球，使粘度计内溶液各处的浓度相等。
（4）．溶剂流出时间的测定
用蒸馏水洗净粘度计，尤其要反复流洗粘度计的毛细管部分。
用1mol·dm-3的硝酸钠洗1～2次，然后由A管加入约15mL1mol·dm-3硝酸钠溶液。
用同法测定溶剂流出的时间t0。
4.数据记录
（1）．数据记录
（2）．作图
由回归直线截矩得[η]＝
（3）．由公式代入数据得
表高聚物溶剂体系的［η］---M关系式
高聚物
溶剂
t/℃
103K
dm3·kg-1
α
分子量范围M×10-4
聚丙烯酰胺
聚丙烯腈
聚甲基丙烯酸甲酯
聚乙烯醇
聚苯乙烯
聚己内酰胺
聚醋酸乙烯酯
水
水
1mol·dm-3NaNO3
二甲基甲酰胺
苯
丙酮
水
水
甲苯
40%H2SO4
丙酮
30
30
30
25
25
25
25
30
25
25
25
6.31
68
37.5
16.6
3.8
7.5
20
66.6
17
59.2
10.8
0.80
0.66
0.66
0.81
0.79
0.70
0.76
0.64
0.69
0.69
0.72
2～50
1～20
5～27
24～450
3～93
0.6～2.1
0.6～16
1～160
0.3～1.3
0.9～2.5
摘自:
印永嘉主编.大学化学手册.山东科学技术出版社.1985:
692
二、凝胶过滤层析法
1.原理：
凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同分子量的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。
实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即：
Vt=Vo+Vi+Vg
Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg 。
它们之间的关系可用图17-3表示。
洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：
Ve=Vo+KdVi
式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。
Kd可通过实验求得，上式可改写成：
上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。
因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。
Kd可以有下列几种情况：
1、当Kd=0时，则Ve=Vo。
即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积（图中组分Ⅰ）。
2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。
即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图中组分Ⅲ）。
可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。
同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们既使分子大小有不同，也没有分离效果。
因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。
3、当0＜Kd＜1时，Ve=Vo+KdVi。
表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Ve即在Vo+Vi之间变化（图中组分Ⅱ）。
4、有时Kd＞1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve＞Vo+Vi。
例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd＞1。
如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2。
在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。
这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。
此时Vi即不能以g·WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。
另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：
已知
在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒（Vi—Vo）作为固定相，而洗脱剂（Ve—Vo）作为流动相。
Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。
Ve与分子量的关系：
对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。
Ve与分子量的关系可用下式表示：
Ve=K1—K2logMr
K1与K2为常数，Mr为分子量，Ve也可用Ve—Vo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。
通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”，如下图所示。
曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。
在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。
凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。
用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。
例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。
用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其它方法的测定相对照，由此才可作出较可靠的结论。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源物质以及用于测定高分子物质的分子量。
2.试剂及器材：
试剂：
（1）标准蛋白质混合液（各2—3mg·ml-1，用氯化钾-乙酸溶液配制），牛血清清蛋白（Mr67000），鸡卵清蛋白（Mr43000），胰凝乳蛋白酶原A（Mr25000）和结晶牛胰岛素（pH2时为二聚体Mr12000）等均需层析纯。
（2）蓝色葡聚糖-2000（8—10mg·ml-1），N-乙酰酪氨酸乙酯（或硫酸铵或重铬酸钾）（8—10mg·ml-1）。
（3）0.025mo·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，Sephadex G—75（或G—100），5%Ba（Ac）2。
（4）待测蛋白质样品液。
器材：
层析柱：
柱管（直径1.0~1.3cm；管长90~100cm），核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计，自动部分收集器，恒压瓶，下口瓶。
3.操作步骤：
A.一般操作方法：
（1）凝胶的选择和处理
凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样，流速稳定，结果较好。
如果颗粒大小不匀，用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒。
将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。
注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。
溶胀时间因凝胶交联度不同而异为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100℃，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。
种类凝胶溶胀时间请查阅葡聚糖凝胶的技术数据表。
（2）装柱
装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气。
装柱方法与一般柱层析法相似。
层析柱可以自制或外购，目前已有各种规格层析柱商品（图17-6）。
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。
关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。
接着再通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。
新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为Blue dextran-2000）、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。
若层析柱床不均一，必须重新装柱。
（3）加样
要照顾到浓度与粘度两个方面。
分析用量：
1—2ml/100ml柱床容积（1—2%）；制备用量：
20—30ml/100ml柱床容积。
加样方法与一般柱层析相同。
夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约50cm处（Sephadex G-75，选用50cm液柱操作压），打开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。
沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。
按加样操作，用1ml洗脱液冲洗管壁2次。
最后加入3—4ml洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图17-7）。
（4）洗脱
洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。
洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。
对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇、水—乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。
本实验洗脱用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液。
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。
影响洗脱液流速的因素有：
①洗脱液加在柱上的压力——操作压（由液面差引起）。
一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小（WR＞7.5）的凝胶时要特别注意。
为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。
②凝胶交联度；交联度大的凝胶（G-10至G-50型）的流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。
交联度小的凝胶（G-75至G-200型）的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值，操作压见图17-8。
③凝胶颗粒大小：
颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。
颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。
要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。
（5）重装
一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3—4倍柱床体积的洗脱液过柱。
由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。
有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需竟混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。
（6）凝胶的保存方法
凝胶用完后，可用以下方法保存。
①膨胀状态：
即在水相中保存。
可按注意事项（9），加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。
②半收缩状态：
用完后用水洗净，然后再用60%—70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。
③干燥状态：
用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60—80℃干燥后保存。
这3种方法中，以干燥状态保存为最好。
B．蛋白质分子量测定
根据待测蛋白质的分子量范围选用Sephadex G-75或G-100型凝胶，其颗粒在40—120μm，柱管选用直径1.0—1.3cm，柱长90—100cm，一般选用1.1×100cm商品层析柱。
（1）测定Vo和Vi
将0.5ml蓝色葡聚糖-2000和硫酸铵混合液（2mg·ml-1）上柱、洗脱，分别测出Ve。
蓝色葡聚糖的Ve即为该柱的Vo，硫酸铵洗脱体积Ve减去Vo即为柱的Vi。
蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵洗脱峰用Ba（Ac）2生成沉淀判断（若用重铬酸钾，其洗脱峰，可根据颜色判断）。
（2）标准曲线的制作
按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液洗脱。
流速3ml/10min，3ml/管。
用部分收集器收集，核酸蛋白质检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计280nm处测定每管光吸收值。
以管号（或洗脱体积）为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。
然后，以蛋白质分子量的对数1gMr为纵坐标，Ve为横坐标,作出标准曲线（图17-9）。
为了结果可靠，应以同样条件重复1—2次，取Ve的平均值作图。
同时根据已测出的Vo和Vi以及通过测量柱的直径和凝胶柱床高度，计算出的Vt，分别求出Kd和Kav。
也可以Kd或Kav为横坐标，lgMr为纵坐标作出标准曲线。
（3）未知样品分子量的测定
完全按照标准曲线的条件操作。
4.结果与讨论：
根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定1—2次，取其平均值，也可以计算出Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。
注 意 事 项
（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。
（2）层析柱粗细必须
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