色谱机理：
分配否？
吸附否？
各种假设、各种理论，并不重要，关键是理解其洗脱规律！
疏溶剂理论（Δ，了解）
非极性组分或组分中的非极性部分受极性溶剂的排斥→
与非极性烷基缔合“疏溶剂缔合”
组分中的极性部分受极性溶剂的吸引→
与非极性烷基“解缔合”
→“疏溶剂缔合”与“解缔合”的竞争平衡
Horvath公式（经验公式，Δ，了解）
洗脱规律：
（1）溶质结构
溶质极性越弱，“疏溶剂缔合”越强【或“相似相溶”】，k增大，tR增大
溶质引入极性基团，“解缔合”增强，k减小，tR减小
（2）MP
①有机溶剂比例
NPC：
MP极性增大，与SP竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，tR减小
RPC：
与NPC相反！
MP极性增大【甲醇或乙腈量减小而水量增加】，与SP竞争分配（吸附）的能力减小，k增大，tR增大
*：
教材阐述的表面张力、介电常数乃一家之言，仅作参考。
“实验表明，k的对数值与流动相中有机溶剂的含量通常是线性关系，有机溶剂含量增加，k值变小”★
lgk∝1/C有机，tR=t0（1+k）【“预测有机溶剂比例改变之后的保留值变化”有用！
】
②pH值变化
pH值变化影响可解离物质的离解状态。
离解程度越高，极性越大，k越小，tR越小
∴常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制其解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间→ISC
ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。
提问：
弱酸的pKa若<3，则抑制其解离需要的pH值太小，键合相易被破坏；
同理，弱碱的pKa若>8，则抑制其解离需要的pH值（相对）太大，键合相易被破坏；
提示：
键合相的稳定pH偏酸，碱性条件相对易被破坏！
（3）SP
键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑
载体（适于在填充柱GC中使用）的钝化：
为了去除表面活性作用点，防止拖尾【酸洗法：
适于分析酸性化合物；碱洗法：
适于分析碱性化合物；硅烷化法（去硅醇基）：
适于分析易形成氢键的化合物】
提问：
立体位阻，残余硅醇基的吸附作用导致拖尾？
适用范围：
非极性至中等极性的组分
提问：
强极性组分根本不保留！
据不完全统计：
HPLC解决约80％的化合物分析；
RPC解决HPLC中的约80％的化合物分析（总约64％）
ODS解决RPC中的约80％的化合物分析（总约50％）
3PIC（espRP－PIC）
色谱机理：
离子对模型
方法核心：
给有机酸、碱、盐添加一个疏水的尾巴！
洗脱规律：
（1）离子对试剂的种类和浓度
分析酸或带负电物质：
季铵盐，如四丁基季铵磷酸盐
分析碱或带正电物质：
烷基磺酸盐，如正戊烷基磺酸钠
离子对试剂的烷基碳链长度↑，形成的离子对极性↓，溶质k↑
离子对试剂的浓度↑，溶质k先↑后↓（形成胶束聚集）
（2）流动相的pH值
pH值使组分完全解离，最有利于完全形成离子对，k最大。
流动相的pH值对弱酸、弱碱的影响大，对强酸、强碱的影响小。
适用范围：
有机酸、碱、盐，药物分析中的应用范围广泛，如生物碱、有机酸、维生素类、抗生素类等。
cf离子交换、离子抑制、离子对色谱
IEC：
完全离子化的、离子型化合物
ISC：
可离子化的，但离子化程度偏小可抑制的
PIC：
可离子化的，且离子化程度偏大难抑制的
Ⅲ、OtherkindsofHPLC
1Ionchromatography（IC）
IC是IEC相同机理的延伸。
许多无机或有机离子无紫外可见吸收，改用电导检测。
单纯用分离柱（即IEC）：
亮背景中检测暗线，灵敏度低
分离柱－抑制柱（IC常用模式）：
暗背景中检测亮线，灵敏度高
2Chiralchromatography（cHPLC）
三种方法：
CSP、CMP、衍生化
最常规CSP：
CD（cyclodextrin），手性柱昂贵！
药物手性普遍存在
手性药物临床意义重大
手性药物分离（制备）与手性药物合成同样挑战
3Affinitychromatography（AC）
本方法在“色谱概论”章已简单讨论过，分离机理类似免疫反应（抗原－抗体的识别），是所有色谱模式中选择性最高，回收率和纯化效率都很高的方法，是生物大分子分离分析的重要手段。
*：
以上IC、cHPLC、AC的固定相在下一节p430有一些描述，有兴趣的可以自行参阅，本课程不再展开，但可以作为综述、述评的内容的一部分！
第二节固定相与流动相
StationaryPhaseandMobilePhase
Ⅰ、Bondedphase（BP）ofBPC
固定相基本要求：
（1）颗粒细而均匀（涡流扩散A＝2λdp，λ为不规则因子，dp为颗粒直径）
（2）传质快（后面详细讨论）
（3）机械强度高，耐高压
（4）化学稳定性好，不与流动相或组分发生反应
LLC的SP已基本不用（经典LC中还有使用）；
LSE的SP（多孔硅胶与高分子微球）较少用；
∴本节主要讨论BP（不包括“IC、cHPLC、AC的固定相”）
1Typesofbondedphase
（1）non－polarBP：
RPC
C18，C8，C2，C1，Phen基硅胶
键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑
言下之意：
长链烷基可使溶质的k↑（分离时间长），分离选择性改善，稳定性也更好；
短链烷基使分离时间短（快速分离），当然选择性下降
苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物
（2）weakpolarBP：
RPCorNPC
醚基或醇基，较少用
（3）polarBP：
NPC（RPC）
氰基、氨基硅胶
氰基：
氰乙硅烷基，选择性与硅胶类似，更适合于选择性分离双键化合物（苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物）。
∵氰基硅胶极性>硅胶，∴某些硅胶不能分离的极性化合物可能可以在氰基硅胶上分离。
氨基：
偏碱性，不同于酸性的硅胶，适合于选择性分离多功能基化合物，如糖类化合物；在弱酸性介质中具有弱阴离子交换能力，能分离核苷酸。
∵氨基能与醛、酮反应，∴不宜分离羰基化合物，MP中也不得含羰基化合物。
2Characteristicsofbondedphase
（1）bondingreaction
二甲基氯硅烷与硅胶进行硅烷化而制得[高碳ODS键合相]：
*：
甲基二氯硅烷产生二硅氧烷键[中碳ODS键合相]
三氯硅烷产生三硅氧烷键[低碳ODS键合相]
提问：
哪种键合相的碳含量高？
高碳ODS键合相！
提问：
高碳ODS键合相的载样量？
大！
吸附/分配能力？
大！
组分的保留时间？
长！
（2）含碳量（carbonload）和覆盖度（coverage）
单/二/三硅氧烷键：
高/中/低碳ODS键合相：
40%——5%含碳量
表面覆盖度：
p424
提问：
哪种键合相的表面覆盖度高？
低碳ODS键合相！
Why？
空间立体位阻小！
残余硅醇基：
降低非极性SP的疏水性，使分离机理复杂化（次级吸附），且影响SP的性能稳定性。
封尾：
三甲基氯硅烷。
（3）固定相颗粒形状（geometry）（Δ，了解）
（4）ODS的不同类型（Δ，了解）
（5）键合相特点：
①柱子不“娇”，耐溶剂冲洗，不易流失
②化学稳定性、热稳定性好
③表面改性灵活，容易获得重复性产品
④载样量大
注意：
（1）MP的pH值应维持在2~8
*：
<2（2.5）硅氧烷键水解；>8（酸性的）硅胶溶解
*：
ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱
*：
某些型号的ODS经过特殊处理，适应的pH值范围宽些
（2）不同厂家、不同批号的同一类型键合相可能有不同的色谱特性
*：
硅胶来源及其处理、键合反应、封尾率等工艺无法完全重复
*：
报批数据实验应购置同厂家、同批号、同类型的色谱柱备用
*：
文献报道的色谱实验条件仅供参考
ISC：
常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制可解离物质的解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间。
ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。
【<2（2.5）硅氧烷键水解；>8（酸性的）硅胶溶解】
PICconditions（espRP－PIC）
洗脱规律：
（1）离子对试剂的种类
分析酸或带负电物质：
季铵盐，如四丁基季铵磷酸盐
分析碱或带正电物质：
烷基磺酸盐，如正戊烷基磺酸钠
离子对试剂的烷基碳链长度↑，形成的离子对极性↓，溶质k↑
p430表20－4
（2）流动相的pH值
pH值使组分完全解离，最有利于完全形成离子对，k最大。
（3）基本流动相的选择（同RP－HPLC）
有机溶剂（甲醇、乙腈）比例↑，组分k↓
组分疏水性↑，需要的有机溶剂比例↑
Ⅱ、MobilephaseofBPC
流动相基本要求：
（1）不与SP发生化学反应；
（2）对试样有适宜的溶解度，要求k在1～10之间，最好2～5之间（保证在选择性分离的前提下尽可能快地完成分析）；
（3）必须与检测器相适应：
如用UV检测时，只能选用截止波长小于检测波长的溶剂；如用MS检测时，则MP中慎用非挥发性盐（污染检测器）
提问：
溶剂的截止波长p209?
回答：
例如乙醇（常用溶剂）的截止波长为215nm，则检测波长必须大于215nm
（4）纯度高、粘度低、溶解气体量低
纯度高：
截止波长的考虑（进口HPLC级、国产HPLC级、AR级）
柱污染的考虑（微孔滤膜除去固体颗粒）
粘度低：
柱压降的考虑
eg：
乙醇的粘度（截止波长）>甲醇
溶解气体量低（低压后析出气泡的考虑）：
流速不稳定，保留时间不稳定
气泡干扰检测
严重的，泵空跑，影响使用寿命
1EffectofMPonseparation
分离方程式：
GC分离条件选择的三个主要方面：
固定液、柱温、载气的选择。
a项为柱效项，其中n为理论塔板数；
b项为柱选择项，其中α为分配系数比（或称“选择因子”）
c项为柱容量项，其中k2为第二个组分的容量因子。
HPLC分离条件选择的三个主要方面：
固定相（包括填充质量）、流动相种类和配比的选择。
n主要由固定相（包括填充质量）决定；
α主要由溶剂种类决定，溶剂种类改变，分子间作用力不同，可能使两组分的分配系数K变化，使α≠1；
k主要受溶剂配比的影响，配比改变，洗脱强度也改变，组分的分配系数K和容量因子k也改变；
2Solventstrengthandselectivity
（1）Solventpolarityandstrength
在BPC中，溶剂洗脱能力＝溶剂强度∽溶剂极性
在NPC中，溶剂极性↑，溶剂洗脱能力（溶剂强度）↑
在RPC中，溶剂极性↑，溶剂洗脱能力（溶剂强度）↓
溶剂极性的表示方法：
P’与S（Δ，了解）
表20－1，20－2
在NPC中，水的洗脱能力最大；在RPC中，水的洗脱能力最小；
在RPC中，最常用的两种有机溶剂，乙腈的极性（洗脱能力）稍>（<）甲醇，基本相当。
（2）Strengthofmixedsolvents
加权和，其权重为体积分数
（3）Solventselectivity（Δ，了解）
根据溶剂的受质子能力、给质子能力和偶极作用力，将常用溶剂分为8组，处于同一组中的溶剂作用力类型相同，色谱选择性类似。
言下之意：
混合MP时，同组的溶剂一般只选1种！
（多选基本上对优化无效）
3MPoptimization（Δ，了解）
液相色谱分离条件的优化一直是液相色谱领域比较引人注目的研究课题之一，是实现色谱分离分析智能化和自动化的关键。
由于实验条件与评价指标之间的关系十分复杂，寻找最佳实验条件十分困难，通常需要做大量的试探性实验来寻找尽可能好的实验条件，这样既花费大量的时间，也浪费了不少的材料。
如果能通过少量的试探性实验的分析，能找到最佳的实验条件则是非常有意义的。
优化的目的：
①高效分离（主要）；②快速（次要）
优化的方法：
①解析法和半解析法：
窗口图解法、混合液设计统计技术、四面体优化法等等
②黑箱法：
单纯形法、遗传算法、人工神经网络算法、模式识别法等等
第三节分离条件的选择
Section3Selectionofseparationconditions
1RatetheoryinGC
GC的发展与色谱速率理论的发展密切相关、相互促进。
本节再次讨论速率理论在HPLC的情况。
vanDeemter（范氏）方程的数学简化式为：
u为线速度；涡流扩散（eddydiffusion）A项、纵向分子扩散（longi-tudinaldiffusion）B项、传质阻力（resistancetomasstransfer）C项。
（1）eddydiffusion涡流扩散项A
A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，HPLC一般使用3～10um的小颗粒固定相，以5um最常用。
常采用球形硅胶，要求粒度均匀（RSD<5％）。
高压匀浆法填充，商品化为主。
（2）longitudinaldiffusion纵向分子扩散项B
γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。
Dm为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）。
∵液体中的分子扩散比气体中的扩散小约104，∴液体中的分子扩散忽略不计；
∵HPLC中的u>uopt，∴B项可以忽略不计。
（3）Resistancetomasstransfer传质阻力项C
①固定相传质阻力Cs
液相【固定相】传质阻力系数Cl（填充柱－毛细管GC）：
由上式看出，固定相的液膜厚度df越薄，组分在液相的扩散系数D1越大，则液相传质阻力就越小。
BPC的固定相为单分子层，df可忽略不计，所以Cl（/CS）可忽略不计。
②流动相传质阻力Cm
气相【流动相】传质阻力系数Cg（填充柱GC）：
由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。
在HPLC中：
由上式看出，流动相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比、与组分在流动相中的扩散系数Dm成反比。
③静态流动相传质阻力Csm
固定相微孔内的流动相传质阻力Csm∝dp2/Dm
于是HPLC中的vanDeemter（范氏）方程为：
H＝A＋Cmu＋Csmu
∵A，Cm，Csm均与dp正相关，∴dp越小，柱效越高【当然影响dp更小的因素是过高的柱压降、更高的颗粒制备与装填工艺】。
∵Cm，Csm均与Dm负相关，而Dm∝T/η，∴溶剂粘度越小，柱效越高。
That’swhy甲醇（η＝0.54）乙腈（η＝0.34）常用而乙醇（η＝1.84）少用。
又∴色谱系统的温度越高，柱效越高【当然温度过高，（？
）会使k值减小导致洗脱快而降低选择性，且热不稳定样品与不耐高温的固定相也有些问题！
出气泡！
】。
*：
乙腈的洗脱能力稍<甲醇，乙腈导致的柱效稍>甲醇，基本相当。
综上所述，速率理论指导的HPLC条件：
①小而均匀的球形键合相
②低粘度、适当快速的流动相
③适宜的色谱系统（esp色谱柱）温度
在GC中，“修正的范氏方程”指出，许多因素是互相制约、互相矛盾的，因此应全面考虑、综合平衡，才能达到较理想的分离效果。
在HPLC中，“修正的范氏方程”指出，除了固定相颗粒越小越好以外，其他因素也是互相制约、互相矛盾的……
第四节HPLC仪器
Section2HPLCInstrument
GC：
1CarriergassystemHPLC：
1Carrierliquidsystem
2Sampleinjectionsystem2same
3Columnsystem3same
4Detectionsystem4same
5Data/controlsystem5same
Ⅰ、Mobilephasepumpingsystem
•贮液器
•高压输液泵
•梯度洗脱装置
1MPreservior（补充，Δ，了解）
贮液器即存放洗脱液的容器。
常用材料：
玻璃、不锈钢等。
容积：
0.5~2.5升。
流动相脱气：
低压脱气法、惰性气体脱气法、超声波脱气法。
2Highpressurepump
高压输液泵的作用是将洗脱液在高压下连续不断地送入柱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
高压输液泵基本要求：
•输出压力高且平稳、脉动小，最高压力500kg/cm2
•流量稳定，精度≤1%；流量范围宽，0.01~10ml/min范围内任选
•耐酸碱缓冲液腐蚀
•泵体易于清洗
色谱泵的类型：
（补充，Δ，了解）
恒压泵、恒流泵等
图、双活塞泵、往复活塞泵
3Gradientelutionapparatus
梯度洗脱装置又称溶剂程序。
梯度洗脱中，在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比或极性配比，可缩短分析周期，提高分析效能，使峰形得以改善，增加灵敏度。
梯度洗脱相当于（？
）气相色谱的程序升温。
梯度洗脱装置分为：
低压梯度洗脱装置、高压梯度洗脱装置。
Ⅱ、Sampleinjectionsystem
进样系统是将被分析试样导入色谱柱的装置。
对进样阀的要求：
•重复性好，死体积小
•保证中心进样
•对色谱柱系统流量波动要小
•便于实现自动化
进样系统包括：
取样、进样两个功能。
进样方式包括：
•注射器进样
•阀进样（六通阀6-port-injection-valve进样最为常用）
•自动进样器进样
微量注射器（进样器）使用要点：
平头针、排气泡
Ⅲ、Separationsystem
色谱柱是系统的核心部件，一般要求：
分离度高、柱容量大、分析速度快。
色谱柱按规格分类：
分析型：
常量：
2~5mm（id）×10~30cm
半微量：
1~1.5mm（id）×10~20cm
制备型：
20~40mm（id）×10~30cm
色谱柱构造图、几种色谱柱图片
柱效检查：
硅胶柱、ODS柱、氰基与氨基柱的方法与要求各不同。
保护柱：
（补充，Δ，了解）
用途：
收集阻塞柱口的化学垃圾
位置：
流路过滤器和分析柱之间
实验后色谱柱的冲洗：
（补充，Δ，了解）
硅胶柱：
先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯乙烷、正庚烷各100-200ml依次活化
键合相柱：
20倍体积的甲醇:
氯仿，甲醇:
水依次冲洗
Ⅳ、Detectionsystem
基本要求：
灵敏度高、稳定性好、线性范围宽、响应快。
1sensitivity：
灵敏度（sensitivityS，响应值）：
单位物质的含量通过检测器时所产生的响应信号变化率。
2noiseandshift：
噪音（短时噪音、长时噪音）、漂移
3detectability：
检测限（detectabilityD，敏感度M）:
某组分的峰高恰好为噪音的二倍时，单位时间内载气引入检测器中该组分的质量或单位体积载气中所含该组分的量称检测限。
检测器主要性能：
教材p433
1ultravioletdetector
紫外检测器的优点：
①灵敏度高；噪音低，最低检出量可达10-7~10-12g
②不破坏样品，能与其它检测器串联，可用于制备
③对温度及流动相流量波动不敏感，可用于梯度洗脱
紫外检测器的缺点：
①被测物必须有紫外吸收
②流动相选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长
紫外检测器的类型：
①固定波长检测器
为光源波长固定的光度计，一般波长是254nm。
多数芳香族、芳杂环、稠芳环类以
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