荧光原位杂交的认识doc.docx

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对荧光原位杂交技术的认识

摘要:

荧光原位杂交技术（FISH）作为分子水平的微生物检测技术，已成为目前首要生物学核酸检测技术，本文主要介绍了FISH的发展及在污水处理中的应用，重点介绍了在硝化细菌方面的应用，并给出了FISH技术存在的缺陷及改进的方法。

Abstract:

Fluorescenceinsituhybridization（FISH）,asamicrobialmoleculardetectiontechnology,hasbecomethefirstbiologynucleicaciddetectiontechnology.ThispaperintroducesthedevelopmentofFISHandtheapplicationinwastewatertreatment,andmainlyintroducestheapplicationinnitrifyingbacteria.Furthermore,italsodescribesthedisvantagesinFISHandtheimprovedmethods.

关键词：

荧光原位杂交技术（FISH），16SrDNA（16SrRNA）,污水生物处理

荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization）是在同位素原位杂交技术基础上发展起来的非放射性原位杂交方法，起始于20世纪70年代后期。

它以16SrDNA（16SrRNA）探针用特殊的核苷酸分子标记然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维素切片上的定性，相对定量分析。

有不同细菌的16SrDNA都有其独特序列，利用这些独特的序列制成的探针可以鉴别和跟踪自然样品中的目标细菌。

最初FISH技术应用于医疗事业，目前FISH技术的应用范围也来越广，特别是FISH流程的简化完善和检测灵敏度的提高，使FISH成为一种首要的生物学核酸检测技术。

1.FISH的发展历史

1969年,Pardue【1】等和John【2】两个研究小组开发了原位杂交技术,用放射性同位素标记的DNA或28SrRNA和爪蟾卵细胞制备物进行杂交,然后进行显微放射自显影检测。

这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下,检测出细胞核酸序列,自此,原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。

早期的同位素标记没有专门的标记方法，将随机同位素标记的碱基添加到生长的细胞中再进行放射自显影。

虽然灵敏度高，但是放射性材料因半衰期较短引起探针不稳定，且分辨率有限，检测周期长，价格相对较昂贵，必须按照严格的程序转运、贮存和处理有放射性的材料。

【3】

1980年，Bauman【4】首次将荧光原位杂交用于核酸检测，直接接将RNA-3’端用荧光素标记作为特异DNA序列的探针。

氨基-烯丙基标记碱基技术可以与任何半抗原或者荧光素结合，这对于原位杂交是至关重要的，因为氨基-烯丙基标记的碱基技术可以仅通过简单的化学反应就可以获得一系列的低背景信号探针，通过杂交探针的二级检测系统使得杂交信号被放大。

早在19世纪80年代，缺口平移法检测、生物素标记探针，二级荧光标记抗体检测等方法已经用于DNA【6】和mRNA【7】检测。

FISH不仅用于单基因或核酸检测，FISH技术的进一步发展扩展到多色FISH多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。

【3】

Pinkel【8】等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测，采用双色激发块装置照相机检测荧光信号，而且定量分析技术很快用于了mRNA检测。

1988年,Giovannoni【9】等首次将FISH技术引入细菌学研究中,使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物。

随着荧光标记的发展,非同位素染料逐渐代替。

1989年,Delong【10】首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。

2.FISH的应用

在废水处理工艺中，对微生物鉴定的方法很多，传统的微生物的检测方法基本上有菌种分离培养法，镜检计数法。

菌种分离培养法对一些培养条件苛刻或没被培养过的细菌用途不大，重要的是它不能精确的反应菌群的组成及多样性。

镜检计数法，不但费时费力，还可能因为微生物形态、特性类似把它们当作同种微生物记错数，同时，没有活性的微生物有可能也会被计入总数。

随着分子生物学技术的发展,分子生物学方法已经成为现代环境微生物学的重要手段。

与放射性探针相比,荧光探针更安全,具有较好的分辨力,不需要额外的检测步骤。

此外,可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针,在一步反应中同时检测几个靶序列。

该技术特异性和敏感度都很高，使得那些环境中数量少，培养难度高的微生物的研究方便快捷了很多。

不仅可以应用到环境样品微生物多样性和污水处理中生物多样性的研究还可以应用到微生物群落组成及空间分布，原位生理学和功能性研究和特殊菌种的研究。

在聚磷菌方面的应用

荧光原位杂交（FISH）技术在聚磷菌的研究中可以在一定程度上反映污泥中聚磷菌的组成和空间结构。

2008年，张勇【11】等通过正交试验筛检可以确定FISH技术在检测反应器中聚磷菌最佳的优化条件。

在固定前应先经过1×PBS清洗两次,37℃热固定3h,乙醇脱水3min;FISH技术检测反应器中聚磷菌的最佳实验条件为:

杂交温度46℃,杂交时间2h,清洗缓冲液中NaCl浓度70mmol/L。

使聚磷菌的定量检测更加快、简便、准确。

亢涵,王秀蘅【12】等应用FISH对以乙酸钠为碳源的强化生物除磷（EBPR）SBR反应器启动期的微生物进行原位分析,考察了除磷生态系统形成过程中聚磷菌种群结构、空间分布关系动态变化及其聚磷特性。

在厌氧反应细菌的应用

Santegoeds【13】等人利用ARC915,SRB385,DSV698和DSS658等探针发现,产甲烷菌主要分布在颗粒污泥的内部,而硫酸盐还原菌则分布在外层;Sekiguchi【14】等人也得到类似结论。

2006年，许鑫【15】等应用FISH检测厌氧反应器里的硫酸盐还原细菌，并对其试验条件进行优化。

硫酸盐还原菌的较好的杂交条件是杂交温度46℃，杂交时间3h,NaCl浓度为90mmol/L。

杂交时间和温度均影响探针的特异性，在一定温度范围内提高杂交温度会提高探针的特异性；杂交时间过短会造成探针结合不完全，过长会增加非特异性着色；杂交洗脱液NaCl浓度过高会降低探针特异性。

同年，陈瑛，任南琪【16】等应用FISH技术研究了连续流搅拌槽（CSTR）解析发酵产氢细菌中的2种产氢发酵类型的菌群组成和发酵类型转化过程中的菌群种类和数量变化及其对产氢速率、生物量和发酵产物的影响.结果表明,梭菌属和肠杆菌科在决定产氢发酵类型方面有重要作用.以梭菌为优势种群的乙醇型发酵比以肠杆菌为优势种群的丁酸型发酵具有更佳的产氢能力。

Harmsen【17】等人利用EUB338,ARC915,MX825和MG1200等探针的不同组合以蔗糖为基质和以混合酸为基质的颗粒污泥分层不同。

其前者为：

三层，由外到内，真细菌，产氢产乙酸细菌和产甲烷丝菌的共生体，较大空洞有少量产甲烷细菌和无机物。

后者为两层，外层真细菌，内层产甲烷丝菌为主。

对肠道细菌的应用

1995年，Langendijk等【18】首次采用探针Bif164用FISH对人肠道双歧杆菌进行定量分析。

2004年，Takada等【19】用3种不同荧光集团组合，并用7种针对双歧杆菌的探针染上不同的探针，成功的运用了多色荧光原位杂交技术。

2004年，王建龙【20】利用FISH检测水体中大肠杆菌，可以在一天内给出定量检测结果。

但还没有广泛用于饮用水中的大肠菌群计数，原因是饮用水中的细菌因缺乏营养物处于饥饿状态且受消毒剂的影响。

其细胞内的染色体含量较低，是杂交产物的荧光信号很弱。

利用PAN（是一种合成的核酸,用肽骨架取代了核酸中的戊糖-磷酸骨架,是一种新型的DNA模拟物,具有与DNA和RNA结合的高度亲合性和良好的稳定性）代替DNA或利用荧光扩增系统可以提高检测的灵敏度和杂交信号的荧光强度。

在生物脱氮方面的应用

Helmer【21】等以NSO1225探针和Amx208202a2A222探针分别对生物膜内细菌进行了FISH检测,发现亚硝酸细菌主要分布于生物膜的好氧表层,而厌氧氨氧化菌（Kuene2niastuttgartiensis）则主要分布于生物膜的缺氧内层。

Michael【22】等用同样探针对CANON（CompletelyAutotrophicNitrogenOverNitrite）反应器中的颗粒污泥进行研究时也发现了类似的结果。

Schramm【23】等应用FISH技术并将聚焦显微镜和相差显微镜图像叠加，对硝化流化床反应器中活性污泥内硝化细菌的空间分布进行原位分析，发现氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌紧密结合在一起的形态特征。

IngoSchmidt【24】等在研究好氧与厌氧氨氧化菌的生存关系时发现Kueneniastuttgartiensis和BrocadiaanammoxidansDokhaven紧密结合在一起的形态特征。

Jang等用Nsm156作为探针研究SBR中的好氧颗粒污泥的群落结构特征时发现:

氨氧化菌含量很高,但分布并不均匀,大部分集结成球状,有些甚至在颗粒污泥的缺氧区。

这一研究结果表明颗粒污泥中的氨氧化菌含量可能高于絮状活性污泥,从而可以实现更高的氨负荷。

Silyn【25】等对废水处理湿地生物进行了研究,结果也表明亚硝化单胞菌是其生物膜上的主要氨氧化细菌。

Kazuaki【26】等用EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探针研究了同时硝化反硝化好氧膜生物反应器中生物膜上的菌群结构,结果表明氨氧化菌是生物膜中的优势菌群,而亚硝酸盐氧化菌则未被检出。

Han-WoongLee【27】等用EUB338作为一级探针,ALF1b,BET42a,GAM42a和CF319a作为二级探针对两个不同脱氮反应器活性污泥中的分子生物学特征进行了定量研究，变形菌纲-β亚纲是反应器中的优势菌群，变形菌纲-γ亚纲是反应器中的第二大优势菌群。

Sachiko【28】等用自己设计的Clw844、PSMg43、Hlm474等探针对含盐废水处理脱氮系统中的生物群落进行了定量研究，结果表明,Hlm474探针所代表的Halomonas1.sp是反应器能实现脱氮最重要的菌属。

张丹【29】等研究了OLAND（Oxygen-LimitedAutotrophicNitrification-Denitrification）反应器中硝化菌群随溶氧浓度降低的变化规律,在限氧条件下,硝酸细菌不能与亚硝酸细菌竞争氧,也不能与厌氧氨氧化菌竞争亚硝酸盐。

FISH与PCR-DGGE和16SrRNA/rDNA序列分析等技术相结合是对污水处理构筑物中生物脱氮群落进一步研究的发展方向。

3.FISH的检测步骤

各种微生物的FISH的检测步骤基本相似，都是预处理，固定，杂交，洗脱，镜检。

只是由于微生物的生理性质不同，所以预处理方法不同，探针、杂交温度、杂交时间，脱水时间，洗脱液NaCl浓度各不相同。

探针都是采取16srDNA（16srRNA）用特殊的核苷酸分子标记，其他条件需要根据可以根据正交试验测出来。

首先，简单介绍一下几类细菌的预处理。

厌氧颗粒污泥的预处理

从处理装置或试验装置取出颗粒污泥,经沉淀和清水漂洗后,用多聚甲醛磷酸缓冲液进行固定,然后浸入熔化的塑化石蜡（paraplast）中,冷却后切片,切片厚度一般为5～10μm,将切片在50℃水中进行延展后转移到玻片上,在42℃条件下干燥后在二甲苯中浸泡30min,再用二甲苯-TBA-乙醇混合液进行冲洗,即完成了颗粒污泥样品的预处理。

聚磷菌的预处理过程

（1）取1.5ML污泥于2ML离心管并于14000转离心5分钟。

（2）去除1.25ml上清液,震荡使之重新悬浮,并加入0.75ml固定液。

（3）震荡1分钟后于4℃冷藏2小时。

（4）6000转离心5分钟,去除上清液,加入0.9ml1×PBS。

震荡1分钟。

（5）重复步骤4两次。

最后离心去除上清液后加入0.2ml1×PBS,震荡1分钟。

（6）加入等体积96%酒精可在-20℃下冷藏数月备用。

（7）取3ul预处理过的污泥到载玻片上,37℃的烘箱热固定3小时;依次用50%,80%,96%（质量分数）乙醇室温下脱水3分钟。

硝化细菌的预处理

（1）活性污泥　用0.1%（质量分数）DEPC浸泡的聚乙烯管子采样;4%（质量分数）的多聚甲醛于4℃固定4h;将固定样本用磷酸缓冲液离心漂洗2次,用w（PBS）∶w（乙醇）=1∶1液稀释备用;10μL的样品涂于包埋明胶的玻片,37℃的烘箱热固定;依次用50%,80%,96%（质量分数）乙醇室温下脱水.

（2）水样　水样直接按1∶1加入4%（质量分数）的多聚甲醛,4℃固定4h,用苏丹黑B染色,硝酸纤维膜过滤后,进行热固定、脱水等处理步骤.

其次，以硝化细菌的具体检测步骤如下：

1）玻片处理

（a）玻片清洗：

热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。

（b）硅化处理：

玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。

（c）明胶涂片制备：

将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。

（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1mL/LDEPC（DiethylPyrocarbonate）水溶液浸泡处理（37℃、2h，室温过夜），高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。

称量试剂勺也要干烤。

塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0.5mL/LDEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。

若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。

（e）各种溶液的配制：

凡是水溶性液体均用1mL/LDEPC水配制。

2）样品制备及其所涉及的试剂包括：

（a）缓冲溶液

1×PBS缓冲溶液：

NaCl8g，Na2HPO42.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，溶入1000mL超纯水；

3×PBS缓冲溶液：

NaCl24g，Na2HPO48.7g，KCl0.6g，KH2PO40.6g，溶入1000mL超纯水；

通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。

（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）

称取2gPFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。

然后向其中加入16.5ml3×PBS缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。

向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。

用0.45微米的膜过滤后使用。

（室温或4℃保存备用）。

注意：

1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。

4%PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。

样品固定时间在2~3小时，RNA含量较为恒定。

过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。

（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。

（d）DAPI溶液

用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9mM的DAPI溶液（1mgDAPI/1mLH2O）。

（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。

取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10-50µM的DAPI溶液。

3）取样及保存方法

（a）反应器沉淀前取样2~5mL至离心管。

（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。

（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h。

（d）样品离心（12000r/min）5min，去上清夜。

（e）加入1×PBS，摇匀，离心（10000r/min）5min，去上清夜（重复3次）。

（f）加0.5mL1×PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。

4）样品固定：

稀释样品3~5倍，对样品进行超声处理（3W超声2~3min，沉降1min，去

沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数。

然后取3μL样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h（或者在空气中干燥2h或者过夜）。

依次用50%、80%、98%（质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。

5）样品杂交

试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（HybridizationBuffer,HB）和淋洗缓冲液（WashingBuffer,WB），其组分如表3-2和表3-3。

表3-2杂交缓冲液（HybridizationBuffer）

5%

10%

20%

30%

35%

40%

0.05%SDS（μL）

1.2

1.2

1.2

1.2

1.2

1.2

50mMTri-HCl（μL）

24

24

24

24

24

24

5molNaCl（mL）

4.32

4.32

4.32

4.32

4.32

4.32

甲酰胺（mL）

1.2

2.4

4.8

7.2

8.4

9.6

蒸馏水（mL）

18.4548

17.2548

14.8548

12.4548

11.2548

10.0548

探针

Nsm156

Ntcoc206

Ntspn693

Nsv443

Ntspa662NSO1225Nmv

NIT3

表3-3淋洗缓冲液（WashingBuffer）

组分

体积

0.05%SDS

0.6μL

50mMTri-HCl

12μL

5molNaCl

2.16mL

蒸馏水

42.8274mL

（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。

（b）吸取10μL探针贮存液和80μL杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表3-4所示。

表3-4用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件

探针

探针序列（5’~3’）

标记细菌种属

浓度a

参考文献

NSO1225

CGCCATTGTATTACGTGTGA

Ammoniaoxidizingbeta-proteobacteria

35

[38]

Nsv443

CCGTGACCGTTTCGTTCCG

Nitroso-spira,-lobus,-vibrio

30

[38]

Nmv

TCCTCAGAGACTACGCGG

Nitroso-coccus

35

[39]

Ntspa662

GGAATTCCGCGCTCCTCT

Nitrospira

35

[40]

NIT3

CCTGGCTCCATGCTCCG

Nitrobacter

40

[41]

Ntcoc206

CGGTGCGAGCTTGCAAGC

Nitrococcusmobilis

10

[42]

Ntspn693

TTCCCAATATCAACGCATT

Nitrospinagracilis

20

[42]

注：

a表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）

（c）吸取9μL预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2~3h；

（d）杂交后的洗脱：

打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。

杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。

6）DAPI染色

每孔滴9uLDAPI，4℃暗处5min，4℃冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。

用带有360nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。

7）封片

涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。

8）荧光显微镜进行检测

每个样品及每个探针都采集20个不同区域。

每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。

细菌丰度或细菌数目（cells/g或cells/L）为AS1/（S2V），其中A为视野中细菌平均数；S1为样品涂抹面积；S2为视野涂抹面积；V为样品体积。

FISH技术存在的不足及改进

FISH检测有时会出现假阳性和假阴性结果。

造成假阳性的原因有两种：

自身荧光和缺乏特异性。

微生物的培养基、固定方法和封闭剂对荧光的信号强度均有很大的影响。

使用狭窄波段的滤镜和信号放大系统能降低自身背景荧光。

在进行数字处理时减少像数可以消除自身荧光，使用共聚焦激光扫描显微镜可以通过分析自身荧光减少FISH检测影响。

FISH检测的精确性和可靠性主要依赖于寡核苷酸探针的特异性，探针的特异性和灵敏性也取决于杂交条件,杂交和洗脱温度、变性剂的浓度等。

造成假阴性原因有：

探针穿透力不足；rRNA形成的三维结构,导致寡核苷酸探针的差别感受性而无法接近靶序列,阻碍了杂交；低rRNA含量和光脱色。

细胞壁结构影响探针穿透力，因此要对革兰氏阴性菌进行特殊的固定和预处理，采用PAN探针可以克服寡核苷酸探针的差别感受性，提高杂交效果。

使用高亮度的荧光染料Cy3或Cy5和多重探针标记,以及应用信号放大系统或多聚核苷酸探针均可增强杂交信号。

使用细菌探针是控制因方法学问题而导致假阴性结果的最好手段

参考文献

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cytologicalpreparations[J].ProcNatlAcadSciUSA,1969,6464:

600-604.

【2】　JohnH,BirnstielM,JonesK.RNA:

DNAhybridsatthecytogeneticallev2el[J].Nature,1969,223:

582-587.

【3】赵婷婷2008荧光杂交技术的发展与应用