0215001引导文发酵罐补料操作.docx

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0215001引导文发酵罐补料操作

子情境：

引导文

谷氨酸发酵过程控制-发酵罐补料操作

阅读材料

材料一：

谷氨酸的性质

中文名

L-谷氨酸

结构式

英文名

L-glutamicacid

商品名/别名/化学名

麸酸/L-2-氨基戊二酸

英文缩写

Glu

CAS号/PubChem

56-86-0/611

化学式

C5H9O4N

摩尔质量（g/mol）

147.12926

等电点

3.22

密度（kg/m3）

1.538

熔点

200℃升华，247-249℃分解

解离常数

pK1（-COOH）=2.19；pK2（-COOH）=4.25；pK3（-NH3）=9.67

溶解性

水中溶解度（%）：

0.34（0℃），0.72（20℃），1.51（40℃）2.19（50℃），5.52（75℃），14（100℃）。

在乙醇、丙酮、乙醚中不溶

稳定性

结晶状态稳定

光谱学性质

[α]20D=+31.8o

完成下列信息！

谷氨酸具有哪些性质？

----------------------------------------------------

材料二：

谷氨酸主要用途简介：

（一）  食品工业：

谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。

（二）  日用化妆品：

谷氨酸作为营养药物可用于皮肤和毛发。

N—酰基谷氨酸钠系列产品是由谷氨酸缩合而成的性能优良的阴离子表面活性剂，广泛用于化妆品、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等产品中。

焦谷氨酸钠（味精脱水生成的产物）具有极强的吸湿性，能保持皮肤湿润，防止干燥，并增强皮肤和毛发的柔软和弹力。

日本己有以谷氨酸钠（或谷氨酸）为原料生产的高级人造革、化妆品和洗涤剂等产品。

（三）  医药行业：

谷氨酸作有较高的营养价值，医学上主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。

（四）  农业：

谷氨酸与某些激素配合，可制成柑桔增甜剂；还可作为微肥的载体，在氮磷钾基本满足的条件下，作为叶面喷洒的微肥具有投入少、效益高等特点。

谷氨酸钠既是西红柿保护性杀菌剂，又是防治果树腐烂病的特效杀菌剂。

氨基酸铜是目前生产上良好的杀菌剂，有机铜比无机铜的应用效果好。

思考一下：

谷氨酸属于发酵工业产品类型中的哪种？

A微生物菌体B微生物代谢产物C微生物酶制剂

材料三：

谷氨酸生产水平与市场分析

 生产水平：

谷氨酸棒状杆菌-生物素敏感型高产菌株：

采用生物素亚适量工艺，发酵32h，产酸达140g/L以上，糖酸转化率达62%以上，国内同类研究的领先水平。

谷氨酸棒状杆菌-谷氨酸温度敏感型突变株：

在最佳发酵条件下，发酵24h，产酸达到160g/L，糖酸转化率达72%，国际同类研究的先进水平。

市场分析：

我国味精工业的产量稳居世界第一位，2007年全国味精产量达190万吨。

味精工厂的味精平均销售价格为7,800元/吨，成本为7,000元/吨。

按照上述产量计算，我国味精工业中纯味精的总产值约150亿元，加上相当于上述总值30%的副产品（主要是饲料蛋白、化肥、液态肥料）的产出，我国味精工业年生产总值约为200亿元人民币。

我国谷氨酸生产具有很大的市场效益，研究谷氨酸生产有重要意义！

相关资料

材料一：

谷氨酸的代谢通路、关键酶、调控机制

代谢途径：

谷氨酸产生菌中谷氨酸的生物合成途径如图所示：

其中的代谢途径包括糖酵解途径（EMP）、磷酸己糖途径（HMP）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应（CO2固定反应）等。

葡萄糖经过EMP（主要）和HMP途径生成丙酮酸，其中一部分氧化脱羧生成乙酰CoA进入TCA循环，另一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化下，所合成柠檬酸，再经过氧化还原共扼的氨基化反应生成谷氨酸。

关键酶：

α-酮戊二酸脱氢酶，谷氨酸脱氢酶

调控机制：

一．谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反阻遏，代谢转向合成天冬氨酸。

二．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定的关键酶，受谷氨酸的反馈抑制。

三．柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏。

四．谷氨酸脱氢酶受谷氨酸的反馈抑制和阻遏。

由葡萄糖合成谷氨酸的代谢途径是什么？

材料二：

发酵罐控制软件操作系统

1.开启软件

打开总电源启动计算机─>计算机进入Windows─>按任务条上的“开始”按钮─>程序─>发酵罐控制系统─>tophawkm进入软件。

本软件有总貌图和分罐图两个主要画面。

2.总貌图

总貌图显示了发酵罐的所有检测参数以及运行、通讯情况等，如下图所示。

图1总貌图

（1）通讯开始和停止

开始：

按下总貌图上各个罐所对应的通讯按钮─>出现“通讯端口打开”对话框─>按“确定”返回并且状态文本框显示“开”─>通讯开始。

停止：

按下总貌图上各个罐所对应的通讯按钮─>状态文本框显示“关”─>通讯停止。

如果开始通讯时出现“打开通讯端口出错！

”对话框则先停止通讯，检查硬件设置和连接，确定正确后再开始通讯。

（2）发酵开始和停止

开始：

按下总貌图上各个罐序号所对应的按钮─>出现“Initialize”对话框─>如果是新批号选择“新建项目”，并在旁边的文本框中输入批号名称（13个字以内）；如果继续上一次的批号选择“继续采样”（如果继续采样旁边的批号名称不对，可按“选择批号”按钮，从对话框中选择正确的批号项目文件，按“打开”返回）─>按“确定”按钮返回─>总貌图上该罐所对应的状态文本框显示“运行状态”。

停止：

按下总貌图上各个罐序号所对应的按钮─>按“确定”返回─>结束本批号。

3.分罐图

图2控制软件分罐图

图3控制软件参数设定窗口

（1）温度控制

按下“温度（℃）”按钮，进入温度自动控制状态，再按此按钮，使此按钮弹起，退出温度自动控制状态；

按下“手动加热”按钮，强制加热，再按此按钮，使此按钮弹起，退出强制加热；

按下“手动冷却”按钮，强制冷却，再按此按钮，使此按钮弹起，退出强制冷却。

温度控制参数中，自控P为控制系数，表示达到最大控制时间所需要的温度偏差；CP为控制周期；罐温死区表示在此温差范围内不加热也不冷却；最大加热时间、最小加热时间、最大冷却时间、最小冷却时间表示单个控制周期内的控制时间上下限。

当检测到的温度与实际的温度有偏差时，可用“温度补偿”来校正，电脑显示的温度=采样得到的温度+温度补偿。

（2）pH控制

按下“pH”按钮，进入pH自动控制状态，再按此按钮，使此按钮弹起，退出pH自动控制状态；

按下“加酸”按钮，强制加酸，再按此按钮，使此按钮弹起，退出强制加酸；

按下“加碱”按钮，强制加碱，再按此按钮，使此按钮弹起，退出强制加碱。

pH控制参数中，自控P为控制系数，表示达到最大控制时间所需要的pH偏差；CP为控制周期；pH死区表示在此pH偏差范围内不加酸也不加碱；最大加酸时间、最小加酸时间、最大加碱时间、最小加碱时间表示单个控制周期内的控制时间上下限。

（3）转速控制

按下“转速（RPM）”按钮，进入转速自动控制状态。

关转速时，再次按“转速（RPM）”按钮，使此按钮弹起，退出转速自动控制状态，停止搅拌。

转速控制参数中，P、I、D为控制的三个重要参数。

P为比例系数，P越大转速向设定值靠近得越快，但太大会造成控制不稳定；I为积分系数，使控制变得更稳定，I越大积分项越小；D为微分系数 ，是控制的提前量，使控制变得更稳定；PID的值随不同机器而变，以能控制快速和稳定为基准，未弄清楚前请勿任意修改。

（4）溶氧与转速联动控制

按下“溶氧与转速关联”，进入溶氧与转速联动控制。

控制参数有溶氧设定上下限、转速设定上下限、转速递变幅度、转速递变时间。

当溶氧测量值在溶氧设定上下限范围外时，维持转速递变时间仍如此的话，转速相应地增加和减小转速递变幅度，如果溶氧还是没有回到溶氧设定上下限范围内，转速继续递变，但转速设定值始终在转速设定上下限内。

当要撤消联动控制，又要保持当前转速时，先修改参数，将当前转速值填入自动转速设定值的输入框中，发送参数，再保持“转速（RPM）”按钮处于按下状态，弹起“DO与转速关联”按钮即可。

完成以下信息！

1.如何操作发酵控制软件？

材料三：

谷氨酸发酵的优化问题

 谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，环境条件对谷氨酸发酵具有重要的影响，控制最适宜的环境条件是提高发酵产率的重要条件。

（1）碳源：

目前使用的谷氨酸生产菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖等，有些菌种还能利用醋酸、正烷烃等做碳源。

在一定的范围内，谷氨酸产量随葡萄糖浓度的增加而增加，但若葡萄糖浓度过高，由于渗透压过大，则对菌体的生长很不利，谷氨酸对糖的转化率降低。

国内谷氨酸发酵糖浓度为125-150g/L，但一般采用流加糖工艺。

（2）氮源：

常见无机氮源：

尿素，液氨，碳酸氢铵。

常见有机碳源：

玉米浆，豆浓，糖蜜。

当氮源的浓度过低时会使菌体细胞营养过度贫乏形成“生理饥饿”，影响菌体增殖和代谢，导致产酸率低。

随着玉米浆的浓度增高，菌体大量增殖使谷氨酸非积累型细胞增多，同时又因生物素过量使代谢合成磷脂增多，导致细胞膜增厚不利于谷氨酸的分泌造成谷氨酸产量下降。

碳氮比一般控制在100：

15-30。

（3）磷：

当磷浓度过高时，很容易发生发酵转换，转向合成缬氨酸；但磷浓度过低，则菌体生长不好，不利于高产酸。

（4）生物素：

随着生物素添加量的不断增加，发酵产酸先增大后减小。

当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸,同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成,使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%；生物素亚适量时，菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累,发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。

因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。

生产中可以采取在发酵后期补加生物素的方法提高谷氨酸的合成。

（5）溶氧：

谷氨酸发酵是典型好氧发酵，溶解氧对谷氨酸产生菌种子培养影响很大。

溶解氧过低，菌体呼吸受到抑制，从而抑制生长，引起乳酸等副产物的积累；但是并非溶氧越高越好，当溶氧满足菌的需氧量后继续升高，不但会造成浪费还会由于高氧水平抑制菌体生长和谷氨酸的生成。

（6）pH：

在谷氨酸发酵过程中，随着谷氨酸的不断生成，发酵液的pH值不断的减小，对谷氨酸菌产生抑制，为了维持发酵的最佳条件，pH：

前期pH（7.5~8.0），中后期pH7.0~7.6。

采用流加尿素和液氨（现在大多采用的是液氨）的方法。

发酵法在微生物发酵阶段，主要是获得谷氨酸，在氨过量存在的情况下以谷氨酸铵的形式存在，所以从发酵罐出来的是谷氨酸铵，而不是我们所希望的谷氨酸。

（7）温度：

在整个流加发酵中，并非一定要控制恒温培养，因为菌体最适生长温度不一定是菌体积累代谢终产物的最佳温度。

谷氨酸菌体最适生长温度为30-32℃；谷氨酸最适合成温度为34-37℃；发酵初期温度提高可以缩短细胞生长时间，减少发酵总时间；发酵中、后期的菌体活力较强，适当提高发酵温度有利于细胞膜渗透性和产酸，故温度应控制稍高一些。

（8）泡沫：

谷氨酸发酵是好气性发酵,因通风和搅拌产生泡沫是正常的,但泡沫过多会带来一系列问题:

（1）泡沫形成泡盖时,代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢；

（2）泡沫过多,发酵液会外溢,造成浪费和污染;（3）泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。

因此，在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。

谷氨酸发酵过程中，生产菌种的特性、生长素、发酵温度、pH值、溶氧和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。

在实际生产中，只有针对存在的问题，严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。

完成以下信息：

影响谷氨酸积累的主要因素有哪些？

并简述如何控制这些因素？

材料四：

谷氨酸发酵过程中几种指标的检测

一.谷氨酸的检测

1.原理：

茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。

氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。

该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。

2.试剂与材料

（1）标准氨基酸溶液：

配制成0.3mmol/L溶液。

（2）pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：

量取86mL2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL2mol/L乙酸混合而成。

用pH检查校正。

（3）茚三酮显色液：

称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。

茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：

称取5g茚三酮溶于15～25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。

加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。

次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备：

称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。

将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。

滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。

乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：

在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

（4）60％乙醇。

（5）样品液：

每毫升含0.5～50μg氨基酸。

（6）分光光度计。

（7）水浴锅。

3.操作步骤

①．标准曲线的制作

分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。

各加入1mLpH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。

放置5min后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。

（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。

以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

②．氨基酸样品的测定

取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。

放置5min后，加3mL60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。

4.将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。

二、还原糖的测定（用3，5－二硝基水杨酸比色法）

1.原理

还原糖的测定是生化分析中常做的项目，最简单的方式是分光光度计法。

在碱性条件下，显色剂DNS与还原糖供热后被还原成红棕色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与显色后溶液的颜色强度成比例关系，因此可用分光光度法测定样品中还原糖的含量。

2.步骤：

样品稀释1000倍取1ml+DNS1mL沸水浴5min

梯度标样配制

520nm测吸光度定容至10ml

生物传感器测定还原糖含量的方法也非常简便快捷。

三、革兰氏染色

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，

具体操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）自来水冲洗。

4）加碘液覆盖涂面染1分钟。

5）水洗，用吸水纸吸去水分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。

7）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。

干燥，镜检。

染色的结果：

革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

四、生物素的检测

采用高效液相色谱法测定发酵液中生物素的含量。

色谱柱为SymmetryC18,流动相为V（甲醇）:

V（pH2.5磷酸缓冲溶液）=14:

86,检测波长为210nm,柱温为35℃。

结果表明,样品进样量在5-150μg/mL范围内线性关系良好,加样回收率在95%以上,相对标准偏差RSD为6.6%,最低检测限为0.01μg/mL。

该方法简便、快捷、准确、重现性好,可用于发酵液中生物素的含量测定。

五、菌浓的测定：

吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用752分光光度计于1cm光程测定OD620nm.

让我们回答问题吧！

1.谷氨酸标准曲线如何制作？

2.还原糖标准曲线如何制作？

为什么谷氨酸发酵要检测还原糖的含量？

3.谷氨酸发酵分批补料的作用

4.谷氨酸的菌种浓度的测定方法是什么？

还可以采取什么方法测定？

5.为什么需要革兰氏染色？

其目的是什么？

材料五：

谷氨酸发酵分批补料资料

（一）谷氨酸分批补料的作用

1、可以控制抑制性底物的浓度

高浓度营养物抑制微生物生长：

①基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；

②高浓度基质能使微生物细胞热致死（themaldeath），如乙醇浓度达10％时，就可使酵母细胞热致死；

③有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚（3％～5％）可凝固蛋白；

④高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。

有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。

如苯乙酸、丙醇（或丙酸）分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。

有的底物溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率。

如甾类化合物转化中，因它们的溶解度小，使基质的浓度低，造成转化率不高。

采用FBC方式，可以控制适当的基质浓度，解除抑制作用，得到高浓度的产物。

2、解除或减弱分解代谢物的阻遏

有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。

通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。

缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02％水平，赤霉素浓度可达905mg／L；采用滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。

这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。

在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。

3、可以使发酵过程最佳化

分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。

利用FBC技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。

随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。

随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制

FBC的优点：

①解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；

②避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质；

③可提高发芽孢子的比例，控制细胞质量；

④不需要严格的无菌条件，产生菌不易老化变异，比连续发酵适用广泛。

（二）补料控制的方式？

（1）间歇补料（分批补料）

间歇补料是指在发酵过程中，补充的物料分成若干次补料到发酵罐中。

（2）连续补料

在谷氨酸发酵过程中，补充的物料连续流加进入发酵罐中。

（三）谷氨酸发酵补糖的控制

（1）补糖量——加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度；

谷氨酸追加糖液发酵：

在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维持2%左右的糖浓度。

补糖开始时，不但CRR、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。

（2）补糖时机

过早，刺激生长，加速糖利用；

过迟，所需能量跟不上。

如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。

判断：

培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，pH，菌形态等），在需要时加入；

（四）谷氨酸发酵补料的配比

通过补料，可以改变谷氨酸合成期的培养基成分的配比，使之适合谷氨酸的合成，在整个设计方案中，通过两种方式控制补料配比，一方面是所补料的配比，两一方面是所补料液的速度。

让我们回答问题吧！

1.谷氨酸发酵分批补料的作用

2.补料控制的方式？

知识拓展：

1.采取何种方法可以改善谷氨酸的生产菌种来提高谷氨酸产量？

2.如何测量发酵液中氮的含量？

补氮的措施应是如何？

3.如果是测量糖化酶发酵过程中的生物量，应该用哪种方法？