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第4章生药的安全性评价

四生药的安全性评价

四、一生药中内源性有害物质的检测

四、一、一生药中主要的内源性有害物质

生药内源性有害物质主要为两大类,即肝毒性成分和肾毒性成分。

1.肝毒性成分

  肝毒吡咯里西啶生物碱(heptotoxicpyrro1izidinealkaloids,HPAs)是目前已知的最重要的植物性肝毒成分,其共同的结构特征是1,2位具双键的不饱和necine酯,如野百合碱(monocrotaline)和千里光碱(senecionine)。

千里光碱

野百合碱

  实际上,这类生物碱本身没有毒性,毒性来自其在体内(主要是肝脏)的代谢产物—代谢吡咯(metabo1icpyrro1es),后者具很强的亲电性,能迅速地同有关的酶、蛋白、DNA及RNA结合,引起各种毒性反应。

摄入HPAs引起的主要病变是肝静脉阻塞性疾病(HVOD),表现为急性肝炎、严重腹痛、呕吐、腹泻、腹水、肝肿大、黄疸、水肿。

慢性HVOD可表现为轻度恶心、厌食、疲劳或肝肿大。

如不治疗,可发展为肝硬变和坏死。

除了亚急性HVOD外,其余情况下总是表现为血清肝酶水平升高。

流行病学调查显示:

在南非、阿富汗、伊朗、牙买加、印度及前苏联等国家,大量肝病的发生与食用含HPAs的谷物、饮用含HPAs的饮料(牛奶、茶叶等)及服用含HPAs的草药有关。

因服用含HPAs的草药而引起中毒死亡的现象时有报道,从而引起国际医药学界的关注。

  世界上约有3%的有花植物,即6000余种植物含有HPAs,但主要分布于紫草科(所有属),菊科(千里光族及泽兰族)及豆科的猪屎豆属。

初步统计显示含HPAs的中草药共38种,其中临床常用或较常用的有12种如农吉利CrotalariasessilifloraL.、猪屎豆C.mucronataDesv.、千里光SenicioscandensBunch.–Ham、款冬TussilagofarfaraL.、佩兰EupatoriumfortuneiTurcz.等。

此外,民间使用的一些山紫菀类药材,如大黄橐吾Ligulariaduiformis(C.Winkl.)Hand.–Mazz.宽舌橐吾L.platyglossa(Franch.)Hand.–Mazz.、齿叶橐吾L.entate(A.Gry)Hara等,其根及根茎HPAs含量很高,毒性很大。

2.肾毒性成分

  含马兜铃酸(aristolochicacid,AA)的中草药可引起肾损害。

1993年,比利时学者报道了一些长期服用含广防己的减肥药的年轻女性发生慢性肾衰竭,这种肾衰竭表现为肾脏进行性快速纤维化并伴有肾萎缩,国外称为“中草药肾病”(Chineseherbsnephropathy,CHN)。

检测发现减肥药中含有马兜铃酸,国内学者建议将其称为“马兜铃酸肾病”(aristolochicacidnephropathy,ANN)。

人们对含有马兜铃酸中药肾毒性广泛关注,对其肾毒性的机制进行了大量的研究。

  动物毒性试验表明:

大、小鼠接受高剂量AA后,常出现肾小管严重坏死、淋巴器官萎缩、前胃浅表性溃疡、鳞状上皮增生和过度角化等,15天内死亡。

  新西兰家兔腹腔注射AA(0.1mg/kg),每周5次,连续17~21个月,所有动物均出现肾间质性纤维化,尿路上皮改变,生长受阻,血清肌酐、尿糖、尿蛋白管型增多,贫血,表现为慢性肾衰竭。

  关于马兜铃酸的毒性机制,存在多种假说,主要有细胞毒假说、肾缺血假说、免疫反应假说、AA-DNA加合物致病假说。

这些假说中除细胞毒假说外,其他尚缺乏直接证据。

世界上大约有200多种马兜铃属植物(AristolochiaL.),其中作为药用的有20多种。

我国应用较多的马兜铃属药材有马兜铃(北马兜铃的果实)、青木香(马兜铃的根部)、天仙藤(马兜铃的茎)、关木通(木通马兜铃)、寻骨风(绵毛马兜铃)、广防己和朱砂莲等。

四、一、二生药中主要的内源性有害物质的检测方法举例

 生药中吡咯里西啶生物碱和马兜铃酸常用的检测方法是高效液相色谱法、高效毛细管电泳及其与质谱的联用技术,如关木通中马兜铃酸Ⅰ(aristolochicacidI)和马兜铃酸Ⅱ(aristolochicacidⅡ)的检测。

  关木通中马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ的高效液相色谱分析

  对照品马兜铃酸Ⅰ(aristolochicacidI)和马兜铃酸Ⅱ(aristolochicacidⅡ)。

图4-1关木通甲醇提取物的高效液相色谱图

AA-Ⅰ:

马兜铃酸I;AA-II:

马兜铃酸Ⅱ

  色谱柱:

SymmetryC18(150′4.6mm,Waters);柱温:

35°C;流动相:

1%醋酸-甲醇(1:

1);流速:

1.0ml/min;检测波长:

250nm。

代表性色谱图如图4-1。

四、一、三生药中主要的内源性有害物质限量

  为了保征临床用药安全可靠,WHO专门制订了关于HPAs的健康及安全指南,一些西方发达国家卫生部门也制定了严格的质量标准。

如德国卫生部规定,内服含HPAs的植物药制剂,每天摄取量不得超过1mg,外用时,每天摄取量不得超过100mg。

四、二生药中重金属和有害元素的检测

  生药中一类重要的外源性有害物质就是重金属(heavymetals)及有害元素(hazardouselements)。

常见对人体有害的元素和重金属元素主要有砷、汞、铅、镉、铜、铝等。

其来源一方面与其生长的环境条件如土壤、大气、水、化肥、农药的施用等有关,另一方面与植物本身的遗传特性和对该类元素的富集能力等有关。

四、二、一生药中重金属和有害元素的检测方法

重金属总量常用硫代乙酰胺或硫化钠显色反应比色法测定。

有害元素砷常用古蔡法或二乙基二硫代氨基甲酸银法测定。

单个重金属和有害元素测定方法有原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法。

《中国药典》(2005年版)附录对这些测定方法进行了规范化。

另外文献还有紫外分光光度法、荧光分光光度法和高效液相色谱法。

(一)原子吸收分光光度法(atomicabsorptionspectrophotometry,AAS)

  此法适用于测定中药中重金属及有害元素铅、镉、砷、汞、铜。

  原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素,系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生原子蒸气时,被蒸气中待测元素的基态原子所吸收,通过测定辐射光强度减弱的程度,求出供试品中待测元素的含量。

原子吸收一般遵循分光光度法的吸收定律,通常通过比较标准品溶液和供试品溶液的吸光度,求得供试品中待测元素的含量。

1.对仪器的一般要求

  所用仪器为原子吸收分光光度计,它由光源、原子化器、单色器和检测系统等组成,另有背景校正系统、自动进样系统等。

(1)光源常用待测元素作为阴极的空心阴极灯。

(2)原子化器主要有四种类型:

火焰原子化器、石墨炉原子化器、氢化物发生原子化器及冷蒸气发生原子化器。

①火焰原子化器由雾化器和燃烧灯头等主要部件组成。

其功能是将供试品溶液雾化成气溶胶后,再与燃气混合,进入燃烧灯头产生的火焰中,以干燥、蒸发、离解供试品,使待测元素形成基态原子。

燃烧火焰由不同种类的气体混合物产生,常用乙炔—空气火焰。

改变燃气和助燃气的种类及比例可以控制火焰的温度,以获得较好的火焰稳定性和测定灵敏度。

②石墨炉原子化器由电热石墨炉和电源等部件组成。

其功能是将供试品溶液干燥、灰化,再通过高温原子化阶段使待测元素形成基态原子。

一般以石墨作为发热体,炉中通入保护气,以防氧化并能输送供试品蒸气。

③氢化物发生原子化器由氢化物发生器和原子吸收池组成,可用于砷、硒、锡、锑等元素的测定。

其功能是将待测元素在酸性介质中还原成低沸点、易受热分解的氢化物,再由载气导入由石英管、加热器等组成的原子吸收池,在吸收池中氢化物被加热分解,并形成基态原子。

④冷蒸气发生原子化器由汞蒸气发生器和原子吸收池组成,专门用于汞的测定。

其功能是将供试品溶液中的汞离子还原成汞蒸气,再由载气导入石英原子吸收池,进行测定。

(3)单色器其功能是从光源发射的电磁辐射中分离出所需要的电磁辐射,仪器光路应能保证有良好的光谱分辨率和在相当窄的光谱带(0.2nm)下正常工作的能力,波长范围一般为190.0nm~900.0nm。

(4)检测系统由检测器、信号处理器和指示记录器组成,应具有较高的灵敏度和较好的稳定性,并能及时跟踪吸收信号的急速变化。

(5)背景校正系统其作用是校正供试品原子化时蒸气相对吸收测定的干扰,常用的背景校正系统有以下四种:

连续光源(在紫外区通常用氘灯)、塞曼效应、自吸效应、非吸收线等。

  在原子吸收分光光度分析中,必须注意背景以及其他原因引起的对测定的干扰。

仪器某些工作条件(如波长、狭缝、原子化条件等)的变化可影响灵敏度、稳定程度和干扰情况。

在火焰法原子吸收测定中可采用选择适宜的测定谱线和狭缝、改变火焰温度、加入络合剂或释放剂、采用标准加入法等方法消除干扰;在石墨炉原子吸收测定中可采用选择适宜的背景校正系统、加入适宜的基体改进剂等方法消除干扰。

2.测定法

(1)标准曲线法在仪器推荐的浓度范围内,制备含待测元素的标准溶液至少3份,浓度依次递增,并分别加入适当试剂。

同时以相应试剂制备空白对照溶液。

将仪器按规定启动后,依次测定空白对照溶液和各浓度标准溶液的吸光度,记录读数,以每一浓度3次吸光度读数的平均值为纵坐标,相应浓度为横坐标,绘制标准曲线。

再制备供试品溶液,使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内,测定吸光度,取3次读数的平均值,从标准曲线上查得相应的浓度,计算元素的含量。

(2)标准加入法取同体积的供试品溶液4份,分别置4个同体积的量瓶中,除一号量瓶外,其他量瓶分别精密加入不同浓度的待测元素标准溶液,分别用去离子水稀释至刻度,制成从零开始递增的一系列溶液。

按上述标准曲线法自“将仪器按规定启动后”操作,测定吸光度,记录读数;将吸光度读数与相应的待测元素加入量作图,延长此直线至与含量轴的延长线相交,此交点与原点间的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的含量(如图4-1)。

再以此计算供试品中待测元素的含量。

此法仅适用于标准曲线法中标准曲线呈线性并通过原点的情况。

图4-1标准加入法

  各重金属元素及有害元素的具体测定方法简介如下:

(1)铅的测定(石墨炉法)

  测定参考条件:

干燥温度100℃~120℃,持续20秒;灰化温度400℃~750℃,持续20~25秒;原子化温度1700℃~2100℃,持续4~5秒。

检测波长为283.3nm,背景校正为氘灯或塞曼效应。

  铅标准储备液的制备精密量取铅单元素标准溶液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml含铅(Pb)1mg的溶液,即得(0~5℃贮存)。

  标准曲线的制备分别精密量取铅标准储备液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml分别含铅5ng、20ng、40ng、60ng、80ng的溶液。

分别精密量取1ml,各加含1%磷酸二氢铵和0.2%硝酸镁的溶液1ml,混匀,精密吸取20ml,注入石墨炉原子化器,测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

  供试品溶液的制备

A法取供试品粗粉0.5g,精密称定,置聚四氟乙烯消解罐内,加硝酸3~5ml,混匀,浸泡过夜,盖好内盖,旋紧外套,置适宜的微波消解炉内进行消解(按仪器规定的消解程序操作)。

放冷,消解液转入锥形瓶中,置电热板上缓缓渐热至二氧化氮蒸气挥尽,并缓缓浓缩至2~3ml,放冷,加水稀释至25ml,摇匀,即得。

同法同时制备试剂空白溶液。

B法取供试品粗粉1g,精密称定,置凯氏烧瓶中,加硝酸-高氯酸(4:

1)的混合溶液5~10ml,混匀,瓶口加一小漏斗,浸泡过夜,置电热板上加热消解,保持微沸,若变棕黑色,再加硝酸-高氯酸(4:

1)的混合溶液适量,持续加热至溶液澄明后升高温度,继续加热至冒浓烟,直至白烟散尽、消解液呈无色透明或略带黄色的溶状物,放冷,转入50ml量瓶中,用2%硝酸溶液洗涤容器,洗液并入同一量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,即得。

同法同时制备试剂空白溶液。

C法取供试品粗粉0.5g,精密称定,置瓷坩埚中,于电热板上先低温炭化至无烟,移入高温炉中,于500℃灰化5~6小时(若个别灰化不完全,加硝酸适量,于电热板上低温加热,反复多次直至灰化完全),取出冷却,加10%硝酸溶液5ml使溶解,转入25ml量瓶中,用水洗涤容器,洗液并入同一量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,即得。

同法同时制备试剂空白溶液。

  测定法精密量取空白溶液与供试品溶液各1ml,加含1%磷酸二氢铵和0.2%硝酸镁的溶液1ml,摇匀,精密吸取10~20ml,照标准曲线制备项下方法测定吸收度,从标准曲线上读出供试品溶液中铅(Pb)的含量,计算,即得。

(2)镉的测定(石墨炉法)

  测定条件参考条件:

干燥温度100℃~120℃,持续20秒;灰化温度300℃~500℃,持续20~25秒;原子化温度1500℃~1900℃,持续4~5秒。

检测波长为228.8nm,背景校正为氘灯或塞曼效应。

  镉标准储备液的制备精密量取镉单元素标准溶液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml含镉(Cd)0.4mg的溶液,即得(0℃~5℃贮存)。

  标准曲线的制备分别精密量取镉标准储备液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml分别含镉1.6ng、3.2ng、4.8ng、6.4ng、8.0ng的溶液。

分别精密吸取10ml,注入石墨炉原子化器,测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

  供试品溶液的制备同铅测定项下供试品溶液的制备。

  测定法精密吸取空白溶液与供试品溶液各10ml~20ml,照标准曲线制备项下方法测定吸收度(若供试品有干扰,可分别精密量取标准溶液、空白溶液和供试品溶液各1ml,加含1%磷酸二氢铵和0.2%硝酸镁的溶液1ml,摇匀,依法测定),从标准曲线上读出供试品溶液中镉(Cd)的含量,计算,即得。

(3)砷的测定(氢化物法)

  测定条件采用适宜的氢化物发生装置,以含1%硼氢化钠和0.3%氢氧化钠的溶液为还原剂,1%盐酸为载液,氮气为载气,检测波长为193.7nm,背景校正为氘灯或塞曼效应。

  砷标准储备液的制备 精密量取砷单元素标准溶液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml分别含砷(As)1μg的溶液,即得(0℃~5℃贮存)。

  标准曲线的制备 分别精密量取砷标准储备液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml分别含砷2ng、4ng、8ng、12ng、16ng的溶液。

分别精密量取10ml,置25ml量瓶中,各加25%碘化钾溶液(临用前配制)1ml,摇匀,加10%抗坏血酸溶液(临用前配制)1ml,摇匀,用盐酸溶液(20→100)稀释至刻度,摇匀。

取适量,吸入氢化物发生装置,测定吸收值,以峰面积(或吸收度)为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

  供试品溶液的制备同铅测定项下“供试品溶液的制备”中的A法或B法。

  测定法精密吸取空白溶液与供试品溶液各10ml,照标准曲线制备项下的方法,自“加25%碘化钾溶液(临用前配制)1ml”起,依法测定。

从标准曲线上读出供试品溶液中砷(As)的含量,计算,即得。

(4)汞的测定(冷吸收法)

  测定条件采用适宜的氢化物发生装置,以含0.5%硼氢化钠和0.1%氢氧化钠的溶液为还原剂,1%盐酸溶液为载液,氮气为载气,检测波长为253.6nm,背景校正为氘灯或塞曼效应。

  汞标准储备液的制备精密量取汞单元素标准溶液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml含汞(Hg)1mg的溶液,即得(0~5℃贮存)。

  标准曲线的制备分别精密量取汞标准储备液0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml置50ml量瓶中,加4%硫酸溶液40ml、5%高锰酸钾溶液0.5ml,摇匀,滴加5%盐酸羟胺溶液至紫红色恰消失,用4%硫酸溶液稀释至刻度,摇匀。

取适量,吸入氢化物发生装置,测定吸收值,以峰面积(或吸收度)为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

  供试品溶液的制备A法取供试品粗粉0.5g,精密称定,置聚四氟乙烯消解罐内,加硝酸3ml~5ml,混匀,浸泡过夜,盖好内盖,旋紧外套,置适宜的微波消解炉内进行消解(按仪器规定的消解程序操作)。

放冷,消解液转入锥形瓶中,置电热板上,于100~120℃缓缓加热至二氧化氮蒸气挥尽,并持续缓缓浓缩至2ml~3ml,放冷,加4%硫酸溶液5ml~6ml、5%高锰酸钾溶液0.5ml,摇匀,滴加5%盐酸羟胺溶液至紫红色恰消失,用4%硫酸溶液稀释至10ml,摇匀,必要时离心,取上清液,即得。

同法同时制备试剂空白溶液。

B法取供试品粗粉1g,精密称定,置凯氏烧瓶中,加硝酸-高氯酸(4:

1)的混合溶液5ml~10ml,混匀,瓶口加一小漏斗,浸泡过夜,置电热板上,于120℃~140℃加热消解4~8小时,至消解完全,放冷,加适量4%硫酸溶液、5%高锰酸钾溶液0.5ml,摇匀,滴加5%盐酸羟胺溶液至紫红色恰消失,用4%硫酸溶液稀释至25ml,摇匀,必要时离心,取上清液,即得。

同法同时制备试剂空白溶液。

测定法精密吸取空白溶液与供试品溶液适量,照标准曲线制备项下的方法测定。

从标准曲线上读出供试品溶液中汞(Hg)的含量,计算,即得。

(5)铜的测定(火焰法)

  测定条件检测波长为324.7nm,用空气-乙炔火焰,背景校正为氘灯或塞曼效应。

  铜标准储备液的制备精密量取铜单元素标准溶液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml含铜(Cu)10mg的溶液,即得(0℃~5℃贮存)。

  标准曲线的制备分别精密量取铜标准储备液适量,用2%硝酸溶液制成每1ml分别含铜0.05mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg的溶液。

一次喷入火焰,测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。

  供试品溶液的制备同铅测定项下供试品溶液的制备。

  测定法精密吸取空白溶液与供试品溶液适量,照标准曲线制备项下的方法测定。

从标准曲线上读出供试品溶液中铜(Cu)的含量,计算,即得。

(二)电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasma-massspectrometry,ICP-MS)

  电感耦合等离子体质谱法是将被测物质用电感耦合等离子体离子化后,按离子的质荷比分离,测量各种离子谱峰的强度的一种分析方法。

等离子体是由自由电子、离子和中性原子或分子组成,总体上成电中性的气体,其内部温度高达几千度至一万度。

样品由雾化器雾化后由载气携带从等离子体焰炬中央穿过,迅速被蒸发电离并通过离子引出接口或采样锥导入到质量分析器,样品在极高温度下完全蒸发和解离,电离的百分比高,因此几乎对所有元素均有较高的检测灵敏度,由于该条件下化合物分子结构已经被破坏,所以仅适用于元素分析。

1.对仪器的一般要求

  电感耦合等离子体质谱仪一般由进样系统、电感耦合等离子体(ICP)离子源、质量分析器和检测器组成,并实现ICP和质谱的联用,主要用于元素分析和元素价态分析。

  载气仪器一般所用的载气为氩气,气体的纯度应大于99.99%,可由高压钢瓶和液态气体储罐提供,经过适当的减压装置,以一定的流速进入离子炬管。

  进样系统进样方式为溶液直接进样,用蠕动泵经进样管将溶液注入仪器内,进样管一般可分为样品管和内标管。

实验过程中雾化室温度应相对稳定(根据仪器的要求),雾化室使用后应清洗,不可用手直接接触喷雾口。

  离子源和采样锥炬管和采样锥使用一段时间后需要清洗,实验中应保持气体管路密闭不漏气,并监控仪器的反射功率。

等离子体火焰燃烧时由于温度较高,应使用循环水系统进行冷却,并使用适当功率的抽风系统排出仪器内部的热量。

循环水和排风口的温度应控制在仪器要求的范围内。

  质量分析器的检测器质量分析器一般为四极杆分析器,可以实现质谱扫描功能。

检测器通常为光电倍增器或电子倍增器。

质量分析器应保持真空,真空度应达到仪器使用要求。

仪器可置于维持真空的待机状态,但切断电源前,应按要求将真空度恢复到常压。

断电后,用氩气充入真空系统。

当供试品中待测元素的浓度较高时,应予稀释,以延长检测器的使用寿命。

样品测定前应进行灵敏度调谐,达到要求后,方可测试样品。

2.测定法

  在仪器推荐的浓度范围内,制备含待测元素的标准溶液至少3份,浓度依次递增,并分别加入配制供试品溶液的相应试剂,除另有规定外,一般用纯化水(电阻率应大于18MΩ)制成水溶液。

将仪器按规定启动后,按浓度梯度依次进样,读数。

取每一浓度至少3次读数的平均值与相应浓度作标准曲线。

  按各品种项下的规定制备供试品溶液,使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内,测定供试品溶液,从标准曲线上查得相应的浓度,计算元素的含量。

定量分析测定过程中,进样时样品管应插入样品溶液中,而内标管在分析过程中始终置于相应的内标元素溶液中。

内标元素一般应选择与被测元素的质量数接近的天然稀有元素。

四、二、二生药中常见重金属和有害元素的限量

我国规定了贮粮中重金属和有害元素的限量标准,东南亚国家规定了进口中药材及中成药中重金属和有害元素的限量(见表4-1)。

表4-1国家贮粮和东南亚国家规定进口中药材及中成药中重金属和有害元素限量(≤百万分之一)

重金属和有害元素

国家贮粮

东南亚国家进口中药材及中成药

0.7~5.0

5.0

20

20.00

150

150

0.02~0.50

0.50

  《中国药典》(2005年版)共对17种生药或提取物提出重金属或有害物质的限量要求,见表4-2。

表4-2《中国药典》(2005年版)生药或提取物重金属或有害元素的限量(£百万分之一)

重金属总量

甘草

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