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改善缺铁性贫血功能评价方法

附件5：

改善缺铁性贫血功能评价方法

试验项目、试验原则及结果判定

Items,PrinciplesandResultAssessment

1试验项目

1.1动物实验

1.1.1体重

1.1.2血红蛋白

1.1.3红细胞比积/红细胞游离原卟啉

1.2人体试食试验

1.2.1血红蛋白

1.2.2血清铁蛋白

1.2.3红细胞游离原卟啉/红细胞运铁蛋白饱和度

2试验原则

2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。

2.2针对儿童的人体试食试验，只测血红蛋白和红细胞内游离原卟啉。

2.3在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3结果判定

3.1动物实验：

血红蛋白指标阳性，红细胞游离原卟啉/红细胞压积二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果为阳性。

3.2人体试食试验

3.2.1针对改善儿童缺铁性贫血功能的，血红蛋白和红细胞内游离原卟啉二项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。

3.2.2针对改善成人缺铁性贫血功能的，血红蛋白指标阳性，血清铁蛋白、红细胞内游离原卟啉/血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用。

改善缺铁性贫血功能检验方法

MethodfortheAssessmentofImproving

NutritionalAnaemiaFunction

1.动物实验

1.1原理

用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予受试样品，观察其对血液细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用。

1.2实验动物

健康初断乳大鼠，单一性别，每组大鼠8－12只。

1.3低铁饲料

配方：

成分

添加量

g/kg

玉米淀粉

529.5

蛋清蛋白*

200.0

蔗糖

100.0

玉米油（无添加剂）

70.0

纤维素

50.0

混合矿物盐（AIN-93G-MX）

35.0

混合维生素（AIN-93G-VX）

10.0

L-胱氨酸

氯化胆碱

3.0

2.5

*亦可使用EDTA处理的酪蛋白

AIN-93G混合矿物盐配方

矿物质

添加量

gormg/kgmix

Calciumcarbonateanhydrous

357.00

Potassiumphosphatemonobasic

196.00

Potassiumcitrate,tripotassiummonohydrate

70.78

Sodiumchloride

74.00

Potassiumsulfate

46.60

Magnesiumoxide

24.00

Zinccarbonate

1.65

Sodiummeta-silicater9H2O

1.45

Manganouscarbonate

0.63

Cupriccarbonate

0.30

Chromiumpotassiumsulfater12H2O

0.275

Boricacid（17.5%B）,mg

81.50

Sodiumfluoride（45.24%F）,mg

63.50

Nickelcarbonate（45%Ni）,mg

31.80

Lithiumchloride（16.38%Li）,mg

17.40

Sodiumselenateanhydrous（41.79%Se）,mg

10.25

AIN-93G混合维生素配方

维生素

添加量

g/kgmix

Nicotinicacid

3.000

Capantothenate

1.600

Pyridoxine-HCl

0.700

Thiamin-HCl

0.600

Riboflavin

0.600

Folicacid

0.200

Biotin

0.020

VitaminB-12（cyanocobalamin）（0.1%inmannitol）

2.500

VitaminE（all-rac-a-tocopherylacetate）2（500IU/g）

15.000

VitaminA（all-trans-retinylpalmitate）2（500,000IU/g）

0.800

VitaminD-3（cholecalciferol）（400,000IU/g）

0.250

VitaminK-1（phylloquinone）

0.075

Powderedsucrose

974.655

1.4剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个低铁对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组（硫酸亚铁或乳酸亚铁，剂量为2ppm或2mg/（kgbw），以Fe元素计）。

受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.5实验步骤

1.5.1建立缺铁性贫血大鼠模型

选用健康断乳大鼠在实验环境下适应3－5天后饲予低铁饲料及去离子水（或双蒸水），采用不锈钢笼及食罐，同时，采用剪尾取血法放血，5天一次，每次0.3－0.5ml。

实验过程中避免铁污染。

自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测Hb，如多数动物Hb低于100g/L时，测定全部大鼠的体重及Hb。

1.5.2恢复实验

选取Hb<100g/L的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，测定体重及各项血液学指标。

1.6观察指标

体重、血红蛋白、红细胞比积/红细胞内游离原卟啉

1.6.1血红蛋白测定（氰化高铁法）

消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。

1.6.1.1吸光系数法

1.6.1.1.1原理

血红蛋白（haemoglobin，Hb）被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色），氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm波长下，摩尔吸光系数为44000，据此，用分光光度法测其光密度，运用吸光系数作血红蛋白的定量测定。

1.6.1.1.2仪器

分光光度计。

10微升微量吸管。

1.6.1.1.3试剂

称取碳酸氢钠（NaHCO3，AR）140毫克、铁氰化钾200毫克、氰化钾50毫克，用水溶解并稀释到1000毫升。

贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱（4℃）保存，至少可稳定数月到1年。

1.6.1.1.4实验步骤

1.6.1.1.4.1取试剂2.5毫升於5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。

1.6.1.1.4.2选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以736，即为血红蛋白浓度（g/L）。

计算公式如下：

Ct=

Ct=待测的血红蛋白（g/L）浓度。

=氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。

251=测定时血液的稀释倍数（血10μL加入试剂2.5mL中）

44000=氰化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数

0.5=比色杯的光径

64458=血红蛋白的分子量

1.6.1.1.5注意事项

1.6.1.1.5.1试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。

1.6.1.1.5.2仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线性等），否则将直接影响测定的结果。

1.6.1.1.5.3仪器在使用前最好应以WHO规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。

参考液最好选用ICSH（国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（荷兰国立公共卫生研究院）制作的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氰化高铁血红蛋白标准液。

1.6.1.2标准曲线法

1.6.1.2.1原理

血红蛋白（hemoglobin，Hb）在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。

用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得Hb的浓度。

1.6.1.2.2仪器

10μL血色素吸管（或定量毛细管）

5mL或10mL带盖试管

分光光度计

1.6.1.2.3试剂

称取碳酸氢钠（NaHCO3，AR）140mg、铁氰化钾200mg、氰化钾50mg，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，贮存于棕色试剂瓶内，保存于4℃冰箱可稳定至1年。

1.6.1.2.4实验步骤

吸取2.5mL试剂于5mL带盖试管中，用10μL血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10μL放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15min。

选用0.5cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。

查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量（g/L），计算参考物质的回收率。

1.6.1.2.5注意事项

1.6.1.2.5.1不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。

1.6.1.2.5.2不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。

1.6.1.2.5.3每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高3个浓度）。

1.6.1.3数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值

各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到10g/L以上，判定该实验结果阳性。

1.6.2红细胞内游离原卟啉测定

1.6.2.1原理

血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原卟啉在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原卟啉乃以游离形式累积起来超过正常水平。

因此，检测红细胞内游离原卟啉（Freeerythrocyteproloporphyrin，FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。

血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：

乙酸混合液（4:

1）和0.5N盐酸提取分离血中游离原卟啉，在一定波长下测定其原卟啉的荧光强度而定量。

1.6.2.2仪器

1.6.2.2.1荧光分光光度计或930型荧光光度计。

1.6.2.2.2离心机。

1.6.2.2.3混旋器。

1.6.2.3试剂

1.6.2.3.1肝素抗凝剂一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL（1mL=500单位）。

1.6.2.3.25%（W/V）硅藻土生理盐水悬浊液称取5g硅藻土加0.9%生理盐水至100mL。

1.6.2.3.34:

1乙酸乙酯和乙酸混合液。

1.6.2.3.40.5NHCl。

1.6.2.3.5原卟啉标准液。

1.6.2.3.5.1原卟啉标准贮备液（50mg/L）：

称取5mg原卟啉，加4mL无水乙醇使之溶解，以1.5NHCl稀释至100mL。

1.6.2.3.5.2原卟啉标准中间液（1.0mg/L）：

取2mL原卟啉贮备液，以乙酸乙酯与乙酸（4:

1）混合液稀释到100mL。

1.6.2.3.5.3原卟啉标准应用液（0.1mg/L）：

取1mL原卟啉中间液，以乙酸乙酯与乙酸（4:

1）混合液稀释到10mL。

1.6.2.4实验步骤

试剂样品管空白管标准管

肝素（mL）0.100.100.10

全血（mL）0.02

水（mL）0.020.02

5%硅藻土悬浊液（mL）0.150.150.15

原卟啉标准应用液（mL）0.5

乙酸乙酯与乙酸（4:

1）混合液（mL）443.5

注：

按上表依次加入各种试剂，在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液。

离心15分钟，将各管上清液分别倒入10mL比色管中，每管加4mL0.5N盐酸，振摇5分钟静止使之分层，将上层溶剂抽出弃去，测定盐酸液的荧光强度（30分钟内比色）。

1.6.2.5荧光测量

1.6.2.5.1若使用日立MPF-4型荧光分光光度计测定条件为激发波长为403nm，狭缝10nm；发射波长为605nm，狭缝为5nm，液槽为1cm厚石英槽。

1.6.2.5.2若使用国产930型荧光光度计测试，条件为激发滤光片420，荧光滤片550，灵敏度1×500，满度开关开至最大，液槽为1cm厚石英槽，检出灵敏度为0.01g/4mL。

在不同量原卟啉（0g，0.01g，0.03g，0.05g，0.07g，0.1g）呈线性关系。

1.6.2.6计算

样品荧光强度空白荧光强度100

血中原卟啉含量（g/L全血）=───────────────×标准管原卟啉含量（g）×─────────×10

标准管荧光强度空白荧光强度样品取样量（mL）

1.6.2.7数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值

各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与对照组比较，红细胞内游离原卟啉降低经统计处理差异有显著性，即可判定该实验结果阳性。

1.6.2.8注意事项

1.6.2.8.1荧光强度随时间延长而逐渐衰退，但30分钟内基本稳定。

1.6.2.8.2加乙酸乙酯-乙酸混合液时，一定要边混合边加入，否则影响测定结果。

1.6.2.9滤纸法测定：

将滴有20微升血点全部剪下放入试管中，同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中，各管均加入5%硅藻土悬浊液0.2亳升，振荡后放置过夜，以下步骤同直接法。

计算：

FEP（微克/100毫升全血）=C/B×A/D×100

A=标准管原卟啉含量（0.02毫克）

B=标准管荧光强度-空白管荧光强度

C=血样荧光强度-空白管荧光强度

D=取样量

1.6.3红细胞压积测定：

使用全自动血细胞分析仪进行。

数据处理及结果判定同“1.6.2.7”。

1.7数据处理和结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值

各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与低铁对照组相比，若血红蛋白差异有显著性，且其前后平均升高幅度达到10g/L以上，同时，受试样品红细胞内游离原卟啉或红细胞压积与低铁对照组相比差异有显著性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果阳性。

1.8注意事项

本项实验关键在于贫血模型的建立。

低铁饲料含铁量最好控制在9mg/Kg以下，所用试剂应为分析纯，动物饮用水应为去离子水或双蒸水，采用不锈钢笼具，所用器皿应用10%硝酸溶液处理。

实验过程中严防外来铁的污染及彼此交叉污染。

2人体试食试验

2.1受试者纳入标准

受试者为小细胞低色素贫血，且有明确的缺铁原因和临床表现的成人和儿童。

2.1.1成人纳入标准：

男性Hb80g/L－130g/L，女性Hb80g/L－120g/L。

2.1.2儿童纳入标准：

≤6岁儿童Hb70g/L－110g/L；7－18岁青少年80g/L－120g/L。

2.2受试者排除标准

2.2.1合并有心、脑血管、肝、肾、消化道等严重疾病及精神病患者。

2.2.2过敏体质或对该受试样品过敏者。

2.2.3严重贫血患者。

2.2.4短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。

2.2.5未按标准服用受试样品、资料不全影响功效或安全性判断者。

2.3试验设计及分组要求

采用自身和组间两种对照设计。

按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如性别、年龄、经济状况等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。

每组受试者不少于50例。

2.4受试样品的剂量和使用方法

试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可服用具有同样作用的阳性物。

受试样品给予时间30天，必要时可延长至120天。

试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

2.5观察指标

2.5.1安全性指标

2.5.1.1一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）

2.5.1.2血、尿、便常规检查

2.5.1.3肝、肾功能检查（儿童受试者不测定此项）

2.5.1.4腹部B超、胸透、心电图检查（各项指标在试验前检查一次，儿童受试者不测此项）

2.5.2膳食调查

于试验开始前、结束前进行三天的询问法膳食调查，观察饮食因素对试验结果的影响。

2.5.3症状观察

食欲不振、乏力、烦燥、头晕、眼花、精神不集中、心慌、气短等。

2.5.4功效性指标

儿童观察指标：

血红蛋白、红细胞内游离原卟啉

成人观察指标：

血红蛋白、血清铁蛋白、血清运铁蛋白饱和度/红细胞内游离原卟啉

2.5.4.1血红蛋白：

见1.6.1。

2.5.4.2血清铁蛋白测定（放射免疫法）：

2.5.4.2.1原理

人血清中的铁蛋白（SF）与加入的125I标记的SF竞争性地与抗铁蛋白抗体结合。

用第二抗体分离结合部分，分别测定总放射性与沉淀物放射性计数。

依据标准SF试剂作出标准曲线，从而可在曲线上查出相应样品血清的SF浓度。

*SF+Ab←→*SF－Ab+*SF

+

SF

↑↓

SF－Ab

+

SF

*SF：

标记的铁蛋白SF：

未标记的铁蛋白Ab：

抗铁蛋白抗体

2.5.4.2.2仪器

离心机、-射线计数仪。

2.5.4.2.3试剂

125I－血清铁蛋白放射免疫分析试剂盒.。

2.5.4.2.4操作步骤

2.5.4.2.4.1操作步骤：

铁蛋白测定操作程序和试剂用量（mL）

（见下表）

2.5.4.2.4.2绘制标准曲线

以各标准管的B/B0%作纵座标，标准铁蛋白浓度为横座标（对数边）作标准曲线。

样品或质控由B/B0%值从曲线上查到相应的含量。

组别

名称

标准曲线组

待

测

管

（T）

总计数值

（NBS）

非特异管

（B0）

零标准管

（B）

标准管

温育液

0.2

0.1

铁蛋白标准

0.1

待测血样或质控

0.1

铁蛋白抗体

0.1

0.1

0.1

125I－铁蛋白

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

充分摇匀，37℃，温育1.0小时

分离试剂

0.5

0.5

0.5

0.5

充分摇匀，室温15分钟

3500转／分，离心15分钟，弃上清液，测沉淀计数

2.5.4.2.4.3结果计算

非特异结合率：

NBS（%）=

×100%

零管结合率：

B0/T（%）=

×100%

标准管（样品、质控）结合率：

B／B0（%）=

×100%

2.5.4.2.4.4注意事项

本实验为抗原抗体结合反应，操作时要注意防止可引起抗原、抗体失活的因素（如高温、冰冻等）。

测定时，要防止液体溅出，以免造成同位素污染，使本底值增高。

离心后，抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起，否则测定结果不准确。

非特异管、零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的。

血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定。

具体测定方法按相应试剂盒说明书进行。

2.5.4.3血清运铁蛋白饱和度测定

2.5.4.3.1原理

血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸附除去，然后按测血清铁的方法，测定总结合的铁量，即为总铁结和力。

从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。

2.5.4.3.2血清铁测定

血清铁（S1）是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁，它以高铁的形式附着在血清pl球蛋白的转递蛋白上，成人正常值为50－184µg/100mL。

缺铁性贫血时常低于50µg/100mL，当血红蛋白浓度降低不明显时，血清铁已减少，被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一。

2.5.4.3.2.1铬天青B铵盐比色法

铬天青B铵盐作为显色剂测血清铁，比过去多采用的联吡啶等作为显色剂有较高的灵敏度，其克分子吸光系数在630nm波长下为1.68×105L·mol-1·cm-1。

可大大减少样品血清量，方法简便，准确。

2.5.4.3.2.1.1原理

Fe3／Fe2与铬天青B（CAB）和十六烷基三甲基溴化铵（CTMA）反应，形成三元胶囊状络合物使试剂颜色加深，其颜色加深程度与血清铁含量成正比，在pH为4.6－5.5，波长为630nm时，有最大吸收峰，利用柠檬酸船为铁的掩蔽剂，样品为自身空白，不需除蛋白，即可测出血清铁的含量。

2.5.4.3.2.1.2试剂

2.5.4.3.2.1.2.1缓冲溶液pH4.75，取25g无水醋酸钠，110g氯化钠，8mL冰醋酸，用蒸馏水定容1000mL。

用酸度计测pH应为4.75。

2.5.4.3.2.1.2.2显色剂

2.5.4.3.2.1.2.2.10.1％铬天青B铵盐溶液（A液）：

取0.1g铬天青B铵盐，定容于l00mL蒸馏水中，放在棕色瓶中可在室温下保存1个月。

2.5.4.3.2.1.2.2.20.3％十六烷基三甲基溴化铵（B液）：

取十六烷基三甲基溴化铵0.3g，用蒸馏水定容至100mL。

2.5.4.3.2.1.2.2.3显色剂应用液：

取90mLB液，60mLA液，小心混匀，用缓冲溶液定容至1000mL，放在棕色瓶内可保存1个月。

2.5.4.3.2.1.2.3掩蔽剂：

称17.0g柠檬酸（C6H8O7·H2O），35.0g柠檬酸钠（Na3C6H5O7·H2O），约加50mL蒸馏水加热助溶，冷却后定容至l00mL。

2.5.4.3.2.1.2.4铁标准液

2.5.4.3.2.1.2.4.1贮备液：

3mmol／L，取1.176g硫酸亚铁铵（6分子结晶水）至少量蒸馏水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸馏水定容至1000mL。

2.5