细胞生物实验教学大纲.docx
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细胞生物实验教学大纲
《细胞生物学》实验
教学大纲
（执笔人：
张利平审核人：
教学院长：
）
一、课程简介
（一）课程代码：
（二）课程名称：
《细胞生物学》实验
（ExperimentofCellBiology）
（三）修读对象：
生物科学及生物技术专业本科生
（四）总学时与学分：
27学时/3学分
（五）考核方式：
随堂测试
（六）相关课程：
医学细胞生物学、普通生物学、医学遗传学
（七）内容提要：
这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学实验教学编写的，适用于四年制生物科学及生物技术专业学生。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。
为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基本技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。
大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。
选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微观察、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞培养、细胞融合等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
二、教学目的和教学方法：
培养学生基本的细胞生物学实验方法并培养学生的实际动手操作能力，帮助学生形成基础实验研究思路，为后续的学习和实验研究打下基础。
全书内容共5个实验，针对各专业学生教学根据具体情况采用学生动手操作为主，部分操作教师演示示教为辅的方式结合进行。
三、教学学时分配
总学时27，各实验学时分配如下：
实验一：
鸡血细胞的融合实验6学时
实验二：
细胞器的分级分离6学时
实验三：
微丝染色及形态学观察5学时
实验四：
细胞中碱性蛋白的显示5学时
实验五：
红细胞膜的通透性5学时
四、选用教材和主要教学参考书
教材：
《细胞生物学》翟中和主编高等教育出版社出版
教学参考书：
1.分子细胞生物学韩贻仁科学出版社
2.细胞生物学王德耀上海科学技术出版社
3.细胞生物学研究方法与技术（第二版）刘鼎新北医、协和医大联合出版社
4.细胞生物学实验（第二版）杨汉民高等教育出版社1997年07月出版
5.MolecularBiologyoftheCell4thEdition,BruceAlbertsetal.
6.MolecularCellBiology4thEdition,HarveyLodishetal.
目录
实验一鸡血细胞的融合实验…………………………………………………………………5
实验二细胞器的分级分离……………………………………………………………………6
实验三微丝染色及形态学观察……………………………………………………………7
实验四细胞中碱性蛋白的显示………………………………………………………………9
实验五红细胞膜的通透性……………………………………………………………………10
实验一鸡血细胞融合实验
【教学目的】
1.掌握细胞融合的概念及基本原理。
2.初步掌握PEG诱导细胞融合技术。
3.了解细胞融合技术的生物学和医学意义。
【教学方法】
幻灯片演示讲解结合板书讲解，配合具体实验操作演示。
【教学学时分配】
实验前讲解30min
实验操作120min
实验后总结及实验用品整理30min
【教学内容】
1.实验原理……5min
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。
PEG可与水分子借氢键结合，在高浓度（50％）的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，引起细胞融合。
为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。
因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。
2.实验操作介绍：
……25min
Ø鸡血的采集与抗凝；
Ø50％PEG溶液的配制；
Ø细胞融合操作：
离心洗涤--沉淀加GKN39度水浴5min--滴加PEG水浴15min--加入GKN水浴10min--离心-弃上清；
Ø结果观察：
加GKN混匀--取1滴悬液滴片，加Janusgreen染液8min后盖片观察。
3.实验操作……120min
4.实验总结……30min
在显微镜下观察细胞融合情况，可看到不同融合状态的细胞。
将视野内发生融合的细胞核总数/视野内所有细胞核总数，计算融合率，绘制细胞融合图。
【重难点】
1.滴加50％PEG时，应缓慢、逐滴加入，而且每加一滴应轻摇离心管以混匀，滴加完毕后可用滴管温和混匀。
2.高Ca2+浓度能提高细胞的融合率。
3.因PEG对细胞有毒性，应严格控制作用时间于1～2min，但本实验中融合后的细胞不继续培养，可将处理时间延长至15min以达到最高融合率。
【思考题】
1．细胞融合率受哪些因素的影响?
2．在进行细胞融合时，要注意哪些问题?
实验二：
细胞器的分级分离
【教学目的】
1．掌握差速离心法和密度梯度离心法的原理。
2．熟悉哺乳动物细胞的细胞核、线粒体分离和纯化的实验方法。
【教学方法】
幻灯片演示讲解结合板书讲解，配合具体实验操作演示。
【教学学时分配】
实验前讲解30min
实验操作120min
实验后总结及实验用品整理30min
【教学内容】
1.实验原理……10min
球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。
实验涉及两类离心方法：
差速离心法（differentialcentrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心沉淀上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。
密度梯度离心法（densitygradientcentrifugation）是一定介质形成一连续或不连续的密度梯度，顶部的细胞匀浆在重力或离心力场的作用下分层、分离。
一般先通过差速离心法将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度离心法分离纯化细胞器。
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。
分级分离方法有两种，即：
差速离心法和密度梯度离心法。
2.实验操作介绍……20min
组织匀浆制备：
大鼠处死取出肝脏--称1～2g肝组织，蔗糖溶液冲洗数次剪碎--以蔗糖溶液悬浮--匀浆--过滤备用。
细胞器的分级分离：
1000rpm离心8min，取上清液1ml保留于Ep管中，沉淀加蔗糖混匀，1300rpm离心8min，弃上清。
沉淀中加0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg（Ac）2至2ml混悬。
在混悬液下加入2ml的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/LMg（Ac）2溶液，2000rpm离心8min。
沉淀中加入PBS混匀后涂片空气干燥。
将标本片浸入95％的乙醇溶液5min，取出晾干并滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min，之后快速放入丙酮中并取出，漂洗干燥，显微镜下观察结果。
线粒体的分离鉴定：
将分离细胞核时收集的上清以11400g离心10min，沉淀用0.25mol/L的蔗糖溶液重悬后，11400g离心10min，重复1次，去上清液。
于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5～10min，盖片镜检。
3.实验操作……120min
4.实验总结……30min
显微镜下观察细胞核经甲基绿-派洛宁染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。
观察分析完整细胞核的数量及其比例。
线粒体经詹纳斯绿B染色呈亮绿色。
【重难点】
1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又要尽量快速。
2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在1～4℃下进行。
3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操作过于剧烈。
另线粒体进行的是活体染色，要求样品制备好后尽快染色。
【思考题】
1.简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？
2.实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度？
实验三：
微丝染色及形态学观察
【教学目的】
1.掌握微丝的染色方法。
2.了解光镜下微丝的基本形态结构。
【教学方法】
幻灯片演示讲解结合板书讲解，配合具体实验操作演示。
【教学学时分配】
实验前讲解30min
实验操作90min
实验后总结及实验用品整理30min
【教学内容】
1.实验原理……5min
真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。
根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管、微丝和中间纤维。
微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。
当细胞用TritonX-100溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维。
应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。
2.实验操作介绍……25min
Ø培养：
成纤维细胞传代培养时将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中培养24h～48h。
Ø取材：
取出铺有细胞的盖玻片，用PBS洗3次，洗去表面的培养液。
Ø抽提：
吸弃PBS，加入1%TritonX-100液4-5滴，室温处理15min。
Ø稳定：
吸弃TritonX-100，立即用M-缓冲液轻轻地洗涤3次。
Ø固定：
略晾干，在3%戊二醛液中固定10min，再以PBS液洗3次，洗去固定液。
Ø染色：
滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色10min，然后小心的用自来水漂洗。
Ø观察：
留取少量水分封片于载玻片，吸水纸吸去多余的水。
光镜下观察临时装片并绘制微丝形态图。
3.实验操作……90min
4.实验总结……30min
光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列。
【重难点】
1.洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。
2．操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面。
3．染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞。
4．TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过长而导致细胞结构的破坏。
【思考题】
TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯亮蓝在本实验中所起作用各是什么？
实验四：
细胞中碱性蛋白的显示
【教学目的】
1.学会制血涂片。
2.了解碱性蛋白与酸性蛋白的显示方法的原理及操作步骤。
3.了解碱性蛋白与酸性蛋白的分布。
【教学方法】
幻灯片演示讲解结合板书讲解，配合具体实验操作演示。
【教学学时分配】
实验前讲解30min
实验操作90min
实验后总结及实验用品整理30min
【教学内容】
1.实验原理……5min
以酸性氨基酸成分为主的蛋白质为酸性蛋白;以碱性氨基酸成分为主的蛋白质为碱性蛋白。
细胞核内有组蛋白（碱性蛋白）及少量酸性蛋白，细胞质中主要有酸性蛋白，标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。
2.实验操作介绍……25min
Ø以破坏脊髓法处死蟾蜍，打开心包取心脏血推片。
Ø新鲜血涂片自然干燥入70%乙醇溶液中固定10min。
Ø60℃5％三氯醋酸溶液处理30min。
Ø在冷5％三氯醋酸溶液漂洗后，流水充分冲洗晾干。
Ø碱性蛋白染色液染色30min。
Ø取出，流水漂洗，吸干水分，显微镜下观察并绘图。
3.实验操作……90min
4.实验总结……30min
用pH8.0～8.5碱性固绿染液染色结果，只有细胞核内染色质被染绿色，此即碱性蛋白在细胞内的分布，而胞质及核仁并不被染色。
【重难点】
1.在制作血涂片时，推片的力度要均匀，否则会造成玻片上细胞堆叠，影响染色和观察。
2.三氯醋酸处理涂片后，注意一定要用清水反复冲洗，不可在涂片上留下三氯醋酸痕迹，否则酸性蛋白和碱性蛋白的染色不能分明。
【思考题】
1.显示细胞中碱性及酸性蛋白的基本原理？
2.细胞中酸性蛋白、碱性蛋白如何分布？
实验五：
红细胞膜的通透性
【教学目的】
1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.了解溶血现象及其发生的机制。
【教学方法】
幻灯片演示讲解结合板书讲解，配合具体实验操作演示。
【教学学时分配】
实验前讲解30min
实验操作90min
实验后总结及实验用品整理30min
【教学内容】
1.实验原理……5min
细胞膜是一种选择性通透的生物膜生理条件下,细胞膜两侧的渗透压保持平衡。
由于细胞膜具有一定的通透性，在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。
溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。
由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，这样就可以通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。
2.实验操作介绍……25min
Ø取一支试管，加入4ml蒸馏水和1ml鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，注意观察溶液颜色变化。
可见溶液由不透明的红色变成澄清透明的红色液体，即已发生溶血，记下发生溶血所需要的时间。
Ø按上述方法分别加入下列8种溶液，做好标记，观察是否出现溶血现象并记录实验结果:
①0.005mol/LNaCl溶液；②0.17mol/LNaCl溶液；③0.32mol/L葡萄糖溶液；④0.32mol/L甘油；⑤0.8mol/L甲醇溶液；⑥0.8mol/L甘油；⑦氯仿；⑧2%TritonX-100溶液。
3.实验操作……90min
4.实验总结……30min
观察实验后试管内情况：
如试管内液体分两层：
上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状；如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片；如试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。
【重难点】
为更好比较，不妨将试剂两两对照以方便观察。
【思考题】
不同试剂引起溶血时间不同原因何在，与细胞膜的选择通透有何关系？
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