酶的测定方法.docx

酶的测定方法.docx

《酶的测定方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶的测定方法.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酶的测定方法

一、脲酶测定（比色法）

1、试剂配制：

（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：

取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：

称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。

使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：

用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：

10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：

精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤

称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ6.7）,仔细混匀。

在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上）,摇荡,将悬液过滤。

取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。

脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：

分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

3、结果计算

以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）

Ure＝a·V·n/m

式中：

a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。

土壤脲酶活性测定（NH4+释放量法）

脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。

土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。

脲酶催化尿素的水解反应：

在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。

脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。

脲酶含有镍，分子量在151，000Da～480，00Da之间。

能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。

1.试验原理

通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h后测定氨释放量，估计脲酶的活性（Tabatabai,1994）。

2.试验仪器

50mL容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。

3.试验试剂（所用试剂均为分析纯）

a.甲苯（C6H5CH3）;

b.缓冲液：

三（羟甲基）氨基甲烷[c（C2H8O3N3）=0.05mol·L-1,pH9.0]：

称取6.1g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane）溶入700mL蒸馏水中，用c（H2SO4）=0.2mol·L-1的硫酸溶液调pH至9.0，再用蒸馏水定容至1000mL;

c.尿素溶液{c[CO（NH2）2]=0.2mol·L-1}：

称取1.2g尿素溶入约80mL缓冲液中，后用该缓冲液定容至100mL。

尿素溶液要当天配制，并在4℃下保存备用；

d.氯化钾硫酸银混合溶液[c（KCl）＝2.5mol·L-1]－[ρ（Ag2SO4）=100mg·L-1]：

先将100mgAg2SO4溶于700mL蒸馏水中，再加入188g的KCl（分析纯）使之溶解，在定容至1000mL；

e.氧化镁（MgO）：

于高温电炉中，将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h，再放置于干燥器中冷却，贮于瓶中；

f.混合指示剂：

溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇（95％纯度）中；

g.硼酸指示剂溶液[ρ（H3BO3）=20g·L-1]：

溶解20g硼酸于950mL的热蒸馏水中，冷却，加入20mL的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.1mol·L-1],直至溶液呈红紫色（pH约4.5），稀释成1L；

h.硫酸标准溶液[c（1/2H2SO4）=0.005mol·L-1]。

4.试验步骤

将5.00g新鲜土样（<2mm）放置于50mL容量瓶中，加入0.2mL甲苯（试剂a）和9mL缓冲溶液（试剂b），轻摇混匀后加入1.0mL尿素溶液（试剂c），再次轻摇混匀并塞上瓶塞。

在37℃下培养2h。

然后加入约35mL的KCl-Ag2SO4溶液（试剂d），轻摇容量瓶几秒钟后，放置至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4溶液定容，摇匀。

同时要仪同样步骤做空白，只是培养2h后先加35mL的KCl-Ag2SO4溶液，然后加入1.0mL尿素溶液。

蒸馏法测氨：

取土壤悬浮液20mL至蒸馏瓶中，加入0.2g的MgO，用硼酸指示溶液吸收，蒸馏液的体积约为30mL。

用c（1/2H2SO4）＝0.005mol·L-1的H2SO4标准溶液滴定。

5.结果计算

式中：

ω（N）－单位时间内氨态氮的释放量，mg·kg-1h-1；

c－1/2H2SO4标准溶液的浓度，mol·L-1；

V－H2SO4标准溶液的体积，mL；

ts－分取系数，2.5；

14－氮的摩尔质量，mg·mmol-1；

2－培养时间，2h；

m－样品质量，g；

k－水分系数。

6.注意：

a.与其他缓冲液（如磷酸盐缓冲液）相比，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液优点在于它能够有效地防止铵的固定。

在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH，因为后者能够促进脲酶的活性；

b.在配制KCl-Ag2SO4溶液时，应将KCl溶于溶解后的Ag2SO4溶液中，因为Ag2SO4在KCl溶液中不溶。

加入KCl-Ag2SO4混合溶液后脲酶的活性停止，因此该悬浮液在测定氨之前可以放置2h。

方法来源：

鲁如坤.土壤农业化学分析方法.北京:

中国农业科技出版社,2000.

二.过氧化氢酶测定（容量法）

1.分析意义

过氧化氢酶广泛存在于土壤中和生物体内。

土壤过氧化氢酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。

过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关，与微生物数量也有关。

一般认为，土壤中催化过氧化氢分解的活性，有30％或40％以上是耐热的，即非生物活性，常由锰、铁引起催化作用。

土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性成正比例。

2.试验原理

Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活性。

此法根据过氧化氢与土壤相互作用时，未分解的过氧化氢的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的过氧化氢）测定过氧化氢酶活性。

反应方程式如下：

3.试剂配制

a.0.3％过氧化氢溶液：

按1:

100将30%H2O2用水稀释

b.3N硫酸；

c.0.1N高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：

称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。

4.操作步骤

（1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3％过氧化氢溶液。

（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。

（3）将三角瓶放在振荡机上振荡20min。

而后加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。

再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。

然后，吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。

5.结果计算

用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。

（A-B）×T即为过氧化氢酶活性。

以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。

式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。

方法来源：

关松荫.土壤酶及其研究法.北京:

农业出版社,1986.

高锰酸钾溶液的配制与标定

1、配制

称取3.3g高锰酸钾，溶于1050ml水中，缓缓煮沸15min，冷却后置于暗处保存２周。

以４号玻璃滤埚过滤于干燥的棕色瓶中。

过滤高锰酸钾溶液所用的玻璃滤埚预先应以同样的高锰酸钾溶液缓缓煮沸5min。

收集瓶也应用此高锰酸钾溶液洗涤2~3次。

2、标定

称取0.2g于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠，称准至0.0001g。

溶于100ml（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液[c（KMnO4）=0.1mol/l]滴定，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。

3、计算

高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算

c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700

式中         c（1/5KMnO4）=——高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/l；

                 m——草酸钠之质量，g；

                 V1——高锰酸钾溶液之用量，ml；

                  V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，ml；

 0.06700——与1.00ml高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。

KMnO4标准溶液的标定

  准确称取0.15～0.2g预先干燥过的Na2C2O4，加80mL水，20mL3mol·L-1的H2SO4使其溶解，用水浴慢慢加热至有蒸汽冒出（约343～358K）,趁热用待标定的KMnO4溶液进行滴定。

开始宜慢，在第一滴KMnO4溶液滴入后，不要搅动溶液，当紫红色褪去后再滴入第二滴。

待溶液中有Mn2+产生后，反应速度加快，滴定速度可适当加快，但不能使KMnO4溶液呈线状流下。

近终点时，紫红色褪去很慢，应减慢滴定速度并充分搅拌，以防超过终点。

最后滴加半滴KMnO4溶液，搅匀后，微红色半分钟不褪，表明已到终点，计算KMnO4的浓度

三、蔗糖酶测定（比色法）：

1、试剂配制

（1）3，5－二硝基水杨酸溶液：

称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。

（2）pH5.5磷酸缓冲液：

1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5mL即成。

（3）8％蔗糖溶液：

80g蔗糖溶于1000mL水中

（4）甲苯

（5）标准葡萄糖溶液：

将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。

然后取500mg溶于100mL蒸馏水中，即成标准葡萄糖溶液（5mg还原糖/mL）。

再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/mL）。

2、操作步骤

称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL8％蔗糖溶液，5mLpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。

摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。

到时取出，迅速过滤。

从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。

溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。

每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。

在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

3、结果计算

以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：

Suc＝a·V·n/m

式中：

a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。

4.磷酸酶测定（磷酸苯二钠比色法）：

1.分析意义

土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。

在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。

积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。

研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。

磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

2.试验原理

Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。

测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。

后一种称为无机磷含量法。

研究证明，磷酸酶有三种最适pH：

4-5，6-7和8-10。

所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。

测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。

常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。

1、试剂配制

（1）甲苯

（2）磷酸笨二钠：

称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）

（3）缓冲液

（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液

缓冲溶液配制：

（1）酸性磷酸酶:

醋酸盐缓冲液（pH=5.0）

A：

0.2M醋酸钠溶液：

16.4g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。

B：

0.2M醋酸溶液：

11.55mL醋酸定容于1000mL

醋酸盐缓冲液（pH=5.0）：

7mLA＋3mLB混合即得

（2）碱性磷酸酶：

硼酸盐缓冲液（pH10.0）

硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：

A：

硼砂液：

19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中

B：

氢氧化钠溶液：

4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中

50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得

（3）硼酸盐缓冲液（pH9.0）

A：

0.05M硼砂溶液：

19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中

B：

0.2M硼酸溶液：

12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中

硼酸盐缓冲液（pH9.0）：

80mLA+20mLB混匀即得

（4）中性磷酸酶：

柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）

A：

0.1M柠檬酸溶液：

21.01g柠檬酸.H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL蒸馏水中

B：

0.2M磷酸氢二钠：

35.61g磷酸氢二钠.2H2O（53.63g磷酸氢二钠.7H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12H2O）溶于1000mL蒸馏水中

柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：

3.63mLA+16.37mLB混匀即得

（5）2.5％铁氰化钾

（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液

（7）酚原液：

2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。

（8）酚工作液：

取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）

2、操作步骤：

称取5ｇ土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。

再加入5mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和5mL相应的缓冲液（酸性磷酸酶用pＨ5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液），同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。

仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24ｈ。

用热至38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度（甲苯浮在刻度以上），再用致密滤纸过滤。

取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mLpＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL2.5％的铁氰化钾和3mL0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。

待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。

土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。

磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。

标准曲线：

分别向100mL容量瓶中注入1，3，5，7，9，11mL工作液并显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。

方法来源：

关松荫.土壤酶及其研究法.北京:

农业出版社,1986.

5．土壤蛋白酶测定（加勒斯江法）

1.分析意义

蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。

它们的水解产物是高等植物的氮源之一。

土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似，酶活性随剖面深度而减弱。

并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。

2.试验原理

蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。

测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物－氨基酸与某些物质（如铜盐蓝色络合物或茚三酮等）生成带颜色络合物。

依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以表示蛋白酶活性。

3.试验步骤

取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中，加入10mL1％用pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯（作为抑菌剂抑制微生物活动）；在30℃恒温箱中培养24h；培养结束后，将瓶中内容物过滤；取5mL滤液置于试管中，加入0.5mL0.1N硫酸和3mL20％硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入50mL容量瓶，并加入1mL2％茚三酮溶液；将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线；最后在560nm处进行比色。

用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。

换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。

4.试剂配制

a.1%白明胶溶液（用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制）；

b.甲苯；

c.磷酸盐缓冲液（pH7.4）；

d.0.1NH2SO4;

e.20％Na2SO4；

f.2％茚三酮溶液：

将2g茚三酮溶于100mL丙酮，然后将95mL该溶液与1mLCH3COOH和4mL水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）；

g.甘氨酸标准液：

浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液：

0.1g甘氨酸溶解于1L蒸馏水中。

再将该标液稀释10倍得10μg甘氨酸•1mL-1溶液的甘氨酸工作液。

标准曲线绘制：

分别吸取0、1、3、5、7、9、11mL该工作液于50mL容量瓶中即获得甘氨酸浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg•mL-1的标准溶液梯度，然后加入1mL2％茚三酮溶液。

冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min。

将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。

在560nm处进行比色，最后绘制标准曲线。

5.结果计算：

土壤蛋白酶的活性，以24h后1g土壤中甘氨酸的微克数表示。

甘氨酸（μg•g-1）－24小时后1g土壤中甘氨酸的微克数；

c－标准曲线上查得的甘氨酸浓度，μg•mL-1；

50－显色液体积，mL；

ts－分取倍数（这里是2＝10/5）；

m－土壤质量，g。

方法来源：

曹承绵,张志明,周礼恺.几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较.土壤通报,1982,13

（2）:

39-40.

几种水解酶：

芳基硫酸酯酶（Arylsulphatase（EC3.1.6.1））,葡萄糖苷酶（β-glucosidase（EC3.2.1.21））和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase（EC3.1.3））测定：

这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenylsulphate,p-nitrophenylglucosideandp-nitrophenylphosphate,respectively）裂解后释放的p-nitrophenol的量来测定。

Arylsulphatase（EC3.1.6.1）：

称取1g土（湿重），与4ml500mM乙酸缓冲液（acetatebuffer）（pH5.8）和1ml底物（25mM）混匀。

对照为4ml乙酸缓冲液加1ml灭菌蒸馏水。

土壤稍作涡旋振荡，置于旋转摇床20℃，200rpm培养2h。

然后，往样品中加1ml无菌蒸馏水，往对照中加1ml底物。

再加入1ml500mM氯化钙和4ml500mM氢氧化钠以终止反应。

悬浮液在旋转摇床上20℃，200rpm振荡30min。

9464×g离心5min，然后在400nm波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol的颜色深度。

如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。

标准曲线制作：

用蒸馏水配制p-nitrophenol溶液，浓度范围0-50ug/ml。

β-glucosidase（EC3.2.1.21）：

缓冲液换为改进的通用缓冲液（modifieduniversalbuffer）（pH6.0）;底物浓度25mM，提取液用Tris缓冲液（pH12.0）.

phosphmonoesterase（EC3.1.3）:

缓冲液换为改进的通用缓冲液（modifieduniversalbuffer）（pH4.0和9.0）（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为15mM。