细胞工程实验总结.docx
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细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备
1、哪些物品适合于高压灭菌,并说明理由。
①材料:
微孔滤膜(直径25cm):
孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90cm):
孔径为0.22μm、过滤器(直径25cm)。
②仪器和器材:
眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶(或盐水瓶)、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升(或10毫升)吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由:
适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌?
1)PBS:
8.0gNaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000mL双蒸水,高压灭菌,4℃保存。
(准备试剂瓶)灭菌方法:
高压灭菌。
2)干粉培养基过滤除菌
(先准备好不锈钢过滤器及滤膜,安装后高压灭菌,适度烘干;铝盒4个,三角瓶2个,容量瓶,不锈钢过滤器一套,酒精灯,酒精棉球3瓶,吸耳球3个,吸量管10毫升和5毫升各5根,分装用瓶,血清,超纯水,抗生素)
认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。
配制方法(1L):
1)在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2)在室温(20℃到30℃)的水中加入干粉培养基。
3)水洗袋内残留培养基,全部转移到容器内,轻轻搅拌,不要加热。
4)完全溶解之后,1袋1L粉状DMEM加3.7gNaHCO3,1mmoL∕L丙酮酸钠,即0.11g/L,添加双抗。
5)用双蒸水定容到1L,搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6)通过缓慢搅拌加入1NNaOH或1NHCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
7)立刻不锈钢过滤器过滤除菌,贴上标签,4℃保存备用。
灭菌方法:
高压灭菌。
3)胰蛋白酶-EDTA消化液
①胰蛋白酶溶液配制:
称取胰蛋白酶(1:
250)粉末0.25g置烧杯中,溶于100mLPBS,搅拌混匀,置室温4小时并不断搅拌振荡,过滤除菌。
(若配制400mL则应称取1g胰蛋白酶)
灭菌方法:
过滤除菌。
②EDTA溶液配制:
0.2gEDTA用400mLPBS溶解后,高压蒸汽灭菌,分装成小瓶,4℃冰箱保存。
灭菌方法:
高压蒸汽灭菌。
胰蛋白酶与EDTA按1:
1混合后分装,4℃冰箱保存。
4)抗生素液
双抗(青霉素、链霉素)各1克,溶于100mL纯水,过滤除菌,分装,4℃冰箱保存。
使用前1:
100稀释。
灭菌方法:
过滤除菌。
3、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。
操作方法:
2清洗1)新玻璃器皿的清洗2)使用过的玻璃器皿的清洗3)胶塞的处理
3消毒1)物理消毒法
(2)干热灭菌(4)过滤除菌(5)煮沸消毒急2)化学消毒法
常用的消毒液有如下几种:
(1)70%(或75%)酒精
(2)0.1%新洁尔灭(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)(4)0.5%过氧乙酸(5)乳酸蒸气(6)37%甲醛加高锰酸钾(7)甲醛消毒方法
注意事项
1、清洗玻璃制品时,浸酸之后一定要用自来水冲洗10-15次。
清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
2、干热灭菌时,应在白天使用烤箱,并不断观察,以免发生意外。
当温度超过100℃时,不能再打开烤箱门。
器皿烤完后,待温度降至100℃之下才能开烤箱门。
金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
3、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干。
4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂均不能高压。
需要长期保存的血清必须储存于-20℃—-80℃低温冰箱中。
4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。
血清在冻入低温冰箱前,不要装得太满,必须预留一定体积空间,(其他溶液冻存也是如此)。
一般厂商提供的血清无需再过滤除菌。
如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤。
血清解冻需采用逐步解冻法,切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻。
在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀,使温度与成分均一,待全部溶解后再分装。
5、滤过除菌时,滤器在使用前先装好滤膜,包好,经高压灭菌后才能使用。
过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好,去除压力后针筒会反弹即为完好无损。
滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。
过滤时压力不宜过。
装滤膜时位置要准确。
另外滤器包装时,螺钉不要拧得太紧待高压灭菌之后,再拧紧使用。
6、使用化学消毒法时,配制75%酒精应用卫生级,不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。
来苏儿水不能用于皮肤消毒。
空气消毒时,所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
7、培养基过滤器过滤除菌注意事项:
(1)细胞培养用水一般为三蒸水或超纯水,医药生产上一般为注射用水。
(2)建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用。
(3)溶解干粉培养基时先加入终体积90%-95%的培养用水,添加剂加完后再定容。
(4)如需添加的组分较多时,某一组分完全溶解后,再添加另一组分。
(5)待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠。
(6)所有成分完全溶解后,培养基应立即过滤或高压除菌。
(7)在过滤前,可将pH调至比所需值低0.1-0.2个单位。
(8)在细胞培养过程中,建议不加或加少量的抗生素,如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。
(9)建议用1NHCl或1NNaOH来调节培养基的pH。
8、物品放进饭盒后要贴好标签,还需要用棉布或牛皮纸包好再贴上标签。
在标签处包扎好。
容器,包括装PBS的玻璃瓶,瓶口要拧松,不能紧,瓶口包扎牛皮纸,灭菌后立刻拧紧瓶盖,然后再取出,冷却后放入冰箱。
注意检测标签是否脱落。
9、根据每个实验的要求,准备好所需物品,一并放入超净台内。
实验器材准备的数量要大于实际使用数,瓶盖要大于瓶数。
要配备至少三套器械(一套使用,一套备用,一套清洗灭菌),循环使用。
10、玻璃瓶、移液管要封闭包扎使用端,标记手持端。
实验二鸡胚胎成纤维细胞的原代培养
1、如何进行鸡胚胎成纤维细胞的原代培养。
实验进行前,准备好相关器材,无菌室及超净工作台以紫外灯照射灭菌30-60 分钟(溶液同时37℃预热),然后开启通风10 分钟后,才开始实验操作。
实验用品以75% 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在中央无菌区域酒精灯火焰旁进行。
1、取9-10日龄的鸡胚,用酒精消毒,在超净工作台内,小心取出鸡胚,放在无菌培养皿中,除去头尾、四肢及内脏;
2、胚体用含双抗PBS冲洗2-3次,切成1-2mm3的小块,然后转入容积适量大小的离心管;
3、按每个鸡胚加入大约5mL的胰酶消化液,在室温(或37℃)下消化10min,吸管(或枪头)不停吹打;
4、加入含小牛血清培养液终止消化,收集细胞悬液,没有消化完全的组织块可再消化一次;
5、收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤,1200转离心5min;离心管用酒精擦拭后拿进超净台,拧开盖子后,管口过火焰两次,倒出上清,保存管口向下蘸一下干的酒精棉球,再保存管口向下过火焰两次;
6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮;
7、以5×105个/mL的密度溶液3.4ml接种到培养瓶中(大约20-30mL细胞液/鸡胚0.6ml),观察细胞形态(绘图),将瓶盖微松,于37℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。
8、经过1天的培养。
2、原代培养时如何从组织分离细胞?
收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤,1200转离心5min;离心管用酒精擦拭后拿进超净台,拧开盖子后,管口过火焰两次,倒出上清,保存管口向下蘸一下干的酒精棉球,再保存管口向下过火焰两次;
6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮;
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
实验三:
培养细胞的形态观察及活率检测
1简述培养细胞的形态观察方法及注意事项。
(一)培养细胞的形态观察
1、将细胞培养瓶从二氧化碳培养箱中取出,注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。
然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上,此时应注意不要将瓶翻转,也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。
2、打开倒置镜光源,通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。
3、调节载物台的高度进行对焦,在看到细胞层之后,再用细调节器将物像调清楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。
在观察时,最经常使用的是20X物镜(绘图)。
(二)观察细胞体外培养状况
细胞培养24h后,即可进行观察,观察的重点如下:
A.首先要观察培养细胞是否污染(观察阳性对照样品)。
主要观察培养液颜色的变化及混浊度。
B.观察培养基颜色变化及细胞是否生长。
C.如细胞已生长,则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。
D.观察完毕,可用台盼蓝染液对细胞进行染色。
以确定死、活细胞的比例。
2、简述台盼兰染色和伊红染色检测细胞活率的原理及操作方法。
台盼兰染色原理:
由于培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。
呈橙黄色时,细胞一般生长状态较好;呈淡黄色时,则可能是培养时问过长,营养不足,死亡细胞过多;如呈紫红色,则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。
实际上,一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、pH、生长周期而改变,但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。
在贴壁细胞培养中,镜下折光率高,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。
伊红染色检测细胞活率的原理:
贴壁细胞在生长状态良好时,细胞内颗粒少,看不到有空泡,细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培养液清澈透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多时,表明生长较差。
当瓶内培养基混浊时,应想到细菌真菌污染的可能。
操作方法:
(四)台盼兰染色
1) 配制0.2%(W/V)台盼兰水溶液(溶于PBS,加热使之完全溶解,用滤纸或纱布过滤除渣,装入瓶内室温保存),及4.25%(W/V)Nacl溶液;
2) 测定前,取4份0.2%台盼兰与1份盐水混合;
3) 取台盼兰溶液,另入到等量细胞悬中(细胞浓度2-5×106细胞/ mL)混匀;
4) 将细胞悬液加入血球计数板中,使液体自然充满计数板小室。
注意不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加。
分别计数末染色的细胞数(活细胞)及染色的(死细胞)细胞数。
细胞计数200个以上,(绘图)。
5)计算细胞活率:
活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。
(五)伊红Y染色
1) 配制0.2%(W/V,溶于PBS)伊红Y水溶液;2) 取0.1mL细胞液悬(细胞浓度2-5×106细胞/ mL),加入等量伊红Y溶液混匀;3)2min后将细胞悬液加入血球计数板中,镜检、计数。
死细胞染成桃红色,活细胞不着色(绘图)。
细胞计数200个以上。
,(绘图)
4)计算细胞活率:
活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
放大的计数室
按下式进行细胞浓度的计数:
注①4大格中的每一大格体积为0.1mm3。
1mL=l,0000大格,因此,1大格细胞数×104=细胞数/mL。
注②染色标本在15分钟内检查计数,因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色,延长时间活细胞也将着色,用此方法来分辨死活细胞。
进行细胞计数时应力求准确,因此,在科学研究中,往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液,并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次),最后取结果的平均值。
实验四:
鸡胚胎成纤维细胞的传代培养
1、简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。
在做传代细胞培养之前,首先将培养瓶置于显微镜下,观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部(绘图),如已长成单层,即可进行细胞的传代培养。
1、完全培养基配制:
DMEM液 90%;小牛血清 10%;双抗(1万单位/mL) 加至约100单位/mL;
2、取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内;
3、从培养箱内取出细胞,取出细胞时要旋紧瓶盖,再在镜下观察细胞。
用酒精棉球擦拭后放入超净台内;
4、在酒精灯旁打开瓶塞,在酒精灯上烧口消毒,吸出原培养液,然后用PBS清洗细胞2次,尽量除去残余的血清;
5、25mL培养瓶中加入0.2mL的消化液进行消化,以盖满细胞为宜,置于室温或放置于培养箱内,停留1-2min后,不停摇晃培养瓶。
消化程度可在倒置显微镜下观察,一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形,细胞之间不再连接成片为度;
6、吸出消化液,加入适量的含小牛血清的培养液,反复轻轻吹打培养瓶底部,使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞;
7、收集细胞悬液,1200-1500转离心5min,去上清;
8、用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活率和密度,以5×105个/mL密度(1:
3)接种到培养瓶中,在瓶侧壁做好标记;
8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度;适当旋松瓶盖,于37℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养;
9、4小时后及第二天观察细胞生长情况。
图4-2贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程
五、注意事项
1、严格无菌操作,作并防止细胞之间的交叉污染。
所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。
每次最好只进行一种细胞的操作。
每一种细胞使用一套器材。
培养用液应严格分开,不同液体不要共用吸管。
2、所有溶液最好37℃预热。
3、掌握好消化程度。
4、正确摆放使用的用具,保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
2、细胞传代培养获得成功的关键要素是什么?
①在做传代细胞培养之前,将培养瓶置于显微镜下,观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层,如已长成单层,才能进行传代培养。
②传代培养的细胞需逐日进行观察,注意细胞有无污染,培养液颜色的变化及细胞生长的情况。
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
实验二鸡胚胎成纤维细胞的原代培养
(大约20-30mL细胞液/鸡胚),观察细胞形态(绘图),
实验三:
培养细胞的形态观察及活率检测
在观察时,最经常使用的是20X物镜(绘图)。
(观察阳性对照样品,(绘图))。
细胞计数200个以上,(绘图)。
活细胞不着色,(绘图)。
细胞计数200个以上。
实验四:
鸡胚胎成纤维细胞的传代培养
观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部(绘图),
8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度(绘图);9、4小时后及第二天观察细胞生长情况(绘图)。
图4-2贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程
啤酒发酵实验
实验目的:
1.学习酵母菌种的扩大培养方法,为实验室啤酒发酵准备菌种。
实验原理:
1在进行啤酒发酵之前,必须准备好足够量的发酵菌种。
在啤酒发酵中,接种量一般应为麦芽汁量的10%,因此,要进行大规模的发酵,首先必须进行酵母菌种的扩大培养。
扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母,另一方面是使酵母由最适生长温度(28℃)逐步适应为发酵温度(10℃)。
.2啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦醪过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程。
啤酒发酵是纯种发酵,必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。
3.麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。
由于麦芽的价格相对较高,再加上发酵过程中需要较多的糖,
实验器材:
恒温培养箱,生化培养箱,显微镜、粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、发酵罐、制冷机、板式换热器、糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅、带冷却装置的发酵罐(50L,100L)、。
实验步骤:
一.啤酒酵母的扩大培养
28℃,2天
菌种扩大:
麦汁斜面菌种→麦汁平板——→镜检,挑单菌落3个,接种
50mL麦汁试管(或三角瓶)—20℃,2天→550mL麦汁三角瓶—15℃,2天→计数备用。
每天摇动3次每天摇动3次
1培养基的制备
取协定法制备的麦芽汁滤液(约400mL),加水定容至约600mL,取50mL装入250mL三角瓶中,另550mL至1000mL三角瓶中,包上瓶口布后,0.05Mpa灭菌30分钟。
2菌种扩大培养
按上面流程进行菌种的扩大培养(斜面活化菌种由教师提供)。
注意无菌操作。
五、注意事项:
灭菌后的培养基会有不少沉淀,这不影响酵母菌的繁殖。
若要减少沉淀,可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。
二、小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐的空消
1.熟悉各项设备;
清洗各项设备;
在回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中通入蒸汽,消毒30分钟。
待各项设备使用结束后,应及时进行清洗灭菌。
三、麦芽汁的制备
1.麦芽粉碎
用谷物粉碎机粉碎,使粗细比例控制在1:
2.5,同时使表皮破而不碎。
必要时可稍稍回潮后在粉碎。
2.糖化
采用浸出糖化法
实验台称600g麦芽加入3000ml水,分入四个烧杯中于水浴锅上加热,使水浴锅中的液面高于烧杯中的液面。
糖化流程:
35~37℃,保温30min→50~52℃60min→65℃30min(碘液反应完全)→76~78℃送入漏斗中进行过滤。
3.麦汁过滤:
用4~6层纱布进行过滤,前1L滤液收集返回漏斗中重新过滤,其余正常过滤。
把糟用2L的70度的水冲洗出来,充分利用原料。
(过滤目的:
尽快把麦汁和麦槽分开,以得到清凉和较高收率的麦汁,避免影响半成品麦芽汁的色香味。
)
4.麦汁煮沸:
收集全部滤液,加热煮沸后加入5g酒花,继续煮沸1~1.5h。
其间要经常搅拌。
停火后,沿着锅壁顺着一个方向搅拌,锅底中间会出现沉淀物。
静置,把热麦汁趁热缓缓倒入灭过菌的封口容器(大的带盖子的),尽量减少沉淀物进入。
目的:
通常采用传统的间歇常压煮沸法。
煮沸时间一般为70-90分钟。
)
5.麦汁冷却。
在麦汁冷却到室温后加入啤酒酵母,这个过程容易染菌,须在酒精灯火焰保护下加入
6.设备清洗
由于麦芽汁营养丰富,各项设备及管阀件(包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器)使用完毕后,应及时用洗涤液和清水清洗,并蒸汽杀菌。
7.主发酵
10℃发酵5~6d。
发酵结束制成嫩啤酒。
观察主发酵过程中的变化,并且做好实验记录。
8.后发酵
装瓶后置于冰箱中发酵7d。
实验结果
(注:
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