气相色谱质谱法分析研究野生菱角壳中多糖化合物的单糖组成百精.docx
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气相色谱质谱法分析研究野生菱角壳中多糖化合物的单糖组成百精
气相色谱2质谱法分析研究野生菱角壳中
多糖化合物的单糖组成
尚庆坤 李德谦
3
(,玄玉实 阎吉昌 (,摘 要 4种多糖化合物,利用气相色谱2质谱法,确定了,,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,乳糖和蜜二糖组成,其中以葡萄糖,半乳糖,关键词,气相色谱2质谱,单糖
2003212225收稿;2004203231接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No.20371046
1 引 言
20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复杂多样的生物活性和功能
[1~4]
如多糖有免疫调节
功能可作为广谱免疫促进剂,作为药物可以治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等;还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂,促进核酸与蛋白质的生物合成等作用。
菱,别名菱角、水菱角、风菱,为菱科菱属植物乌菱TrapabicornisOsbeck的种子,据文献[5]记载,其果壳、果柄、果、茎及叶柄均可入药,有健胃止痢、抗癌等作用;还可用于治疗胃溃疡、痢疾、食道癌、子宫颈癌及乳腺癌等。
本研究首次从野生菱角壳中提取分离出多糖,并对多糖的单糖组成进行了深入的研究[6,7]
为进一
步开发和利用野生菱角资源提供了科学依据。
2 实验部分
2.1 样品、试剂与仪器
市售的菱角去仁后,壳晒干,粉碎备用。
单糖及双糖标准物质(半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘
露糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖均购自ChemService,纯度大于98%。
所用化学试剂除甲醇和乙醇为色谱纯外,其余均为分析纯。
UV22501PC紫外光谱仪(日本岛津公司;NicoletMagna560傅里叶变换红外光谱仪(美国尼高力公
司;VarianUnityPlus600核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司;HP6890和HP5973气相色谱2质谱联用仪(美国安捷伦公司。
2.2 实验方法
(1多糖化合物的提取及纯化方法 称取800g洗净晒干的菱角壳,加入1∶1的乙醇2乙醚混合液,65℃水浴回流1~3h去脂;残渣中加水,90~100℃水浴提取4~6h,更换清水反复提取2~3次,合并
深红色多糖提取液,过滤,浓缩。
向提取液加入3/7倍体积的乙醇,离心分离沉淀,冻干得多糖粗品F1。
向上清液中加入1.0倍体积的乙醇,离心分离沉淀,冻干得多糖粗品F2。
依此方法,向上清液中先后加入1.5和4.0倍体积乙醇,分别得到多糖粗品F3和F4。
若直接向原多糖提取液中加入4倍体积的无水乙醇,则得到混合多糖粗品F5。
用Sevag法除去多糖粗品中的蛋白质,H2O2法除去色素,透析72h后,浓缩,冻干,即得多糖纯品;(2多糖的水解 取多糖样品10mg于安瓶中加入3moL/L三氟乙酸2mL,
第33卷
2005年1月 分析化学(FENXIHUAXUE 研究简报ChineseJournalofAnalyticalChemistry
第1期
73~76
密封后在120℃恒温中水解6h,用氮气吹干三氟乙酸,加甲醇并吹干,水解产物加入0.6mL0.05mol/LNaOH溶液,再加5mgNaBH4,室温下反应8~10h,加少许乙酸分解过量的NaBH4,至无气泡产生为止。
蒸干反应液,以酸性甲醇洗涤反应产物,蒸干甲醇液,重复3~4次以除去硼酸根,最后加入甲醇蒸干并于烘箱中105℃除净水分;(3乙酰化衍生法 取水解得的单糖3mg,加入0.5mL吡啶,1mL乙酸酐,加热2h,冷却后加甲苯2mL,用N2吹干,加入氯仿,蒸馏水洗涤,用N2。
此乙酰化的单糖醇用CHCl3稀释后进行气相色谱2质谱分析;(46mg,加吡啶0.6mL,六甲基四硅胺烷0.2mL,0.,谱2质谱分析。
2.3 GC2MS分析条件
HP25(,(0mmi.d.,0.25μm;EI源,电子能量70eV,,接口温度270℃,载气氦气流速1.2mL/min,分流比20∶1,:
/min
15015℃/min
260℃(40min。
3 3.1 菱角壳提取物中多糖的鉴定分析
Molisch实验:
硫酸和多糖溶液分为两层,层与层之间有紫色环出现。
说明提取物确含糖。
混合多
糖F5纯品的FT2IR谱图见图1。
谱图中多处可见到多糖的特征峰,如:
3435cm
-1
2924cm-1
的吸收峰
分别为H,H的伸缩振动峰,1193cm-1
1037cm-1
处的吸收峰是多糖中O,C
的伸缩振动和OH的弯曲振动特征峰,在1000~700cm-1
的吸收峰则是α2和β2吡喃单糖形成的特征。
混合多糖F5纯品的1
HNMR谱图见图2。
谱图中δ3.5~
δ5.5之间可见多个糖质子的响应信号峰,其中δ4.605、δ4.
7和δ4.9223个峰是β2吡喃环上的质子信号,而δ5.238、
δ5.348、δ5.446、
δ5.465和δ5.515则可能来自于α2吡喃环上的质子,由此可见,此多糖可能是由多种单糖组成。
3.2 菱角壳多糖中单糖组成的确定
样品F1~F4水解产物的乙酰化衍生物经气相色谱2质谱分析,通过与标准色谱图对照比较和质谱碎片解析,确定了其单糖组成及摩尔比,结果列于表1。
表1数据表明,4种多糖分别由不同摩尔比的几种单糖(如阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和二糖(乳糖、蜜二糖组成,其中多糖F2~F4的单糖组成相同,只是摩尔比略有不同;而F1则由5种单糖和2种二糖组成。
葡萄糖,半乳糖和甘露糖在4种多糖中占的比例较大,是菱角多糖的主要成分。
图1 混合多糖F5的傅里叶变换红外光谱图
Fig.1 Fouriertransforminfraredspectrogramofpolysac2charideF5
图2 混合多糖F5的1H核磁共振谱图(600MHz,60℃
Fig.2 1
HnuclearmagneticresonancespectrumofF5recordedat600MHzand60℃
混合多糖样品F5的甲基硅烷化衍生物的GC2MS总离子流图见图3。
其质谱解析结果列于表2。
经碎片分析并利用标准质谱NIST库进行检索,图3中11个色谱峰被确认为单糖的甲基硅烷化衍生物。
由于在衍生化过程中α型和β型吡喃和呋喃异构体的生成,同一单糖可以生成几种衍生物。
因此,只检出5种单糖,其中包括两种戊糖(阿拉伯糖和木糖,3种己糖(甘露糖,半乳糖和葡萄糖。
从表2中的峰面积百
47
分析化学第33卷
分比数据还可以看出,葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖在该混合多糖中所占的比例较大,是菱角多糖的主要成分,这与乙酰化分析的结果基本一致。
表1 4种多糖的乙酰化衍生物气相色谱2质谱分析结果
(
多糖Fractions保留时间
Retention
time(min
摩尔比
Molarratio
单糖衍生物
Derivativesofmonosaccharide
相似度Analogy(%
F16.931.5阿拉伯糖Arabinose917.071.1鼠李糖Rhamnose937.241.31,2,3,4,52五2O2乙酰化D3,4,22ol939.221六乙酰化D2甘D939.472.8D2葡9517.192.Lactose9117.3190F2D2甘露糖醇D2Mannitol,hexaacetate942.六乙酰化半乳糖醇Galactitol,hexaacetate959.10.5六乙酰化D2葡萄糖醇D2Glucitol,hexaacetate97F39.221六乙酰化D2甘露糖醇D2Mannitol,hexaacetate959.332.08六乙酰化半乳糖醇Galactitol,hexaacetate959.418.5六乙酰化D2葡萄糖醇D2Glucitol,hexaacetate97F49.211六乙酰化D2甘露糖醇D2Mannitol,hexaacetate949.322.9六乙酰化半乳糖醇Galactitol,hexaacetate969.404.3六乙酰化D2葡萄糖醇D2Glucitol,hexaacetate96
表2 混合多糖F
5
三甲基硅烷化衍生物分析结果
Table2 AnalysisresultsoftrimethylsilylmethylglycosidederivativesofhydrolyzedF
保留时间tr(min
分子式
Molecular
formula
分子量
Molecular
weight
单糖衍生物
Derivativesofmonosaccharide
相似度
Analogy
(%
峰面积百分比Peakarea(%
20.72C17H42O5Si4438.21,2,3,42四2氧2(三甲基硅烷基2β2L2吡喃阿拉伯糖
β2L2Arabinopyranose,1,2,3,42tetrakis2O2(trimethylsilo2900.04
21.30C16H38O5Si3394.2甲基22,3,42三2氧2(三甲基硅烷基262去氧基2α212吡喃甘
露糖苷α2lMannopyranoside,methyl62deoxy22,3,42tris2O2
(trimethylsilyl2
940.09
21.89C16H38O5Si3394.2甲基22,3,42三2氧2(三甲基硅烷基262去氧基2β212吡喃半
乳糖苷β2l2Galactopyranoside,methyl62deoxy22,3,42tris2O2
(trimethylsilyl2
890.04
22.80C15H36O5Si3380.2甲基22,3,42三2氧2(三甲基硅烷基2α2D2吡喃木糖苷
α2D2Xylopyranoside,methyl2,3,42tris2O2(trimethylsilyl2960.31
23.15C19H46O6Si4482.2甲基22,3,4,62四2氧2(三甲基硅烷基2α2D2吡喃木糖苷
α2D2Mannopyranoside,methyl2,3,4,62tetrakis2O2(trimethyl2
silyl2
940.16
25.13C19H46O6Si4482.2甲基22,3,4,62四2氧2(三甲基硅烷基2β2D2吡喃半乳糖苷
β2D2Galactopyranoside,methyl2,3,4,62tetrakis2O2(trimethyl2
silyl2
9450
25.85C19H46O6Si4482.2甲基2四2氧2(三甲基硅烷基2α2D2半乳糖苷
α2D2Galactoside,methyltetrakis2O2(trimethylsilyl2960.24
26.40C19H46O6Si4482.21,2,3,42四2氧2(三甲基硅烷基262氧2甲基2β2D2吡喃葡萄
糖β2D2Glucopyranose,62O2methyl21,2,3,42tetrakis2O2trim2
ethylsilyl2
930.07
26.87C19H46O6Si4482.22,3,4,62四2氧2(三甲基硅烷基2α2D2吡喃葡萄糖苷α2D2
Glucopyranoside,methyl2,3,4,62tetrakis2O2(trimethylsilyl2991.20
27.17C19H46O6Si4482.2甲基22,3,4,62四2氧2(三甲基硅烷基2β2D2吡喃葡萄糖苷
β2D2Glucopyranoside,methyl2,3,4,62tetrakis2O2(trimethyl2
silyl2
970.52
27.81C24H62O6Si6614.31,2,3,4,5,62六2氧2(三甲基硅烷基2D甘露醇D2Manni2
tol,1,2,3,4,5,62hexakis2O2(trimethylsilyl2920.0457
第1期尚庆坤等:
气相色谱2质谱法分析研究野生菱角壳中多糖化合物的单糖组成
图3 F
5
.3chr2spectrometric(GC2MStotalioncurrentprofileof
theglycosidederivativesoffraction5
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StudiesoftheMonosaccharideinPolysaccharidesoftheHullofNaturalWaterChestnutbyGasChromatograpahy2MassSpectrometryShangQingkun,LiDeqian3
(KeyLaboratoryofRareEarthsChemistryandPhysics,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,
ChineseAcademyofSciences,Changchun130022
XuanYushi,YanJichang,ChuRenhe,LiuXinzeng
(TestandAnalysisCenterofChemicalSeminary,North2eastNormalUniversity,Changchun130024
Abstract Fourpolysaccharidesprecipitatedbyethanolfromthehullofwaterchestnutarereported.Themonosaccharidecompositionshavebeendeterminedbytheirretentiontimesandcharacteristicgaschromatogra2phy2massspectrometryfragmentationpatterns.Thepolysaccharidesarecomposedofarabinose,rhamnose,xylose,mannose,galactose,glucose,lactoseandmelibiose.Themajormonosaccharidecomponentsaredeter2minedasglucose,galactose,monoseandxylose.
Keywords Polysaccharide,gaschromatography2massspectrometry,monosaccharide
(Received25December2003;accepted31March200467 分析化学第33卷