miRNA常用实验方法.docx

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miRNA常用实验方法

miRNA常用实验方法

一、miRNA的检测方法

miRNA的realtime-PCR检测方法

1、realtime-PCR引物设计

miRNArealtime-PCR引物设计方法：

1）stem-loopRT引物设计：

基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。

通用茎环结构序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT

2）realtime上游引物设计：

miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为（注意把U改为T）：

TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。

因此miR-1的上游引物可设计为：

GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。

一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。

2、miRNA反转录

miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。

因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。

我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：

RNA500ng~2ug

5xbuffer2ul

dNTP0.25ul

DDT0.25ul

RRI0.25ul

MLV0.25ul

RTprimer0.5ul

H2O（RNasefree）补至10ul

程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。

！

！

做miRNA的反转录时，注意不要忘记内参的RT，即一个样品至少要做目的miRNA和内参两管反转录反应。

3、realtime-PCR实验

miRNA逆转录完成后得到的cDNA即可进行下一步PCR。

在确认引物的特异性后，我们可以进行正式实验。

一般每个样品至少需要3个平行孔。

RealtimePCR体系为（ABI定量PCR仪需要加ROXdyeII，Biorad定量PCR仪不需要加ROX）：

2XSYBR10ul

ROXII0.4ul（Biorad不加）

Primer1ul

Template1ul

H2O7.6ul（Biorad8ul）

需要注意的几点：

1）在配制PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。

每步分装前充分混匀。

这一点是PCR平行性的保证。

2）配制体系尽量在冰上进行。

3）请选用比较准确的枪进行体系配制，并注意体系的冗余。

一般来说，配制一整个96孔板的PCR体系，我会配制100个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。

PCR程序：

95度，1min；95度，5s；60度，34s（此步在读取荧光值）。

40到45个循环。

4、realtimePCR结果分析

realtimePCR反应结束后返回Ct值，可以利用定量PCR仪软件自带的程序进行分析，也可以利用EXCEL表格进行相对定量计算。

具体的计算方法：

将三个平行孔的数值拷入到EXCEL表格的相应位置，即可自动计算出相对值。

注意，第一组样品的值将被默认为归一为1。

其他的样品与之相比得出相对值。

EXCEL表格公式见附件。

二、miRNA靶基因的预测

miRNA靶基因预测软件简介

1、TargetScan：

首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的miRNA和靶基因，则点击右上角的“GotoTargetScanMouse”。

第二个选项可输入基因名（有时不识别别名），点击submit即可，此操作可预测可能靶向该靶基因的miRNA；或者输入miRNA的名字，点击submit，此操作可以预测该miRNA的靶基因。

2、Pictar：

输入网址后进入pictar主页，下面有几个可选用的数据库，一般选用最后两个数据库即可。

点击进入预测界面。

选择物种，选择要预测的miRNA（注意：

如果你感兴趣的miRNA在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件）并点击searchfortargetsofamiRNA或输入geneID（注意：

与targetscan不同，pictar一般不识别基因名，最好输入gene号：

NM_*****）点击searchforallmiRNAspredictedtotargetagene.进行预测。

3、Mirbase：

分别输入miRNA名或基因名即可进行预测。

其他选项不用更改。

预测结果的处理和分析

我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，选取两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因。

如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。

如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能提示进行挑选。

三、miRNA的过表达和敲低

1、过表达

过表达miRNA一般可采用两种方法：

a构建过表达载体；b人工合成成熟miRNA。

a构建过表达载体

1）获取miRNA基因的序列及旁侧序列进入Ensembl（）主页。

输入miRNA名，点击进入。

在exportdata页面上选择输入5’flankingsequence和3’flankingsequence分别为200bp（见下图），然后点击next即可得到包括前体和左右侧翼200bp的序列。

2）基于这段序列，我们可以设计该miRNA的表达序列。

引物设计原则：

扩增产物包括前体，并左右各有至少70bp的侧翼序列，长度一般在200bp-500bp。

其他同一般引物设计。

载体可以选用任意使用RNApolII识别的启动子的载体，包括T7，CMV等。

常用的是pcDNA3.1，不要带标签的。

注意：

如果miRNA位于cluster中，则扩增长度要控制，避免同时包括两个或两个以上的miRNA。

完成表达载体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行表达检测。

如果目的miRNA的表达明确，则载体构建完成。

b合成成熟的miRNA序列查出miRNA的准确序列，请公司合成成熟的序列。

常用的公司有：

上海吉凯；invitrogen等。

2、敲低

目前做内源性miRNA的敲低一般使用人工合成的miRNA的反义链，即成熟miRNA的序列的反义互补序列。

如mir-x序列为UCACACAACCCACCACCAUUG，则其inhibitor序列为CAAUGGUGGUGGGUUGUGUGA.将该序列送交公司合成即可。

报告基因实验方法

一、miRNA靶基因筛选

荧光素酶报告基因实验

1、荧光素酶报告基因质粒的构建

载体质粒为经过改造的pcDNA3.1，其图谱见下图。

可用的酶切位点为NotI，XhoI及XbaI.推荐优先使用XhoI和XbaI两个酶切位点。

如过不能用，可用NotI.

靶基因3’UTR的获得。

3’UTR序列是指从Mrnaz终止密码子后的第一个碱基开始到mRNA最后一个碱基（通常是polyA结尾）。

模板可采用相应物种的cDNA或基因组。

在选择模板时要注意：

一般来讲，cDNA适于所有的3’UTR扩增，但有时3’端AT过多导致引物设计困难时，可以考虑用基因组做模板。

但是基因组做模板的前提是靶基因3’UTR由一个外显子组成。

相关信息可以从ensembl中查阅外显子信息可以知道。

一般尽可能全面的扩增3’UTR，但如果3’UTR过长或引物设计困难，可以选取包括miRNA结合位点的一段3’UTR。

引物设计的原则同一般引物设计。

2、荧光素酶实验

构建好荧光素酶报告基因实验后，准备开始做报告基因实验前，你还需要准备以下材料：

1）TK质粒，作为共转染的内参。

2）miRNA的过表达质粒或合成的miRNA。

质粒的浓度尽量在500ng/ul以上，合成的miRNA稀释到20uM。

3）状态良好的细胞。

1）分细胞。

我们常用24孔板进行报告基因实验。

分细胞时保证细胞铺板均匀（摇匀细胞的方法见细胞培养的方法），每孔细胞数目相当。

以293ET细胞为例，我们转染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯转染试剂，细胞密度可以稍高些，因为转染后细胞死亡较多。

2）转染。

转染时必须配总体系再依次分成小体系。

这一步决定着每个孔的平行性和实验的可重复性。

转染核酸用量为每孔：

luc-3’UTR200ng；TK50ng；miRNA-pcDNA3.11ug或合成的miRNA2.5ul（终浓度100nM）。

Vig每孔用量为1ul，lip2000为2ul。

转染后4-6h换液。

如果用vig转染必须及时换液，否则细胞会尸横遍野。

注意设立合理的对照，通常用pcDNA3.1（或miRNANC）代替miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做miRNA的对照。

3）

收细胞。

转染24-48h可以收取细胞。

用生理盐水或PBS清洗细胞两次，因293细胞极易脱落，建议操作温柔，如果对自己的操作没有自信，可以增大生理盐水量只洗一次。

之后吸干生理盐水。

每孔加入80ul1Xpassivebuffer（裂解液的量可视细胞数目稍作调整），室温摇20min，如果细胞裂解充分会看到白色粘稠状细胞碎片。

如果不马上测，可连同24孔板冻于-80度，测时再取出解冻。

-20度可保存一周。

4度可保存一天。

4）测定荧光素酶活性。

使用中心实验室108室turner仪器进行双荧光素酶的测量。

具体仪器操作方法可学习相关教程或请教师兄师姐。

我们使用的试剂盒为promega的双荧光素酶报告系统：

bufferII为萤火虫荧光素酶的底物，测量数值为我们的报告基因的活性；S&Gbuffer作用是淬灭萤火虫荧光素酶的活性并提供海肾荧光素酶反应的缓冲环境，测定的数值为内参的活性。

测定时，取细胞裂解液8ul到96孔板中（专用的96孔板）上机测量。

每种底物每孔加30ul。

3、结果分析

测定荧光素酶后会返回三个值：

萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性及两者的比值。

比值将作为最后的分析数据，反映了该孔报告基因的相对活性。

通常将对照归一为1，实验组与其相比取相对值。

此相对值用于最后作图和统计分析。

归一方法和作图请自学EXCEL或请教其他同学。

GFP报告基因实验

1、GFP报告基因质粒构建：

与荧光素酶报告基因质粒构建方法同。

仅仅是用GFP取代luciferase。

2、实验方法及结果分析

1）转染。

一般使用12孔板进行实验，每孔转染量：

GFP-3’UTR，200ng-500ng；miRNA，1ug质粒或100nM合成的miRNA。

2）转染48h后，用荧光显微镜照相，观察绿色荧光的强度；收取细胞，用GFP抗体检测GFP表达水平。

建议做三个平行孔，结果需要进行统计学分析以判断差异是否显著。

二、转录因子调控分析

1、启动子的预测、确认

启动子是指RNA聚合酶识别并结合的DNA序列，并包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。

启动子位于转录起始位点附近，而真核基因的转录起始位点通常需要实验进行确定。

5’RACE是确定基因转录起始位点的经典方法。

在不知道转录起始位点时，我们也可以对启动子进行预测。

预测基因启动子的软件有：

NCBIpromoterscan（）等。

2、转录因子的预测

通常我们比较关心哪些转录因子可以调控我们感兴趣的基因，这就涉及到该基因的转录因子的预测和鉴定。

转录因子的预测软件有：

SignalScan

TFsearch等。

将待预测的上游调控序列输入进行分析，即可知道该序列中含有哪些转录因子的结合位点。

（说明：

这两个软件提供的预测结果不够全，有一些转录因子没有被包括其中。

）

3、报告基因质粒的构建

我们经常使用的质粒载体为PGL-Basic，质粒图谱见下图。

我们要将待分析的启动子序列插入到luciferase基因上游。

推荐使用kpnI，XhoI，BglII和HindIII这几个酶切位点，但不建议用XhoI和BglII双酶切，因为这两个酶切位点有重合。

该载体测序用RVP3（正向）和GLP2（反向）。

4、实验方法及结果分析

常见的启动子（转录因子）活性分析实验：

1）连续截短确定核心启动子。

克隆基因的上游调控序列，做连续的截短，如构建-2000~-1500，-1500~-1000，-1000~-500，-500~0，0~500一系列克隆，转入细胞，观察荧光素酶活性，以此判断哪一段序列对于该基因的转录活性起关键作用。

例如：

-2000~-1500和-1500~-1000有很高的活性，而-1000~-500活性很弱，则可判断核心启动子区在-1500~-1000。

2）特定转录因子对转录活性的分析。

我们构建包含该转录因子的启动子序列（上游调控序列）的报告基因质粒，与转录因子的过表达载体（或RNAi）共转染细胞，观察转染前后报告基因活性的变化。

如果转染后报告基因活性发生明显改变，则可判断该转录因子可能调控目的基因的转录。