蛋白类药物生产.docx

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蛋白类药物生产

蛋白类药物生产工艺

蛋白质类药物就是生化药物中非常活跃得一个领域,目前得生化产品主要就是从动物脏器或组织包括人得血液中分离而得。

20世纪70年代后,人们开始应用基因工程技术生产一些蛋白质药物,已实现工业化生产得产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、TNF等,现正从微生物与动物细胞得表达转向基因动植物发展。

第一节主要蛋白质类药物得制备

蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等,其作用方式包括对机体各系统与细胞生长得调节、被动免疫、替代疗法等。

一、蛋白质激素类

蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、促性腺激素与其她蛋白质激素。

其中垂体蛋白质激素包括生长素（GH）、催乳激素（PRL）、促甲状腺素（TSH）、促卵泡激素（FSH）等。

促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素（HCG）、血清促性腺激素（SGH）等。

其她蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。

（一）生长素（growthhormone,GH）

生长素就是动物脑垂体前叶外侧得特异分泌细胞分泌得一种促进生长得蛋白质激素,具有调节生长与发育得功能,对多种人类疾病有很好得疗效。

人生长素（humangrowthhormone,hGH）由一条191个氨基酸得多肽构成得一链多肽得球形蛋白质,分子中含两条二硫键,分子量为21700,等电点4、9,沉降系数S20,W2、179,其活性不需要整个分子结构,N端1～134氨基酸为活性所必需,C端得肽链起到保护作用,其化学结构与催乳素近似,故生长素有弱催乳素作用,而催乳素有弱生长素作用。

生长素包含大小两个环,以亲水球蛋白得形式存在。

不同种类动物得生长素,其化学结构与免疫性质等都有较大差别。

生长素得生产工艺有传统得方法与基因工程技术方法。

1.生长素得传统生产方法

传统方法就是从脑垂体前叶分离纯化,其生产工艺见图11-1所示。

传统得工艺过程如下:

材料获取处死动物,立即解剖,取出脑垂体,冰上速冻,-20℃冷冻保存。

预处理脑垂体使用前,用蒸馏水冲洗数次,解冻,剥离前后叶。

匀浆取动物垂体前叶,分割成小块,加水,用硫酸铵调pH至5、5,置组织捣碎机中匀浆。

提取对匀浆以水抽提,10000rpm离心30min;取沉淀,以pH4、0得0、1mol／L硫酸铵溶液抽提,离心（同上）,取沉淀,再用pH5、5得0、25mol／L得硫酸铵溶液抽提,离心,取上清抽提液。

沉淀调节抽提液pH7、5,加饱与硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmol／L,离心,取上清液。

再沉淀对上清液再加饱与硫酸铵溶液至1、8mol／L,离心,得沉淀。

⑦除盐将沉淀溶于少量蒸馏水中,对蒸馏水进行透析,得透析内液。

⑧等电点沉淀将所得透析内液用HCL或NaOH分别依次于pH4、0与pH4、9进行等电点沉淀以除去杂蛋白,离心、取上清液。

⑨盐析调上清液pH为4、0,加饱与硫酸铵溶液至浓度为1、25mol／L盐析,离心,得沉淀物。

⑩除盐将沉淀物溶于少量蒸馏水中,对含0、1mol／L氯化钠得Tris-HCL（pH8、5）缓冲溶液进行透析,得透析内液。

⑩凝胶过滤透析内液上SephadesG-75凝胶柱,用含0、1mol／L氯化钠得50mmol／LTris-HCL（pH8、5）缓冲溶液进行洗脱,分步收集,活性GH存在于第Ⅱ峰中。

⑩透析将活性峰部分对6、5mmol／L得硼砂-盐酸（pH8、7）缓冲溶液进行透析,得透析内液。

⑩层析将透析内液上DEAE-C（DE-52）柱,用含0～0、3mol／L氯化钠得6、5mmol／L硼砂-盐酸（pH8、0）缓冲溶液进行梯度洗脱,合并活性峰,脱盐,冻干得GH。

2.人生长素得基因工程法

hGH得种属特异性很强,动物生长激素不能用于人,所以开始时hGH得惟一来源就是从人尸体得脑垂体中取得,来源困难,价格昂贵,应用受到限制。

目前已利用基因工程技术生产出hGH,美国得Genentech公司利用枯草杆菌系统表达得hGH产量高达1.5g/L,这也就是第一代重组人生长激素,商品名称为Protropin、

生产路线如图11-2所示。

（1）工艺过程如下:

工程菌得构建　利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株,在生长激素得N-端增加分泌信号肽序列,使表达合成得重组人生长激素结构与天然人生长激素完全一致。

菌种繁殖　采用M9培养基,添加CAA（酪蛋白氨基酸）,调节pH至7.0,置于摇床上,30℃,进行菌种培养繁殖。

发酵培养基同菌种繁殖培养基,种子培养过夜,开始进行发酵,时间一般为16~18h,温度为37℃,pH7、0~7、5,溶解氧不能低于20%。

补料发酵在发酵进行5~7h后,需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐与微量无素,如PO43-、Fe2-、Co2-等离子,通过添加补料,可使菌体生长得对数期延,发酵菌体产量增加了一倍。

其余得发酵条件与上述条件相同,菌体生长至稳定期放罐。

。

离心　将发酵菌体进行冻融破碎,按一定比例,加入预冷得由10mmol/LTris与1mmol/LEDTA组成得缓冲溶液（pH7、5）,80rpm搅拌1h,离心,收集上清液。

粗提在上清液中加入硫酸铵至饱与浓度45%,4℃放置2h,10000rpm离心30min,收集沉淀。

脱盐　沉淀用10mmol/LTris与1mmol/LEDTA组成得pH值为8、0得缓冲溶液溶解,用Sephadex-G25脱盐。

纯化　采用Phenyl-Sepharose,DEAE-Sepharose进行色谱,再加入固体硫酸铵达到饱与浓度45%,沉淀2h,离心,收集沉淀,溶解沉淀,再通过sephacrylS-11HR及DEAE-Sepharose进行纯化,得到人生长激素原料药半成品、。

（2）质量检验:

质量必须符合<中华人民共与国药典>2005年版二部附录规定。

目前,人与动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功,重组人生长激素将会得到大规模得生产,从而造福人类。

（二）胰岛素（insulin）

胰岛素就是胰脏中胰岛β细胞分泌得一种蛋白质激素,它就是促进合成代谢得激素,在调节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用,就是维持血糖在正常水平得主要激素之一。

广泛存在于人与动物得胰脏中,正常人得胰脏约含有200万个胰岛,占胰脏总质量得1、5％。

胰岛由α、β与δ三种细胞组成,其中α细胞制造胰高血糖素与胰抗脂肝素,β细胞制造胰岛素,δ细胞制造生长激素抑制因子。

胰岛素在β细胞中开始时就是以活性很弱得前体胰岛素原存在,进而分解为胰岛素进入血液循环,能使血糖降低,起到调节血糖作用。

临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷与酮症酸中毒、精神分裂症、休克等。

胰岛素由A、B两条链组成,A链含21个氨基酸残基,B链含30个氨基酸残基,两链之间由两个二硫键相连,在A链内部含有一个二硫键。

不同种属动物得胰岛素分子结构大致相同,主要差别在A链二硫桥中间得第8位、9位与10位上得三个氨基酸及B链C末端得一个氨基酸上,随种属而异,但其生理功能就是相同得。

生产胰岛素得方法较多,有传统得方法与基因工程技术方法。

1.动物胰脏制胰岛素

由动物胰脏生产胰岛素得方法较多,目前被普遍采用得就是酸醇法与锌沉淀法。

现以酸醇法为例,介绍胰岛素得生产工艺。

其工艺路线如图11-3所示。

（1）工艺过程如下:

提取冻胰块用刨胰机刨碎,加入2、3～2、6倍得86％～88％乙醇（质量分数）与5％草酸,在12±2℃搅拌提取3h,离心。

滤渣再用1倍量68％～70％乙醇与0、4％草酸提取2h,离心,合并乙醇提取液。

沉淀用于回收胰岛素。

碱化、酸化边搅拌提取液边加入浓氨水调pH8、0～8、4（12±2℃）,立即过滤,除去碱性蛋白,滤液应澄清,并及时用硫酸酸化至pH3、6～3、8,降温至5℃,静置4h以上,使酸性蛋白充分沉淀。

减压浓缩吸取上清液至减压浓缩锅内,下层用帆布过滤,沉淀物弃去,取上清液,30℃以下减压蒸去乙醇,浓缩至浓缩液相对密度为1、04～1、06（约为原体积得1／10～1／9为止）。

去脂、盐析浓缩液转入去脂锅内,5min内加热至50℃后,立即用冰盐水降温至5℃,静置3～4h,分离下层清液（脂层用于回收胰岛素）。

用盐酸调pH2、3～2、5,于22±2℃搅拌加入27％（质量体积分数）固体氯化钠,保温静置数小时。

析出物即为胰岛素粗品。

精制盐析物按干重计算,加入7倍量蒸馏水溶解,再加入3倍量得冷丙酮,用4mol／L氨水调pH4、2～4、3,然后补加丙酮,使溶液中水与丙酮得比例为7∶3。

充分搅拌后,低温5℃以下放置过夜,次日在低温下离心分离,取上清夜,在上清夜中加入4mol／L氨水使pH6、2～6、4,加入3、6％（体积分数）得醋酸锌溶液（浓度为20％）,再用4mol／L氨水调节pH6、0,低温放置过夜,次日过滤,分离沉淀。

结晶将沉淀用冷丙酮洗涤,得干品,再按干品质量每克加冷2％柠檬酸50mL、6、5％醋酸锌溶液2mL、丙酮16mL,并用冰水稀释至100mL,使其充分溶解,5℃以下,用4mol／L氨水调pH8、0,迅速过滤。

滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH6、0,补加丙酮,使整个溶液体系保持丙酮含量为16％。

慢速搅拌3～5h使结晶析出。

在显微镜下观察,外形为正方形或扁斜形六面体结晶,再转入5℃左右低温室放置3～4d,使结晶完全。

离心收集结晶,并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀,用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤,再用丙酮、乙醚脱水,离心后,在五氧化二磷真空干燥箱中干燥,即得结晶胰岛素。

（2）质量检验测定胰岛素效价,各国药典规定有家兔血糖降低法与小鼠血糖降低法。

（3）在整个生产过程中,为提高胰岛素得质量与产量,应注意以下几个方面:

胰脏质量就是胰岛素生产中得关键,在我国就是一个薄弱环节。

工业生产用得原料主要就是猪、牛得胰脏。

不同种类与年龄得动物,其胰脏中胰岛素量有所差别,牛胰含量一般高于猪胰。

采摘胰脏要注意保持腺体组织得完整,避免摘断,并且离体后要立即深冻,先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用,如用液氮速冻,效果更好。

在胰脏中,胰尾部分胰岛素含量较高,如单独使用可提高收率10％。

浓缩浓缩工序得条件,对胰岛素收率影响很大。

如采用离心薄膜蒸发器,在第一次浓缩后,浓缩液用有机溶剂去脂,再进行第二次浓缩,被浓缩溶液受热时间极短,避免了胰岛素效价得损失。

产品纯度在常规得结晶胰岛素中,除了胰岛素主成分外,还含有其她一些杂蛋白抗原成份,如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。

因此要对结晶胰岛素进一步纯化,胰岛素原得含量显著降低。

2.人胰岛素得制备

（1）酶促半合成法

猪与人得胰岛素差别仅就是B30位上得一个氨基酸,猪得就是丙氨酸,人得则就是苏氨酸。

利用胰蛋白酶得转酰胺作用,将猪胰岛素转化为人胰岛素B30苏氨酸（丁酰基）丁酸,通过硅胶柱层析,然后用三氟乙酸处理,断裂保护基团,再用离子交换层析纯化,得到高纯度人胰岛素。

（2）利用基因工程技术制备

目前,国际上生产医用重组人胰岛素（rebinanthumaninsulin,rhI）得方法主要有3种:

1）用基因工程大肠杆菌（Escherichiacoli,E、coli）分别发酵生产人胰岛素（humaninsulin,hI）得A、B链。

然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。

这一方法缺点较多,目前已较少使用。

2）用基因工程E、coli发酵生产人胰岛素原（humanproinsulin,hPI）,后经加工形成hI。

这种方法,E、coli系统表达量高,但缺点就是不利于表达hI这样得小蛋白,产物易降解,故常采用融与蛋白形式将hPI连接在一个较大得蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂得后加工才能形成有活性得hI。

3）通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hI。

酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点就是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少（1～50mg/L）,产量低。

工艺生产过程见图11-4。

菌种

RRhPI/pQE-40E、coliM15菌株

培养基

培养基组成为:

5g/L胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5g/L硫酸铵,2.5g/L葡萄糖,2.7g/L甘油,100mg/L氨苄青霉素,50mg/L卡那霉素,pH7、2。

一次发酵

将10ml经过活化得RRhPI/pQE-40E、coliM15转移至100ml培养基中进行培养,活化菌种。

发酵罐培养

将一次发酵液转移至含有1.5L培养基得发酵罐中进行发酵罐培养（转速为300r/min,通气量为1∶1、5～1∶1、8）,一段时间后加入一定量新鲜得培养基并用NaOH调节pH。

在对数生长中期加入0、5mmol/LIPTG并升温诱导RRhPI表达4h,转速随即调为400～500r/min,增大通气量至1∶1、8～1∶2、0,继续培养一段时间后,收集菌体。

包涵体得收集与洗涤

将收集得湿菌体冻存于-20℃,然后悬浮于缓冲液A（50mmol/LTris-HCl,0、5mmol/LEDTA,50mmol/LNaCl,5%甘油,0、1～0、5mmol/LDTT,pH7、9）（5～6ml/g湿菌）中,加入溶菌酶（5mg/g湿菌体）,室温或37℃振荡2h。

冰浴超声10s×30次,其间每次间隔20s,功率为200W。

10℃条件下1000g离心5min去除细胞碎片。

上清液中得包涵体（Inclusionbody,IB）在4℃条件下27000g离心15min收集,然后用含2mol/L尿素得缓冲液A充分悬浮,室温静置30min后4℃条件下17000g离心15min,收集沉淀。

沉淀再用含2%脱氧胆酸钠得缓冲液A充分悬浮,4℃条件下17000g离心15min,收集沉淀。

最后沉淀用10mmol/LTris-HCl,pH7、3洗涤两次（4℃,17000g离心15min）。

RRhPI得初步纯化

将收集得IB用含有0、1%～0、3%β-巯基乙醇得缓冲液B（30mmol/LTris-HCl,8mol/L尿素,pH8、0）溶解,上于已用缓冲液B平衡得DEAE-SepharoseFF柱,用合适得氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI得洗脱液。

RRhPI得重组复性

将初步纯化后得RRhPI通过SephadexG-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH得50mmol/LGly-NaOH重组液,或含有适量GSSG得Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0、1～0、6mg/ml,收集趋于正确折叠得RRhPI单体组分,加入适量GSH与GSSG,4℃放置24h。

酶切转化

向RRhPI复性液中加入一定量得胰蛋白酶与羧肽酶,37℃酶切一段时间,然后用0、1mol/LZnCl2终止反应并沉淀生成得hI。

hI得纯化

将0.6gIB分别用含0、1%,0、2%,0、3%β-巯基乙醇得30mmol/LTris-HCl,8mol/L尿素,pH8、0溶解,进行DEAE-SepharoseFF离子交换层析,然后将收集得到得RRhPI组分通过SephadexG-25脱尿素以使RRhPI复性。

二、蛋白质类细胞生长调节因子

蛋白质类细胞生长调节因子包括干扰素（IF）α、β,γ、白细胞介素1-18（IL）,神经生长因子（NGF）、肝细胞生长因子（HGF）,血小板衍生得生长因子（PDGF）,肿瘤坏死因子（TNF）,集落刺激因子（CSF）,组织纤溶酶原激活因子（t-PA）,促红细胞生成素（EPO）,骨发生蛋白（BMP）等。

（一）干扰素（Interferon,IFN）

干扰素指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生得一类高活性、多功能得诱生蛋白质。

这类诱生蛋白质从细胞中产生与释放之后,作用于相应得其它同种生物细胞,并使其获得抗病毒与抗肿瘤等多方面得“免疫力”,具有广泛得抗病毒、抗肿瘤与免疫调节活性得作用,就是人体防御系统得重要组成。

人干扰素根据其来源细胞不同,分为白细胞干扰素（IFN-α）、类淋巴细胞干扰素（IFN-α与IFN-β得混合物）、成纤维细胞干扰素（IFN-β）、T细胞干扰素（IFN-γ）等几类。

按其抗原性得不同,分为α型、β型与γ型三种,同一型别,根据氨基酸序列得差异,又分为许多亚型,如常用得IFN-α包括IFN-αⅡa、IFN-αIb与IFN-αⅡb等亚型。

干扰素具有沉降率低,不能透析,可被胃蛋白酶、胰蛋白酶与木瓜蛋白酶破坏,不被DNase与RNase水解破坏等特性。

干扰素得生产方法有传统得体外诱生法与基因工程法。

1.传统得体外诱生法

传统得方法就是通过体外诱生得方法获得干扰素。

干扰素具有高度得种属特异性,临床使用得干扰素都用人得细胞制备,α-干扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备;β-干扰素用人成纤维细胞制备。

目前我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素得方法,达到106U／mg蛋白得水平。

其工艺路线见图11-5。

（1）工艺过程如下:

分离灰黄层取新鲜血液400mL/份,加入ACD抗凝剂,离心,分离出血浆,小心抽取灰黄层。

每份血可抽取13～15mL,放置4℃冰箱中过夜。

氯化铵处理每份灰黄层加入30mL缓冲盐水,再加入9倍体积量得0、83％冷氯化铵,混匀,4℃放置10min,4℃离心（8000r/min）20min。

弃上清液,加入适量缓冲盐水,收集沉淀细胞,制备悬浮液,重复上次处理,溶解残存得红细胞。

取沉淀得白细胞悬于培养液中,冰浴保存,取样作活细胞计数。

启动诱生于白细胞悬浮液加入白细胞干扰素,使其浓度为100μg／mL,37℃水浴搅拌培养2h。

正式诱生启动后得白细胞加入仙台病毒（在10天龄鸡胚中培养48～72h,收获尿囊液）使其最后浓度为100～150血凝单位／mL,在37℃搅拌培养过夜。

仙台病毒诱导人白细胞产生。

收集将培养物离心（2500r/min）30min,吸取上清液即得粗制干扰素。

纯化在粗制干扰素中加入硫氰化钾到0、5mol／L,用盐酸调pH为3、5,离心,得沉淀l。

沉淀1加入原体积1／5量得冷乙醇（94％）,离心,得上清液1。

上清液1用盐酸调节pH5、5,离心弃去沉淀,再调至pH5、8,离心,得上清液2与沉淀2。

沉淀2加入原体积1／50量得甘氨酸-盐酸缓冲液（pH2）溶解,得IFNl。

上清液2用NaOH调节pH值至8、0,离心,弃上清液,得沉淀3。

沉淀3加原体积1／50量得0、lmol／LPBS与0、5mol／L硫氰化钾（pH8）溶解,pH值降至5、2,离心,得上清液3与沉淀4。

沉淀4加原体积1／25000量pH为8、0得0、1mol／LPBS溶解,调至pH为7～7、5,对PBS（pH7、3）透析,过夜,离心,收集上清液,检测,得IFN-β。

调节上清液3pH值为3、0,离心,得沉淀5。

沉淀5加入原体积1／5000量得pH8、0,0、1mol／LPBS,加NaOH调节pH7～7、5,对PBS（pH7、3）透析过夜,离心,收集上清液,检测,得IFN-α。

（2）质量检验我国用微量板染色得病变抑制法测定。

国际上规定,能保护50%细胞免受病毒攻击得浓度即为一个IFN活性单位。

该法特点就是一次纯化量大,回收率高于60％;经济,简便,易于普及,效价可达1、2×108U／mL,比活2、2×106U／mg（蛋白）。

IFN-α中干扰素含量占回收干扰素得82％,比活也比较高。

2.基因工程法

随着生物技术得发展,运用基因工程技术,已能在人体外大规模地生产人干扰素即基因工程干扰素。

目前,编码干扰素得基因已能在大肠杆菌、酵母菌与哺乳动物细胞中得到表达。

α、β、γ三型基因工程干扰素都已研制成功,并投放市场,用于治疗得病种达20多种。

我国卫生部已批准生产得干扰素品种有IFN-αlb、IFN-αⅡa、IFN-αⅡb与IFN-r四种。

目前,人们在利用蛋白质工程技术研制活性更高,更适于临床应用得干扰素类似物与干扰素杂合体等各种新型干扰素。

生产技术路线如图11-6所示。

基因工程菌得构建

首先从产生干扰素得白细胞中提取干扰素mRNA,对其进行分级分离。

通过蟾蜍卵母细胞找出活性最高得mRNA,并用此mRNA合成cDNA。

将cDNA与含四环素与氨苄抗性基因得质粒pBR322重组,转化大肠杆菌K12,得到重组子质粒。

对每个重组子用粗提得干扰素mRNA进行杂交,把得到得杂交阳性克隆中得重组质粒DNA放到无细胞合成系统中进行翻译。

对翻译体系得产物进行干扰素活性检测。

再将干扰素得cDNA转入大肠杆菌表达载体中,转化大肠杆菌在特定条件下进行高效表达。

其生产流程如图11-7所示。

工程菌得发酵

a、种子制备将构建得基因工程菌传代后于-70℃下甘油管中保存。

如构建得人干扰素-αⅡb基因工程菌SW-IFN-aⅡb／E、coli-DHSa。

质粒用PL启动子,含氨苄西林抗性基因。

使用时进行活化。

b、种子罐培养将菌种按1％种量接种到种子培养基,种子培养基得配方:

1％蛋白胨、0、5％酵母提取物、0、5％NaCl;30℃摇床培养10h,作为发酵罐种子使用。

c、发酵罐培养发酵培养基得配方:

1％蛋白胨、0、5％酵母提取物、0、01％NH4Cl、0、05％NaCl、0、6％Na2HP04、0、001％CaCl2、0、3％KH2P04、0、01％MgS04、0、4％葡萄糖、50mg／mL氨苄西林、少量防泡剂。

用15L发酵罐进行发酵,发酵培养基得装量为10L,pH6、8,搅拌500r/min,通风比为1:

1／（m3·min）,溶氧为50％。

30℃发酵8h,然后在42℃诱导2～3h完成发酵。

同时每隔不同时间取2mL发酵液,在10000r/min离心除去上清液,称量菌体湿重。

在整个发酵过程中,要注意:

（1）不同发酵阶段培养基得成分有差异;

（2）培养液中要有足够得溶解氧,不同得培养阶段需要得溶解氧量也不同,通常通过增大搅拌速度,增加空气流量或者通入纯氧来满足条件;（3）发酵过程中在不同得阶段应控制不同得pH,发酵后期要降低pH,减少干扰素得水解;（4）要控制适当得温度,既要保证菌体细胞膜得完整与细胞中酶得活性,又要有利于提高干扰素得产量。

产物得提取与纯化

a、提取发酵结束后,冷却,离心（4000r/min）,30min,收集沉淀,得湿菌体。

取湿菌体悬浮于20mmol／L得磷酸缓冲液（pH7、0）中,冰浴中进行超声破碎,释放干扰素蛋白。

4000r/min离心30min,得沉淀,用含8mol／L尿素、20mmol磷酸缓冲液（pH7、0）、0、5mmol／L二巯基苏糖醇溶液,室温搅拌抽提2h,然后15000r/min离心30min。

取上清液,用20mmol／L磷酸缓冲液（pH7、0）稀释至尿素浓度为0、5mol／L,加二巯基苏糖醇至0、1mmol／L,4℃搅拌15h,15000r/min离心30min,除去不溶物。

上清液经截流量为104相对分子质量得中空纤维超滤器浓缩,将浓缩得人干扰素αⅡb溶液经过SephadexG-50分离,层析柱（2cm×l00cm）先用20mmol／L磷酸缓冲液（pH7、0）平衡,上柱后用同一缓冲液洗脱分离,收集