动物兽医微生物实验教学实践报告.docx

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动物兽医微生物实验教学实践报告

四川农业大学

动物微生物学及免疫学教学实践实验报告

大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的猪病料病原菌的

分离与鉴定

专　　业：

动物医学

班级:

组别：

第一组

指导教师：

二○一○年六月

目录索引

一培育基的制备............................................................4

二病料接种、培育及细菌抹片的制备和G染色...................................5

三细菌的纯培育、移植和细菌抹片的制备及G染色...............................6

四TSI培育基培育及生化鉴定................................................7

五实验结果...............................................................10

六讨论及结论.............................................................11

一培育基的制备

﹝目的要求﹞

把握一样培育基的制备原那么和要求；熟悉一样培育基的制备进程；把握培育基酸碱度的测定。

﹝实验材料﹞

（1）器皿：

量筒（100ml两个）、烧杯（100ml和1000ml各一个）、漏斗（两个）、三角烧瓶（100ml两个）、试管（七支）、玻璃棒（两根）、玻璃平皿、刻度吸管（1ml和10ml各两个）、PH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、扎绳、包装纸、洗耳球、酒精灯。

（2）试剂：

牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钾，琼脂条或粉，0.1mol/L和1mol/L的氢氧化钠、0.1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、麦康凯琼脂粉、三塘铁琼脂粉。

﹝方式内容﹞

（1）按下表计量称取各类试剂（先称取盐类再称取蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。

牛肉膏

蛋白胨

氯化钠

琼脂粉

蒸馏水

1.0g

2.0g

1.0g

4.0g

200ml

（2）一般琼脂：

原料称量（按配方）—→溶解—→调剂PH—→塞棉塞和包扎—→灭菌

麦康凯琼脂：

原料称量（按配方）—→溶解—→装入盐水瓶—→塞棉塞和包扎—→灭菌

三塘铁琼脂：

原料称量（按配方）—→溶解—→分装入试管—→塞棉塞和包扎—→灭菌

（3）培育基的分装：

用玻璃漏斗、橡皮管、小玻璃管及弹簧夹制作分装装置—→选用15×150平面试管或300ml锥形瓶—→分装（每管约10ml）

（4）棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎别离制作试管和锥形瓶的棉塞并塞好，再用干洁的报纸将其头部包扎好。

（5）培育基的灭菌将培育基置于高压蒸汽锅内，121℃灭菌15至30min。

（6）TSI斜面、普琼和麦康凯琼脂平板的制作

TSI斜面：

灭菌后趁热将管口一端搁在玻棒上，使之有必然坡度，凝固后即形成斜面。

普琼和麦康凯琼脂平板的制作：

一般琼脂和麦康凯琼脂以手掌感触，假设将琼脂瓶紧握手中感觉烫手，但仍能握持时，即为倾倒平皿的适合温度。

每只灭菌培育皿倒10到15ml将皿盖盖上，将培育皿与桌面上轻轻回转，使培育基平铺于皿底，即形成一般琼脂平板和麦康凯琼脂平板。

﹝结果分析﹞以斜面接种培育验证培育基配置成效；以平板制作及接种24h培育验证24h；

二病料接种、培育及细菌抹片的制备和G染色

﹝目的要求﹞把握细菌分离培育的大体要领和方式；把握厌氧菌培育的原理及方式；把握细菌抹片的制备方式和G染色法；熟悉革兰氏染色的反映特性。

﹝实验材料﹞载玻片、火柴、吸水纸、生理盐水、各类染色液、菌种（病料）、剪子、记号笔、一般琼脂培育基、麦康凯琼脂培育基、接种环、酒精灯。

﹝方式内容﹞

一、器械、病料消毒（剪子、接种环、病料）—→勾取病料—→划线接种—→培育。

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度越小越好，幸免空气污染）。

（2）右手持接种环，别离从已表面消毒的病猪肺、肝、肾中挑取病料涂布于培育基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，带接种环冷却后，再与所涂材料的地址轻轻接触，开始划线。

（3）划线前先将接种环稍稍弯曲，如此易和平皿内琼脂面平行，不至划破培育基。

（4）划线中不宜过量的重复旧线，以避免形成菌苔。

（5）接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培育24h。

注：

划线接种于6个一般琼脂平板和6个麦康凯琼脂平板。

二、G染色：

涂片—→干燥—→火焰固定—→染色—→水洗—→干燥—→油镜观看

（1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸结晶紫溶液，经1~~2min水洗。

（2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1—2min，水洗。

（3）加95%的酒精与抹片上脱色，约0.5—1min，水洗。

（4）加稀释的石碳酸复红（或沙黄水溶液）复染10—30s，水洗。

（5）吸干或自然干燥，镜检。

革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

三细菌的纯培育、移植和细菌抹片的制备及G染色

﹝目的要求﹞把握细菌纯培育的大体要领和方式；把握兼性厌氧菌培育的原理及方式；把握细菌抹片的制备方式和G染色法；熟悉革兰氏染色的反映特性。

﹝实验材料﹞载玻片、火柴、吸水纸、生理盐水、各类染色液、菌种（病料）、剪子、记号笔、一般琼脂培育基、麦康凯琼脂培育基、接种环、酒精灯。

﹝方式内容﹞

一、器械、病料消毒（剪子、接种环、病料）—→勾取单菌落—→染色镜检—→划线接种—→培育。

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度越小越好，幸免空气污染）。

（2）在已培育出单菌落的麦康凯培育基上别离勾取一粉红色单菌落和一淡黄色单菌落，染色镜检，视野均为革兰氏阴性小杆菌或球菌。

（3）右手持接种环，别离勾取粉红色和淡黄色菌涂布于培育基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，带接种环冷却后，再与所涂材料的地址轻轻接触，开始划线。

别离标记、编号两个培育基为A和B。

（4）划线前先将接种环稍稍弯曲，如此易和平皿内琼脂面平行，不至划破培育基。

（5）划线中不宜过量的重复旧线，以避免形成菌苔。

（6）接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培育24h。

注：

划线接种于6个一般琼脂平板和6个麦康凯琼脂平板，整个进程无菌操作。

二、G染色：

涂片—→干燥—→火焰固定—→染色—→水洗—→干燥—→油镜观看

（1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸结晶紫溶液，经1~~2min水洗。

（2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1—2min，水洗。

（3）加95%的酒精与抹片上脱色，约0.5—1min，水洗。

（4）加稀释的石碳酸复红（或沙黄水溶液）复染10—30s，水洗。

（5）吸干或自然干燥，镜检。

革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

四TSI培育基培育及生化鉴定

﹝目的要求﹞熟悉把握斜面接种的方式；了解大肠杆菌和沙门氏菌在三塘铁培育基上的培育特性；把握细菌鉴定中经常使用生化实验原理和方式；了解细菌生化实验在细菌鉴定及诊断中的重要意义。

一、TSI培育基接种培育

﹝实验原理﹞

本培育基适合于肠杆菌科的鉴定。

用于观看细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。

该培育基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:

10:

1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加上细菌利用培育基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，因此仍维持黄色。

而发酵乳糖的细菌（e.coli），那么产生大量的酸，使整个培育基呈现黄色。

如培育基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培育基中的铁盐反映，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

﹝方式步骤﹞

勾取A或B菌单菌落—→染色镜检—→斜面接种—→穿刺接种

穿刺接种：

用接种针挑取菌落，垂直刺入培育基内。

要从培育基表面中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可（疑似大肠杆菌和沙门氏菌各接种一管），37℃培育24-48h观看。

结果分析：

大肠杆菌在斜面和深层均为黄色，而沙门氏菌在斜面为红色，在深层为黄色，假设产生H2S有黑色的沉淀。

二、生化实验

（1）糖发酵实验

原理：

各类细菌具有不同的酶，有的细菌能分解某些糖类而产酸产气，有的细菌虽能分解某种糖类，但只产酸不产气，，有的细菌那么不能分解。

借此特点，能够辨别细菌。

方式：

取两组糖发酵管，将糖发酵管甩至两头，标记后折断，每组将A、B菌接种于两套糖发酵管中，倒立37℃培育24h。

结果分析：

产酸产气时，可使培育基的指示剂变色，并可在发酵管内顶端显现气泡；只产酸时仅见发酵管内培育基颜色改变，不见气泡；不分解者无反映。

如大肠杆菌分解乳糖产酸产气；用“⊕”表示，金黄色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气，用“+”表示；沙门氏杆菌不能分解乳糖，用

“一”表示。

（2）VP实验

原理：

某些细菌（如产气杆菌、阴沟杆菌：

等），能分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步将丙酮酸脱羧，变成乙酰甲基甲醇。

加KOH溶液后，在碱性环境下，乙酰甲基甲醇被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与培育基内蛋白胨中精氨酸所含胍基发生反映，生成红色的化合物。

在培育基中加入少量含胍基的化合物（如叽酸或肌酐等），能够加速那个反映。

在加KOH前，先加入a-萘酚，也可提高实验的灵敏性。

方式：

取两组葡萄糖蛋白胨水，别离接种A菌和B菌培育管中，经37℃培育48h。

加入甲液、乙液各一滴，充分摇动培育管，观看结果。

结果分析：

如当即或于数分钟内显现橙红色或红色反映者为阳性。

不变色者，将培育管放37℃中4h后再进行观看，假设仍不变色或仅呈淡褐色者为阴性。

产气杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

（3）甲基红实验（MR实验）

原理：

某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸、丙酮酸再被分解，那么可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，如此使培育基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红指示剂呈红色。

甲基红指示剂变色范围pH4.4（红色）一6.2（黄色）。

假设细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），那么培育基的酸度仍在pH6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色为阴性。

方式：

将A菌和B菌别离接种在两组葡萄糖蛋白胨水中，在37C培育3～4d，加入MR试剂1～2滴，观看反映结果。

结果分析：

红色反映为阳性，无色反映为阴性。

例如，大肠杆菌和沙门氏菌为阳性，产气杆菌为阴性。

（4）H2S实验

原理：

某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸等，生成硫化氢，遇培育基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。

方式：

将A菌和B菌别离接种于两组硫化氢生化管上，37℃恒温箱中培育18-24h，观看结果。

结果分析：

培育基变黑为阳性，不产生黑色为阴性。

例如，沙门氏菌多数菌株为阳性，大肠杆菌为阴性。

（5）枸橼酸盐利用实验

原理：

枸橼酸盐培育基中的枸橼酸钠是惟一的碳源。

有的细菌（如产气杆菌等）可利用枸橼酸盐作碳源，能在此培育基上生长，并分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐而使培育基变成碱性。

此培育基中的溴麝香草酚蓝由绿色变成深蓝色，表示枸橼酸盐利用实验阳性。

假设细菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，那么细菌不生长，培育基仍维持棕色，表示枸橼酸盐利用实验阴性。

方式：

将A菌和B菌别离接种在两组枸橼酸盐生化管上，经37℃培育2—4d后，观看结果。

结果分析：

长出菌落，培育基变深蓝色为阳性；细菌不生长，培育基仍为原先的棕色为阴性。

例如，沙门氏菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

五实验结果

1、第二步和第三部菌落观看结果

第一次镜检：

视野中充满了红色短杆菌或球菌。

第二次镜检：

A菌和B菌均为粉红色短杆菌或球菌。

第一次菌落观看：

麦康凯琼脂培育基周围为粉红色中等大菌落，中间一块圆形的小菌落群。

第二次菌落观看：

A菌菌落为圆形、滑腻、湿润、低隆起、粉红色、中等大菌落。

B菌菌落为圆形、滑腻、湿润、隆起、淡黄色、小菌落。

二、三塘铁培育鉴定

A菌：

从斜面到深层均为黄色，有无色气体产生；

B菌：

斜面为黄色，深层为淡黄色，穿刺线有黑色沉淀产生。

3、生化实验结果

表1分离菌株生化实验结果

菌种项目

葡乳麦甘蔗H2SMRVP枸

大肠杆菌⊕⊕⊕⊕⊕一+一一

沙门氏菌⊕一⊕⊕一++一⊕

注：

+阳性或产酸，⊕产酸产气，一阴性，R红色，Y黄色，B黑色

4、结果分析，见第6——第9页结果分析。

六讨论与结论

一、通过第一次革兰氏染色，证明了病料中含有革兰氏阴性的短杆菌或球菌；第二次G染色那么证明了成功分离纯化了两种G阴性菌。

而A菌菌落在麦康凯上为粉红色菌落，疑似大肠杆菌；B菌菌落在麦康凯上为淡黄色菌落，疑似沙门氏菌。

二、A菌的三唐铁（TSI）培育基培育结果说明A菌能发酵乳糖和葡萄糖并产气，但不产H2S；而B菌的结果那么说明B菌能发酵葡萄糖产酸，产H2S,但不能发酵乳糖。

A菌疑似大肠杆菌，B菌疑似沙门氏菌。

3、通过G染色镜检、TSI培育基鉴定、A菌和B菌的生化鉴定结果能够得出结论：

A菌为大肠杆菌，B菌为沙门氏菌。