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郭瑶推优论文
本科毕业论文（设计）
题目：
喹啉双季铵盐与小牛胸腺DNA的作用研究
目录
摘要II
关键词II
AbstractI
Keywords错误！
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1绪论2
1.1BZQN的结构特征及生物效应2
1.2DNA的结构特征与生理作用3
1.3本课题的研究方法3
1.4本课题研究的主要内容、目的及意义4
2实验部分5
2.1实验仪器与试剂5
2.2实验内容6
3结果与讨论8
3.1BZQN对ctDNA的紫外吸收光谱的影响8
3.2荧光光谱9
3.3碱变性实验12
3.4金属离子对BZQN与DNA相互作用的影响13
3.5热变性实验14
3.6BZQN对DNA的结构影响15
3.7BZQN与DNA相互作用的焓变17
3.8分子模拟18
4结论19
参考文献20
喹啉双季铵盐与小牛胸腺DNA的作用研究
摘要：
本论文采用圆二色谱法、等温滴定量热法、分子模拟、荧光光谱法等方式研究了喹啉双季铵盐（BZQN）与小牛胸腺DNA（ctDNA）的相互作用机理及热力学。
研究结果表明，BZQN具有显著的荧光，在340nm激发，470nm发射；随着DNA浓度的增加，BZQN的荧光发生明显的猝灭，并且猝灭常数（Ksv）随着温度的升高而增大，符合动态猝灭的特征；紫外可见光谱实验、热变性实验及圆二色谱结果均表明，BZQN与DNA发生嵌插结合，从而导致DNA的二级结构发生改变；离子选择性实验表明K+使BZQN-DNA体系的荧光发生最显著的猝灭；分子模拟的结果表明，BZQN可能是以静电作用方式结合在DNA大沟附近；等温滴定量热实验表明BZQN与DNA的结合位点数约为4，推测BZQN与DNA的结合是熵驱动过程。
综合以上实验结果可以推断，BZQN与DNA能发生熵驱动的相互作用，其作用模式既有嵌插作用又有静电作用，且静电作用占主导。
关键词:
喹啉双季铵盐；小牛胸腺DNA；光谱法；等温滴定微量热；分子模拟
StudyoninteractionofquinolinebiquaternaryammoniumsaltwithcalfthymusDNA
Abstract:
Inthispaper,theinteractionandthermodynamicsofquinolinebiquaternaryammoniumsalt（BZQN）withcalfthymusdeoxyribonucleic（ctDNA）wasinvestigatedbycirculardichroism（CD）,isothermaltitrationcalorimetry（ITC）,molecularsimulationandfluorescentspectrometry.TheresultsshowedBZQNhadsignificantfluorescenceat470nmwhenitwasexcitedat340nm.ItsfluorescencewasquenchedbyctDNAandthequenchingconstant（Ksv）wasincreasedasthetemperaturerose,whichwasfittedthecharacteristicsofdynamicfluorescencequenching.TheresultsofUVspectra,thermotropyexperimentandCDspectraindicatedthatthesecondarystructureofDNAhadbeenchangedbecauseoftheintercalationeffectbetweenBZQNandDNA.TheeffectofdifferentmetalionsonBZQN-DNAshowedthatthefluorescenceofBZQN-DNAwassharplyquenchedbyK+,butothercationshadalittleinfluence.ThemolecularsimulationindicatedthatBZQNwasboundtoDNAnearthebigditchbyelectrostaticinteraction.BymeansofITC,thebindingpointbetweenBZQNandDNAwas4andthecombinationprocessofBZQNandDNAwasdrivenbyentropy.SothebindingmodeofBZQNtoDNAbothincludedtheintercalationandelectrostaticeffects,andtheelectrostaticeffectwasthedominant.
Keywords:
Quinolinebiquaternaryammoniumsalt;CalfthymusDNA;Spectroscopy;Isothermaltitrationcalorimetry;Molecularsimulation
1绪论
1.1BZQN的结构特征及生物效应
1.1.1BZQN的结构特征
喹啉是杂环芳香性有机化合物，分子式是C9H7N，微溶于水，易发生取代反应，因此可以在喹啉环的基础上通过修饰母体结构改善水溶性，连接不同的取代基实现其不同的生物功能。
基于此，本论文通过喹啉环上的苄溴取代反应合成了喹啉双季铵盐（BZQN），其结构如下图所示：
（R）-（6-methoxy-quinonine-4-yl）（（2S,4S,8R）-8-vinylquinuclidin-2-yl）methanol
1.1.2BZQN的生物效应
喹啉类化合物属于芳香杂环类化合物，多种药物及具有药理活性的天然产物中都存在喹啉结构的骨架，由于其易发生亲电取代反应，可以连接不同的基团形成不同功能的衍生物，因此喹啉类化合物在医药及分子生物学等领域都有重要的应用，尤其在抗疟疾、肿瘤、结核、HIV病毒等领域具有突出的作用，是药物研究的一个焦点。
自从20世纪30年代人类认识到喹啉类化合具有抗疟疾的作用以来，对喹啉类化合物的研究从未停止过，孙业欣等人全面综述了近十年来喹啉类化合物在抗疟方面的研究进展[1]；冷元红等人对喹啉类及其衍生物的抗疟药物的合成及推广作了简要介绍，同时阐述了其中几类药物的作用机理[2]；HoppeHC等人通过分子示踪法研究了喹啉药物氯喹和甲氟喹在恶性疟原虫的内吞作用，分析发现氯喹抑制血红蛋白消化但没有其他重要影响寄生虫的内吞作用的途径，而甲氟喹抑制内吞作用效果显著[3]；刘春亮等人通过小鼠肝癌模型及免疫学实验方法研究了吡咯喹啉醌的抗肿瘤作用，结果表明吡咯喹啉醌对靶细胞的杀伤效率很高，具有显著的抗肿瘤生长的效果，同时口服给药时能够提高机体的抗肿瘤免疫功能[4]；应苗法等人通过动物实验和临床实验均证实了贝达喹啉能够特异性的抑制结核杆菌的ATP合酶发挥作用，对耐药和非耐药的结核杆菌都有效[5]；霸明宇等人采用细胞水平模型、酶联免疫吸附法和荧光法研究了N4-芳基磺酰基喹喔啉酮类化合物抗HIV-1作用机制及特点，结果显示该化合物作用于HIV-1复制的逆转录环节，抑制了逆转录酶的RNA依赖DNA聚合酶活性，表现出优异的抗HIV-1活性[6]；李小芳等人采用摩尔电导率、光谱法和热重分析手段研究了镧-磺基水杨酸-8-羟基喹啉三元配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌活性，结果显示该三元配合物对三种真菌均有非常好的抑菌效果[7]。
1.2DNA的结构特征与生理作用
参与DNA组成的主要有四种碱基即：
腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）。
所有DNA中腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔含量相等，即A=T，鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔含量相等，即C=G。
DNA的一级结构是由数量及其庞大的四种脱氧核糖核苷酸即：
脱氧腺嘌呤核苷酸，脱氧鸟嘌呤核苷酸，脱氧胞嘧啶核苷酸，脱氧胸腺嘧啶核苷酸，通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。
DNA分子骨架是由反向平行的核苷酸链围绕同一中心相互缠绕，嘌呤和嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过3´,5´-磷酸二酯键连接。
双螺旋结构上有两条螺形凹沟，一条较深，一条较浅。
较深的沟称大沟，较浅的沟称小沟。
双螺旋的平均直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸，两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键结合在一起[8]。
DNA是生物体遗传信息存储和表达的载体，对生物体具有重要的意义[9]。
1.3本课题的研究方法
圆二色谱法：
圆二色谱主要是用于研究生物大分子的结构，通过圆二色光谱获得生物大分子如蛋白质、多糖等的二级结构信息，与分子设计与计算互相验证。
可应用于蛋白质折叠﹑蛋白质构象研究，DNA/RNA反应，糖类等光学活性物质的结构、纯度测量，药物筛选等。
研究生物大分子之间的相互作用，大分子与小分子的相互作用，测定分子相互作用后引起的生物大分子结构的变化，进而进行以生物大分子作为靶点活性物的筛选或者研究药物的作用机制。
分子模拟：
利用理论方法与计算技术模拟或仿真分子运动的微观行为，广泛的应用于计算化学，计算生物学，材料科学领域，小至单个化学分子，大至复杂生物体系或材料体系。
分子模拟不仅避免了繁琐的量子力学方程的求解，而且在保证精度的同时，大大扩展了原子的计算机模拟的使用范围。
在药物设计领域，可用于研究病毒、药物的作用机理等；在生物科学领域，可用于表征蛋白质的多级结构与性质；在药物研究方面通过分析和计算一系列活性药物分子的三维构象并将其叠合，了解某一类药物分子所应具有的药物构象，这一信息给予新药研究很大帮助，药效构象的计算为今后的药效基团方法以及数据库虚拟筛选的方法打下了基础[10-11]。
等温滴定量热法：
是研究生物热力学与动力学的重要方法，利用高自动化、高灵敏度的微量量热仪连续、准确地监测、记录一个变化过程的热力学、动力学曲线。
等温滴定量热法具有许多独特优势：
对被研究体系的限制条件少，样品用量小且无损，灵敏度和精确度高，实验时间较短，操作简单。
通过测定药物与DNA或者RNA相互作用，可以获得生物分子相互作用的完整热力学和动力学参数[12-13]。
荧光光谱法：
由于荧光光谱技术具有操作方便，灵敏度高等优点，常用于研究小分子与核酸相互作用。
对于本身具有荧光的物质，其荧光性质是研究它与DNA相互作用的关键性质。
当化合物嵌插入DNA后，由于该化合物自身振动模式受到影响，该化合物的荧光强度通常会有所改变。
因此，可以依据荧光强度的变化推测该化合物与DNA作用的程度及机理。
对于本身无荧光的化合物则可以通过溴乙锭竞争实验来研究其与DNA的相互作用[8]。
红外光谱法：
红外光谱法实质上是一种依据分子内部原子间的相对振动、分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法。
将分子吸收红外光的情况用仪器记录下来，就是红外光谱图，红外光谱图能够显示DNA分子中的主链骨架、特征振动谱带以及侧链在2000-500nm范围振动谱带等，可以依据DNA在加入化合物前后红外图谱的变化来推测该化合物与DNA的相互作用[8]。
1.4本课题研究的主要内容、目的及意义
DNA是生物的基本遗传物质，是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础，因此DNA也是很多类药物的重要靶点。
DNA与药物分子相互作用的研究对药物的设计合成、结构改造及相关的作用机制研究具有重要的意义。
喹啉类化合物是一类在医药等领域有着广泛应用的芳香杂环化合物，有关此类化合物的合成及应用近年来受到人们的广泛关注。
因此，我们在合成喹啉环的基础上通过修饰喹啉的母体结构，连接不同功能的取代基来实现其不同的生物能，本论文对新合成的喹啉双季铵盐化合物通过紫外、荧光、圆二色谱、等温滴定量热、分子模拟等方式进行结构鉴定和表征，并进一步探讨其与DNA间的相互作用。
2实验部分
2.1实验仪器与试剂
2.1.1实验仪器
本实验所用实验仪器如表1所示：
表1实验仪器
仪器
型号
产地
瞬态荧光分析仪
FLS920
英国爱丁堡仪器有限公司
双光束紫外可见分光光度计
TΜ-1901
北京普析通用仪器有限责任公司
圆二色谱仪
Chirascan
英国应用光物理公司
pH计
Sartoriμs普及型
北京赛多利斯仪器系统有限公司
等温滴定量热仪
Nano
美国TA公司
傅立叶红外光谱仪
Nicolet-380
美国尼高力公司
2.1.2实验试剂
本实验所用实验试剂如表2所示：
表2实验试剂
药品
类型
产地
ctDNA
BR
sigma公司
喹啉双季铵盐
曾林涛老师馈赠
磷酸二氢钠
AR
天津市天力化学试剂有限公司
磷酸氢二钠
AR
天津市天力化学试剂有限公司
氯化钠
AR
国药集团化学试剂有限公司
氯化钾
AR
武汉市江北化学试剂厂
2.2实验内容
2.2.1圆二色谱
DNA是光学活性物质，因此可测定它的圆二色谱，从而了解其构象。
实验所用仪器为Chirascan圆二色谱仪，光源系统用氮气保护（流量为5L/min），样品池的光径为0.5mm。
测量参数：
扫描速率100nm•min-1，分辨率0.1nm，响应时间1s，累积次数3次。
扫描波段为200～320nm，DNA的浓度为0.3g/L。
实验时在样品池中放置90μL2.17×10-5mol/L的DNA溶液，加入9μL1.13×10-3mol/LBZQN溶液，测溶液的CD谱。
2.2.2分子模拟
本实验采用SYBYL8.1软件，SYBYL是美国Tripos公司为从事药物及相关领域研究的用户提供的全面的药物设计工具，是目前药物设计方面的权威工具软件。
在SYBYL-X软件包中有着当今最先进、最现代的同源建模技术与工作流，同源蛋白识别、从序列预测结构与功能、配体结合位点分析以及3D建模技术等，用来解决诸如生物大分子建模以及生物信息学分析之类的结构生物学设计任务。
不论是进行配体-受体的相互作用的理论计算，还是依据生物大分子的结构设计新配体，都是把配体对接到受体的结合部位去，形成配体-受体复合物，这个过程即为分子对接[11]。
在进行分子对接时，首先是以已知配体5-乙氧羰基-6-甲基-4-4-甲氧基苄基-3,4-二氢嘧啶-2（1H）-酮（EMMD）与受体ctDNA的晶体结构为基础，计算受体ctDNA结合部位的表面性质；然后删去原来的配体EMMD，计算用于分子对接的新配体BZQN的各表面性质，然后依据互补匹配原则，将配体BZQN对接到受体ctDNA的结合部位上去。
2.2.3等温滴定微量热
BZQN与DNA作用的热力学焓变由美国TA公司的NanoITC3G采用连续注射的方法完成，用仪器自带NanoITCAnalyze软件进行数据采集和处理。
具体实验过程为：
将250µL1.13×10-4mol/L的BZQN溶液装入250µL滴定针，设定总的滴定次数为25次，每次滴10µL于1.00mL2.17×10-5mol/LDNA溶液中；连续滴定时间间隔为300s，每次滴定持续时间为2s。
2次滴定实验的时间间隔大约45min，使信号有足够的时间返回基线。
测量池的温度控制为25oC，安培瓶中搅拌器的转速固定在350r/min，等基线稳定后再启动实验，以便使因搅拌而产生的热量被自动扣除。
为扣除BZQN和DNA的稀释热，要进行空白实验。
2.2.4紫外光谱实验
小牛胸腺DNA用PBS稀释，采用文献所述方法[14]，将0.01g/LctDNA在紫外吸收光谱260nm处，根据文献中摩尔吸收系数ε260＝6600L·mol-1·cm-1，可以确定其浓度为2.2×10-5mol/L，溶液保存于4°C的冰箱中备用。
取2mL2.17×10-5mol/LctDNA溶液于比色皿中，相应的试剂PBS做参比，测试溶液紫外吸收强度做空白对照，加入5μL7.5×10-1g/LBZQN溶液，测试溶液紫外吸收强度，重复10次。
在25oC时，测试2mL2.44×10-5mol/LctDNA溶液紫外吸收强度。
将恒温槽升温至35oC（35-95oC间、每隔5oC的温度，总共12组温度），重复测试溶液紫外吸收强度。
然后在2mL2.44×10-5mol/LctDNA溶液中加入2μL5.63×10-4mol/LBZQN溶液混合，重复上述过程。
2.2.5荧光光谱实验
取2mL2.25×10-5mol/LBZQN溶液于比色皿中，测试溶液的荧光强度做空白对照，加入5μL1.08×10-3mol/LctDNA溶液，测试溶液的稳态荧光强度，重复10次。
在初始激发波长为490nm，350-470nm之间记录发射光谱，间距为10nm的条件下，分别扫描BZQN和BZQN-ctDNA体系的三维荧光光谱，其中BZQN的浓度为2.63×10-5mol/L，BZQN-ctDNA体系ctDNA的浓度为1.52×10-6mol/L。
在控制25oC恒温，取2mL2.25×10-5mol/LBZQN溶液于比色皿中，测试溶液的荧光强度做空白对照，加入5μL1.08×10-3mol/LctDNA溶液，测试溶液荧光强度，重复10次。
再分别控制31oC、37oC恒温，重复上述实验。
本实验中的数据分析均遵循Sterm–Volmer方程[15]，其中静态猝灭公式为：
动态猝灭公式为：
。
取2mL1.08×10-4mol/LctDNA溶液，加入10μL5.63×10-4mol/LBZQN溶液，测得体系荧光光谱。
加入4μL1mol/L的K+，测溶液的荧光强度，重复5次。
再将K+溶液分别换为Fe3+和Na+，重复上述实验，测试体系荧光光谱。
取40μL5.42×10-3mol/L的ctDNA溶液和10μL5.63×10-4mol/L的BZQN溶液分别用pH=8，9，10，11，12，13的Britton-Robison缓冲溶液配成2mL的溶液，固定最佳激发波长（340nm）和最佳发射波长（490nm）测不同pH值下的溶液的荧光强度。
2.2.6红外光谱实验
采用液膜法，在压好的溴化钾片上，分别滴加DNA，DNA-BZQN体系的溶液，检测个体系的红外光谱。
3结果与讨论
3.1BZQN对ctDNA的紫外吸收光谱的影响
图1BZQN对ctDNA紫外吸收强度的影响
图1是不同浓度的BZQN在ctDNA溶液中的紫外吸收光谱，其中曲线F是2.75×10-2mmol/LBZQN。
溶液在325nm左右有最大吸光度，紫外吸收光谱发生增色效应，溶液的紫外吸收随BZQN浓度的增大而增强，说明BZQN与ctDNA之间发生了较强的相互作用。
增色效应与减色效应是DNA所特有的，与其双螺旋结构密切相关的光谱性质，若药物嵌入到ctDNA的碱基对中，则会改变构成碱基堆积力的疏水作用力和范德华力，从而使DNA的构象和结构的稳定性产生改变，表现为显著的增色效应[16]。
因此可以推断BZQN与ctDNA之间可能是嵌插作用。
3.2荧光光谱
3.2.1稳态荧光
图2BZQN滴定ctDNA的荧光光谱
图3ctDNA滴定BZQN的荧光光谱
图2是BZQN滴定ctDNA溶液的荧光光谱。
其中曲线A是1.67×10-5mol/LctDNA，BZQN空白对照的浓度为1.88×10-3mmol/L。
ctDNA无荧光，当加入BZQN后，溶液的荧光发射峰从470nm移动388nm处，且荧光强度随BZQN浓度的增大而增强。
说明BZQN对DNA具有增敏作用，表明BZQN与DNA之间发生了相互作用。
图3是不同浓度的ctDNA在BZQN溶液中的荧光光谱，其中ctDNA空白对照溶液的浓度为1.67×10-2mmol/L。
BZQN在470nm处出现特征吸收峰，溶液的荧光强度随着DNA浓度的增大而减小，说明BZQN与ctDNA发生了某种方式的结合，DNA的存在对BZQN的荧光有猝灭作用。
3.2.2三维荧光
三维荧光光谱不仅能够直观地表现核酸分子在不同条件下的构象变化，还可全面展现待测样品的荧光信息，由此使核酸特征构象变化的研究更具有科学性和可靠性[9]。
图4BZQN的三维荧光光谱
图5BZQN-ctDNA的三维荧光光谱
BZQN的三维荧光光谱如图4所示，BZQN-DNA的三维荧光光谱如图5所示，比较图4和5可以看出：
加入ctDNA后，散射峰明显增强，说明BZQN与DNA之间发生了强烈的相互作用；而荧光发射峰的强度减弱，与稳态荧光的结果相同，表明DNA与BZQN发生相互作用后使BZQN的荧光猝灭。
3.2.3变温荧光
图6不同温度下ctDNA对BZQN的Stern-Volmer关系图
荧光猝灭机理可分为静态猝灭和动态猝灭。
静态猝灭是猝灭常数Ksv随温度的升高而减小，而动态猝灭是猝灭常数Ksv随温度的升高而增大。
猝灭常数Ksv能够衡量DNA对BZQN荧光猝灭的速率。
以F0/F-1对ctDNA的浓度作图，可以得到DNA对BZQN的Stern-Volmer猝灭曲线，如图6所示。
图6是利用温度在298，303，310K时的荧光实验数据，分别做出3个温度下的Stern-volmer曲线，对实验数据线性拟合，得298K时BZQN与DNA作用的猝灭常数Ksv=5.3×104L·mol-1，303K时的猝灭常数Ksv=7.9×104L·mol-1，310K时的猝灭常数Ksv=8.8×104L·mol-1。
动态猝灭作用的Ksv值一般都小于2.00×1010L·mol-1，初步判断DNA对BZQN的猝灭方式可能为动态猝灭。
据文献[17]报道，随着温度的升高，会使分子扩散系数增大，分子间发生碰撞的几率增大，发生荧光猝灭的可能性也随之增大。
如果荧光猝灭机理是静态猝灭，温度升高会使Ksv减小；若是动态猝灭，则温度的升高会使Ksv增大。
同时，升高温度后将降低配合物的稳定性，这就使得形成配合物的可能性也减小。
图6中，随温度升高，Ksv的值明显增大，表明ctDNA对BZQN的猝灭方式为动态猝灭。
3.3碱变性实验
图7BZQN-DNA体系碱变性曲线
ctDNA是具有双螺旋结构的大分子，通过两条链之间的碱基对由氢键相互作用而紧密连接在一起。
BZQN是本身具有荧光的物质，和DNA相互作用后形成的BZQN-DNA溶液也具有荧光。
DNA的碱变性指的是，互补碱基间的氢键作用力在碱性溶液中会减弱，导致DNA开链成两条单链，破坏其双螺旋结构[18]。
曲线A-F是pH=8,9,10,11,12,13的BZQN-DNA溶液的荧光光谱，由图可以看出：
随着溶液的碱性增强，溶液的荧光强度减弱，且在碱性较强的溶液中荧光强度特别微弱。
这种现象可能是因为溶液的碱性增强后使DNA的双螺旋结构发生变化，致使BZQN从DNA上脱落
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