6蛋白质工程1.docx

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6蛋白质工程1

6蛋白质工程

学习目的：

①初步了解蛋白质结构、以及蛋白质分子设计和蛋白质修饰和表达等的基本原理。

②了解如何利用蛋白质工程技术和其他相关技术获得更加符合人类需求且比天然蛋白质更优良的蛋白质，

20世纪60年代初，随着生物化学和分子生物学的发展和延伸，人们对生物的遗传物质——DNA结构与功能已经有了比较清楚的认识。

1972年，美国斯坦福大学Berg成功地实现了DNA重组实验，从此揭开了基因工程发展的序幕，并逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程在内的一系列高新生物技术。

这些技术发展到今天，已经形成产业化并成为全球高科技领域发展的主流，广泛地应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源、资源再利用和国防等许多部门与行业，并日益显示出不可估量的社会效益和经济效益，将为解决当前世界所面临的蛋白质缺乏、能源不足和高效医药品短缺等系列重大问题提供了基本保证和可行性技术。

20世纪80年代初，随着蛋白质晶体学和结构生物学的发展，人类可以通过对蛋白质结构与功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等高新技术改造基因，以达到改进蛋白质某些性质的目的。

这些技术的融合，促使了蛋白质工程这一新兴生物技术领域的诞生，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。

1982年，Winter等首次报道了通过基因定位诱变获得改性的酪氨酸tRNA合成酶；1983年，Ulmer在《科学》杂志上发表了以"ProteinEngineering"（蛋白质工程）为题的专论，这标志着人们能按自己的意愿创造出适合人类需求的新基因，并能表达出具有不同功能的蛋白质。

这是新一代的基因工程，因而蛋白质工程也被称为第二代基因工程。

蛋白质工程的基本内容和目的可以概括为：

以蛋白质结构与功能为基础，通过化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和最终生产出比自然界存在的蛋白质功能更优良，更符合人类需求的功能蛋白质。

6．1蛋白质结构基础．

6.1.1蛋白质结构的基本构件

在自然界中，构成生命最基本的物质有蛋白质、核算、多糖和脂类等生物大分产，其中蛋白质最为重要，核酸则最为根本。

各种生物功能、生命现象和生理活动主往是通过蛋白质来实现的，因此蛋白质不仅是生物体的主要组分，更重要的是它与生命活动有着十分密切的关系。

在体内，蛋白质执行着酶催化作用，使新陈代谢能有序地进行，从而表现出各种生命的现象；通过激素的调节代谢作用，以确保动囱正常的生理活动；产生相应的抗体蛋白，使人和动物具有防御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力；构建成的各种生物膜，形成生物体内物质和信息交流的通路和能量转换的场所。

这一系列功能充分说明了蛋白质在生命活动中的重要作用，说明生命活动是不能离开蛋白质而存在的。

6．1．1．1蛋白质的化学组成

蛋白质在生命活动过程中之所以有如此重要作用，是由它自身的组成、结构、性质所决定的。

从动、植物细胞中提取出来的各种蛋白质，经元素分析，均含有碳、氢、氧、氮及少量的硫元素。

这些元素在蛋白质中多以大致一定的比例存在。

有些蛋白质还含有微量的过渡金属元素，例如：

铁、锌、钼和镍等元素。

蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：

碳50％～55％氢6．0％～7．0％氧20％～23％

氮15％～17％硫0．3％～2．5％

通常蛋白质的分子质量均在一万道尔顿以上，变化范围从10000到1000000道尔顿，结构很复杂。

蛋白质易被酸、碱和蛋白酶催化水解成分子量大小不等的肽段和氨基酸，这一过程所获得的产物称为不完全水解或部分水解产物。

两个或两个以上氨基酸残基组成的片段称为肽。

生产上常把蛋白质不完全水解的产物按分子大小分别称为脉、胨、肽。

其实脉和胨仅用于表示分子量较大但不确定的多肽混合物。

短肽可以进一步被水解成氨基酸，并成为蛋白质水解的最小单位，是组成蛋白质的基本单位。

从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有20种。

除了脯氨酸外，所有的氨基酸均可用下式表示：

R

（NH2一CH--COOH）

其中R代表侧链基团，不同氨基酸，R基团不同。

生物化学中，氨基酸的名称一般使用三字母的简写符号表示，有时也用单字母的简写符号表示。

这两套简写符号见于表6-1。

如按照。

a—氨基酸（a—氨基酸是指氨基处于与羧基相连的碳原子上）中侧链R基的极性性质，组成蛋白质的20种常见的氨基酸可分为以下四组：

①非极性R基氨基酸，这一组中共有八种氨基酸，其中五种是带有脂肪烃的氨基酸，即丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和脯氨酸；两种芳香族氨基酸，即苯丙氨酸和色氨酸；一种含硫氨基酸，即甲硫氨酸（蛋氨酸）。

②不带电荷的极性R基氨基酸，这一组中有七种氨基酸，即甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。

③带正电荷的R基氨基酸，这一组氨基酸属于碱

性氨基酸，即赖氨酸、精氨酸和组氨酸，在pH=7．0时，表现出正电荷特性。

④带负电荷的R基的酸性氨基酸有两种，即天冬氨酸和谷氨酸。

这两种氨基酸均含有两个羧基，在pH6～7范围内完全解离，因而表现出负电荷特性。

在蛋白质组成中，除了上述凹种常见的氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些a-氨基酸，如二碘酪氨酸、甲状腺素、羟脯氨酸等。

6．1．1．2氨基酸的物理性质

o-氨基酸呈五色结晶，各有特殊晶型。

它们的熔点极高，一般在200～300℃左右。

氨基酸是以两性离子形式存在的。

由于各种氨基酸都具有特定的熔点，常用于定性鉴定。

由于氨基酸分子上含有氨基和羧基，它既可接受质子，又可以释放质子，因此氨基酸属于两性电解质物质。

每一种氨基酸都具有特定的等电点（p1），如亮氨酸的pI为5．98，精氨酸为10．76，赖氨酸为9．74等。

各种氨基酸的等电点不同起因在于各种氨基酸分子上所含氨基、羧基等基团以及各种基团的解离程度不同所致的。

当溶液的pH小于某氨基酸的等电点时，则该氨基酸带正电荷，若溶液中pH大于某氨基酸的等电点时，则该氨基酸带负电荷。

因此，在同一PH条件下，各种氨基酸所带的电荷不同。

根据这一性质，就可以通过调节溶液的pH，使混合液中的各种氨基酸带上不同的电荷，再选用离子交换层析法或高压凝胶电泳技术把这些氨基酸混合物一一分开。

目前常用于分离混合氨基酸技术有纸上层析法、离子交换法、薄层层析法、高压液相色谱法、高压凝胶电泳法和毛细管电泳法等。

6。

1．1．3蛋白质的一级结构

蛋白质是由许多氨基酸按一定的排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。

蛋白质的肽链结构成为蛋白质的化学结构，它包括氨基酸组成、肽链数目、末端组成、氨基酸排列顺序和二硫键位置等内容。

一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基缩合失去一分子水，形成酰胺键，这种氨基酸之间连接的酰胺键又称为肽键，一般由三个或三个以上的氨基酸残基组成的肽称为多肽。

下面为蛋白质中一段多肽链的模式结构，表示氨基酸之间的肽键（图6—1）。

通常书

写多肽或蛋白质肽链结构时，总是把含有游离a-NH2的氨基酸一端写在左边，称为N端，用“H”表示；把含游离的a-COOH的氨基酸一端写在右边，称为C端，用“OH”表示。

在自然界中，多数蛋白质分子并不是由简单的单条肽链组成，即使是由单链组成，也存在分支或成环状现象。

一般情况下，一个蛋白质分子中的肽链的数目应等于末端氨基残基的数目。

因此可根据末端残基的数目来确定一种蛋白质分子是由几条肽链构成。

如果已知某种蛋白质含有几条肽链，则必须设法先分开这些肽链，然后再测定每条肽链的氨基酸序列。

胰岛素分子由两条多肽链组成，分别称为A链和B链，两条肽链由两个二硫键连接起来，在A链内部还有一个二硫键，它将A链的第6和第11氨基酸残基连接起来。

A链和B链分别由21个和30个氨基酸残基组成（图6-2）。

从图中可看出，人与猪和牛的胰岛素组成存在着1～2个氨基酸残基的差异，如用后两种动物的胰岛素治疗人的糖尿病时，其药效比直接采用人胰岛素低。

这一现象说明了，每一种蛋白质的功能与它的肽链氨基酸序列和肽链构成的高级结构有着不可分割的联系。

从上述胰岛素分子结构可知蛋白质一级结构就是由许多氨基酸按照一定的排列顺序，通过肽键相连接而成的多肽链结构，每一种蛋白质的肽链的氨基酸都有一定的排列顺序。

蛋白质的一级结构是最基本的，它包含着决定蛋白质的高级结构的关键性因素。

6．1．2蛋白质的高级结构

蛋白质的分子结构可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，这些结构由各种化学键组成。

蛋白质的分子构象又称为空间结构、高级结构、立体结构、三维结构等等，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的摆布情况和规律。

图6—2猪、牛和人胰岛素一级结构

所谓蛋白质的二级结构是指多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象，如a—螺旋，β-折叠和β—转角等。

a—螺旋和β—折叠是蛋白质构象的重要单元。

二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。

Paldi和Corny（1951年）用X—射线衍射技术研究多肽链的结构时，发现其中存在a—螺旋，肽链折叠成螺旋形状。

a—螺旋的螺距（pitch）5．4Å，螺旋每绕一圈（360°）为3．8个氨基酸残基，每个重复单位沿螺旋轴上升1．5Å（图6—3）。

β—折叠是一种肽链相对伸展的结构（图64）。

在这种结构模型中，肽链按层排列，在相邻的肽链之间形成氢键，得以巩固这种结构。

肽链的走向有正平行式和反平行式，正平行式即所有肽链的N末端都在同一端，如β-角蛋白。

反平行式即肽链的N端一顺一倒地排列，如丝心蛋白。

从能量角度考虑，反平行式更为稳定。

在天然蛋白质变性时，往往就包含a—螺旋向β-折叠的转变。

在自然界中，多数蛋白质的空间结构呈球状，它比纤维型蛋白质的结构要复杂得多。

球状蛋白不是简单地沿着一个轴有规律地重复排列，而是在三维空间中沿着多方向进行卷曲、折叠、盘绕而成的近似球形的结构。

这种在二级结构基础上的肽链再折叠，称为蛋白质的三级结构。

维持蛋白质构象的作用力有四种非共价键类型：

①R基之间的氢键；②非极性R基之间的疏水基相互作用（范德华引力）;③a-螺旋和β—折叠中的肽链内或肽链间的氢键；④带正负电荷的R基之间的离子键。

维持蛋白质的三级结构最重要的作用力是疏水键的相互作用。

从共价结构上看，亚基就是蛋白质分子的最小共价单位。

亚基一般是由一条多肽链组成的，但有的亚基也可以由几条多肽链组成，这些多肽链通常以二硫键相连接成为亚基。

由亚基聚合而成的蛋白质分子称为寡聚蛋白。

由亚基组成的寡聚蛋白结构被称为四级结构，侧重强调亚基之间的相互作用和空间排布情况。

由相同的亚基构成的四级结构，叫均一四级结构；由不同亚基组成的四级结构，叫非均一四级结构。

四级结构不是靠共价键结合的，维持四级结构的主要力靠疏水键，氢键、离子键和范德华引力也参与维持四级结构的稳定性，但是它们可能仅仅起到次要的作用。

此外，在个别的情况下，二硫键等也参与维持四级结构。

四级结构中的聚合物，大致可分为不对称性的聚合物和对称性的聚合物。

前者可分为大小亚基，例如核糖体；后者可进一步分为三亚类，即空间对称、线对称和点对称。

如胰岛素结构呈空间对称；微管和丝状噬菌体结构呈线对称。

而点对称是蛋白质四级结构中最为常见的。

构成四级结构的原体可排列成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多可聚合成六十聚体等。

例如酵母己糖激酶、前白蛋白和醇脱氢酶为二聚体蛋白质；细菌叶绿素蛋白和捕光叶绿素蛋白均为三聚体的结构等。

6．1．3蛋白质分子之间的相互作用

在一定的条件下，蛋白质亚基的聚合可以被解离成游离的亚基，但在适当的条件下，这些游离的亚基又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质分子。

例如棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分子是由二个相同的。

a亚基和二个相同的β亚基所构成的四聚体。

在较低的蛋白质浓度或较低的pH、离子强度下，这种四聚体可解离成。

a和β亚基，但在较高的蛋白浓度或较高的pH、离子强度下，又能够重组成具有四聚体结

构的钼铁蛋白分子。

在特殊环境条件下，某些具有四级结构的蛋白质分子之间，一种蛋白质分子的亚基可以与另一种蛋白质的亚基聚合，并产生有活性的杂交分子。

这一过程也是一种分子杂交。

例如，不同来源的固氮酶均由钼铁蛋白和铁（硫）蛋白（imnPmtein）组成的，它能在常温常压下催化空气中的N2成为NH3。

实验结果表明，棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白能够分别与肺炎克氏杆菌和红螺藻等固氮酶铁（硫）蛋白产生分子杂交反应，并表现出一定的固氮活性；同样，棕色固氮菌固氮酶的铁（硫）蛋白分子也能与上述固氮菌钼铁蛋白分子聚合，形成能表达固氮活性的杂交的固氮酶复合物。

不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组成，都能聚合成聚合物。

例如，酸性多肽在生理pH溶液中能产生二聚肽；胰岛素单体在特定溶液中能产生聚合数目大于6的高聚体。

由单体形成二聚体的主要结合力有疏水键和氢键。

蛋白质亚基或分子的聚合方式有各种各样，并产生不同的聚合体，如：

环状、螺旋状、线状或球状等。

近十年来，大量的实验结果表明，在特定的条件下，蛋白质能表现出自动装配功能，如烟草花叶病毒和某些细胞器（如核糖体）在拆散了各种蛋白质、核酸后，又能自动装配成具有功能的烟草花叶病毒和某些细胞器碎片。

6．1．4蛋白质结构与功能的关系

蛋白质分子所具有的多种多样的生物学功能是与它们特殊的和复杂的结构紧密相关的。

一般说来，蛋白质结构与功能的关系包含着两个方面的问题：

①蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特定的功能，在蛋白质肽链中有一些基团对特定功能而言是必需基团，另一些是非必需基团。

②在体内，蛋白质分子是如何利用它的特定结构执行特定的生物功能的。

尽管这两个问题所涉及的问题比较广，情况较复杂，但近几十年来，随着生物化学与分子生物学技术的快速发展，许多蛋白质的结构与功能的关系的奥秘正在逐步被揭示。

例如蛋白质组与神经信号传导关系就是一个很活跃的研究领域。

同源蛋白质（holnologousprotein）是指在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质，但这些同源蛋白质中的氨基酸序列存在着种属的差异性，例如，图6—2所示的猪、牛和人等胰岛素具有同样的降低血糖的生物学功能，都均有A和B链构成，分子量也几乎一样，但它们的氨基酸序列存在着个别的差异。

有时同种有机体来源的一种蛋白质，经高度纯化后，可以分出两种或两种以上的存在方式，但它们的氨基酸序列差异往往是很细微的，只有1～2个氨基酸残基或某一个基团的差别。

此外，随着蛋白质分离技术的发展，许多原认为是均一组成的蛋白质，经不同的分离技术可获得细微差别的不同组分，例如，牛胰岛素在逆流分配和凝胶电泳过程中可获得仅一个酰胺基差别的两个成分，这一现象通常称为微观差异。

目前，在化学结构和空间结构已经阐明的酶蛋白，其酶分子的活性中心与底物结合时，整个酶分子的立体构象有所扭动，这种扭动引起的张力正是促使底物化学键容易发生断裂的基本原因。

这种张力也是依靠酶分子中的许多非活性中心部位的协调作用而发生的。

铁蛋白的分子结构是由铁核和蛋白壳组成（图6-5）。

铁蛋白的隧道可分为电子隧道和物质交换隧道，前者起着传递电子的作用，后者起着物质交换的通道作用。

马脾铁蛋白（HSF）铁核中的中点

电位（E°=—190mV）比生物电子供体维生素C（Vc）的中点电位（E°=—14mV）低。

如果Vc通过扩散方式和穿过三相物质交换隧道去直接还原HSF铁核中的Fe3+似乎不太可能。

但实验结果却证实了Vc有足够能力还原HSF或猪脾铁蛋白（PSF）中的Fe3+，推测这一现象与铁蛋白蛋白壳经Vc络合与还原后所产生的柔性调节有关。

6．2蛋白质工程的研究方法

6．2.1蛋白质工程的研究策略

蛋白质工程的基本任务就是研究蛋白质分子结构规律与生物学功能的关系；对现有的蛋白质加以定向修饰改造、设计与剪切，构建生物学功能比天然蛋白质更加优良的新型蛋白质。

由此可见，蛋白质工程的基本途径是从预期功能出发，设计期望的结构，合成目的基因且有效克隆表达或通过诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成新型优良蛋白质。

图6-6所示是蛋白质工程的基本途径及其与现有天然蛋白质的生物学功能形成过程的比较。

蛋白质工程主要研究手段是利用所谓的反向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其高

低程度。

6．2．2蛋白质全新设计

6．2．2．1设计目标的选择

蛋白质全新设计可分为功能设计和结构设计两个目标。

目前的研究重点和难点侧重从结构设计出发，从蛋白质的二级结构开始，以摸索蛋白质结构的稳定性。

在超二级结构和三级结构设计中，通常选择一些蛋白质结构比较稳定的蛋白质作为设计目标，如固氮酶钼铁蛋白结构和四螺旋束结构。

在蛋白质功能设计方面，主要进行天然蛋白质功能的模拟，如哺乳动物铁蛋白铁氧化酶活性中心的模拟和固氮酶钼铁蛋白活性中心模拟和合成等。

6．2．2．2蛋白质设计技术与方法

最早的设计方法是序列最简化法（minimalistapproach），其特点是尽量使设计的复杂性最小，一般仅用少数几个氨基酸。

设计的序列往往具有一定的对称性和周期性，因为这种方法使设计复杂性减少，并能检测一些蛋白质折叠的规律和方式。

1988年，Mutter首先提出模板组装合成法（templatesassembledsyntheticproteinap-proach），其主要思路是将各种二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的模板分子上，形成一定的三级结构。

模板组装合成法绕过了蛋白质三级结构中的氨基酸残基来研究蛋白质中长程作用力，是研究蛋白质折叠规律和进行蛋白质全新设计规律摸索的有效手段。

设计的蛋白质序列只有通过合成并进行结构检测后才能判断设计是否与预想结构符合。

一般从三方面来检测：

是否存在蛋白质多聚体状态。

二级结构与预期目标是否吻合。

是否具有预定的三级结构。

圆二色谱和核磁共振技术可用于研究蛋白质是否以单分子或多聚体形式存在。

三级结构测定目前主要依靠荧光和核磁共振技术。

此外，体积排阻色谱法也可以用于判断分子体积大小、聚合体数目和蛋白质结构是处于无规则状态或三级结构等生化参数。

从热力学第一定律出发设计蛋白质，即按热力学第一定律从头设计一个氨基酸序列，它能折叠成一个预期的结构。

例如，美国Duke大学的Richardson从头设计了由62个氨基酸组成的β型结构，杜邦公司的Degrado和加洲大学的Eisenberg大学合作设计了一个4a螺旋结构，这一现象说明了简单结构蛋白的从头设计成为可能。

此外，美国加洲理工学院的Stephen和Dahiyat从第一定律出发设计了一个不用Zn离子稳定的锌指结构（图6-7）。

经序列对比分析，天然的锌指和按热力学定律设计的锌指的一级结构同源性很低，但结构很相似。

6．2．3改变现有蛋白质的结构

目前蛋白质工程主要还是集中在改变现有蛋白质这一领域。

改变现有蛋白质

的结构一般需要经过如下几个步骤：

①分离纯化目标蛋白质；②分析目标蛋白质的一级结构；③分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系；④根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因；⑤根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案；⑥对目的基因进行人工定点突变；⑦改造后的基因在宿主细胞中表达；⑧分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达到设计目的。

改变蛋白质结构的核心技术是基因的人工定点突变，虽然基因人工定点突变有许多方法，但要在一个基因的任何位点准确地进行定点突变，目前常用的主要有M13载体法和PCR扩增法。

6．2．3．1M13载体法

该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。

具体地说就是将待诱变的基因克隆在M13噬菌体载体上，另外，人工合成一段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段（8-18bP），以此作为引物（即所谓的突变引物），在体外合成互补链，再经体内扩增基因，经此扩增出来的基因有1／2是突变了的基因，经一定的筛选便可获得突变基因（图6-8）。

6．2．3．2PCR扩增法

该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因。

PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。

重组PER定点诱变法：

该方法是利用两个互补的带有突变碱基的内侧引物以及两个外侧引物，先进行两次PCB扩增，获得两条彼此重叠的DNA片段。

两条片段由于具有重叠区，因此在体外变性与复性后可形成两种不同的异源双链DNA分子，其中一种带有3’凹陷末端的DNA可通过Taq酶延伸而形成带有突变位点的全长基因。

该基因再利用两个外侧引物进行第三次PCR扩增，便可获得人工定点突变的基因（图6-9）。

大引物诱变法：

该方法是利用一个带突变位点的内侧引物与一个外侧引物先进行PCR扩增，再以扩增产物作为引物与另一个外侧引物进行第二次PCR扩增而获得人工定点突变的全长基因（图6-10）。

6．3蛋白质工程的应用实例

蛋白质工程的应用已有许多成功的例子，这里略举一二加以说明。

6．3．1胰蛋白酶

胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类，是一条具有223个氨基酸残基和以异亮氨酸为N末端的单肽链。

胰蛋白酶即使在温和条件下，也很容易产生自溶作用。

自溶产物经层析分离后，得到4个具有胰蛋白酶活性的片段。

N末端残基分析表明这些活性产物是由于Arg117—Val118、Lys145—Ser146及Lys159—A1a160处发生了断裂。

通过蛋白质工程的手段，完成了Arg117位自熔点的缺失突变，得到缺失突变体，其结果表明该突变体的稳定性明显提高。

此外，通过将酶分子表面的正电荷改变成负电荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa值，从而在pH较高的条件下显示出对精氨酸具有更高的专一性。

6．3。

2金属硫蛋白

金属硫蛋白（metallothothione，MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质，其个氨基酸残基中含有20个半胱氨酸，可以通过半胱氨酸的巯基结合大量的金属素。

MT一般由两个大小相近，结构与功能类似的结构域组成——a-结构域和β结构域。

为了提高植物对重金属的抗性，并从土壤中富集重金属元素，将含有a-结构域或更多拷贝串联的a—结构域（a12）的基因分别转移到烟草中，获得的转基因柽具有比野生型植株更高的对于Cd，Us，Pb，Cu等重金属的抗性。

6。

3．3人白细胞介素-2

天然人白细胞介素—2（1L-2）由133个氨基酸残基组成，共有三个半胱氨酸中有一个半胱氨酸（Cys125）以游离方式存在，而另两个半胱氨酸（Cys58和Cys105：

成活性所必需的二硫键。

二硫键的错误配对将降低其生物学活性并对人具有抗性。

用基因定点突变方法可将IL-2的125位Cys改为丝氨酸（Ser）或丙氨酸（灿避免错误配对的产生，而且其热稳定性等方面也有较明显的改善。

6．3．4组织纤溶酶原激活因子

组织纤维蛋白溶酶原激活因子（t-PA）是一种血浆糖蛋白，其功能是将单钥活性形式的血浅纤溶酶原（plg）激活，转变成纤溶酶。

纤密酶不仅发挥纤溶作用而解血栓，而且参与体内一系列与蛋白质水解有关的生理、病理过程。

t-PA的这种特性使得它被用于急性心血管栓塞的溶栓制剂。

用DNA重组技术改变t-PA的氨基酸序列，可以改善t-PA功能，目前进行t-PA蛋白质工程的研究主要是构建长半衰期的t-PA突变体。

天然t-PA的某些位点是糖基化的。

t-PA的糖基化对t-PA的活性影响不大，但会影响其半衰期。

病人服用带糖基化的t-PA，5min后血液中的50％以上的t-PA会被清除掉。

通过改变t-PA分子中的某些糖基化的氨基酸而减少或避免糖基化，可减缓在血浆中被清除的速率，从而获得具有更长半衰期的治疗药剂。

6．3．5枯草杆菌蛋白酶

枯草杆菌蛋白酶是重要的工业用酶，但该酶很容易被氧化，氧化后的蛋白酶很快地失去活性。

为了适应工业生产的需要，采用基因工程技术对它进行基