灵芝活性多肽的提取工艺研究.docx

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灵芝活性多肽的提取工艺研究

灵芝活性多肽的提取工艺研究

摘要：

本文以灵芝为原料，采用四因素三水平正交实验，分别采用超声提取工艺和酶提取方法，研究了影响灵芝多肽（生物活性多肽）酶解的主要因素及最佳提取条件。

实验结果表明，酶提取法的最佳提取条件是：

碱性蛋白酶、反应温度55℃、加酶量0.08g、反应时间1.5h，在此条件下灵芝活性肽提取率可达15.70％。

通过极差分析可知影响养灵芝活性肽水解度的各因素的排列顺序为从大到小依次为酶种类、反应时间、反应温度、加酶量。

相应的，超声提取法的最佳提取条件是乙醇浓度10%、料液比1:

15、反应温度60℃、反应时间1.5h，在此条件下灵芝多肽的提取率可达5.730%。

影响灵芝多肽提取率的因素排列顺序从大到小依次为超声时间、反应温度、乙醇浓度和料液比。

关键词：

灵芝多肽提取方法最佳条件多肽得率

AStudyonextractionprocessoftheactivepeptidesfromGanodermalucidum

Abstract:

Inthispaper,Ganodermapowderasrawmaterial,theuseofthefourfactorsandthreelevelsorthogonalexperimentswereusedtoprocessultrasonicextractionandenzymaticextractionmethodtostudythemainfactorsaffectingtheGanodermalucidumpeptides（biologicallyactivepeptides）digestionandoptimumextractionconditions.Experimentalresultsshowthattheoptimumconditionsofenzymeextractionmethodis:

alkalineprotease,thereactiontemperatureis55℃,enzymedosage0.08g,reactiontime1.5h,underthisconditionGanodermaactivepeptideextractionrateof15.70%.ByorderoftherangeanalysisshowsthatthenutrientGanodermaactivepeptidehydrolysisdegreeofeachfactortothedescendingorderoftheenzymespecies,reactiontime,temperature,enzymedosage.Accordingly,theoptimumconditionsofultrasonicextractionmethodis10%ethanolconcentration,solid-liquidratioof1:

15,thereactiontemperatureis60℃,reactiontime1.5h,undertheseconditionstheextractionrateofupto5.730%Ganodermapolypeptides.FactorsaffectingtherateofpolypeptideextractofGanodermaindescendingorderwereultrasonictime,reactiontemperature,ethanolconcentrationandsolid-liquidratio.

Keywords:

Ganodermalucidumpeptides；ExtractionMethod；Optimalconditions；Peptideyield

1．引言

1．1研究背景和意义

灵芝（GanodermaLucidum），又名赤芝、瑞草、万年蕈和灵芝草，属于担子菌纲多孔菌目灵芝科，是一种珍贵的药用真菌。

灵芝外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，于我国普遍分布，黑龙江、吉林、山东、湖南、安徽霍山、江西、广东、广西等省份均有部分产量。

欧洲、美洲、非洲、亚洲东部也有不同量产。

其中东北灵芝种植基地以吉林省较为集中。

灵芝在中国被称为“不朽的蘑菇”并运用于东方医药中已有超过2000多年的历史，在多部医学古籍上都有论述，一直被历代医药学家和劳动人民视为延年益寿、滋补强壮、扶正固本的神奇珍品，它们也是我国中药及传统食疗宝库中的瑰宝。

灵芝的生物活性成分十分丰富，目前已分离到的有150多种化合物，主要可分为多糖类，三萜类化合物、氨基酸多肽类、生物碱类、甾醇类、呋喃类、油脂类、有机锗、矿质元素等10大类[1]。

因为灵芝所含有的多种生物活性物质，使得灵芝具有提高免疫力、抗肿瘤、降血压、降血脂等多种功效。

另外，灵芝在治疗肝、肾病、高血脂、神经衰弱、心血管疾病以及肿瘤等疾病方面都具有良好的临床疗效[2]。

由于灵芝独特的药用价值，有关灵芝的栽培技术、有效成分的提取、分离、纯化以及其生物学活性和药理价值的研究已引起了国际社会的关注，至今，对灵芝的研究已深入到分子生物学水平，研究报告、专著和灵芝的相关产品已相继问世。

然而，纵观目前的药理和学术研究，大多数的精力和关注点都集中于灵芝多糖、三萜类化合物及生物碱的研究上，对灵芝多肽的着墨并不多。

而据有关分析表明，现代代料栽培的灵芝中蛋白质及多肽的含量高达14.34%，且灵芝多肽有着明显的生物活性。

随着生物技术在药物研究和开发中的应用，特别是对中草药中基因、蛋白和药理作用之间关系的逐渐探索，也随着人们对自身身体健康保健的愈加重视，灵芝多肽的研究逐渐得到了重视，具有广阔的开发前景[3]。

1.2生物活性肽介绍

多肽是由蛋白质中天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的，从二肽到复杂的线性或环性结构的不同肽类的总称。

其中功能肽，又名生物活性肽，是指可调节生物体生理功能的多肽的总称[4]。

它是一种蛋白水解产物，是蛋白质经过一些特征酶或生物降解后产生的一种具有显著生物学活性的肽类混合物，这种肽类混合物由几个至几十个氨基酸组成的[5]。

近年来，已有科学研究证实发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽或多肽的形式能够更快的被机体吸收和利用[6]。

生物活性肽是一种多样化且来源丰富的多功能化合物，主要来源于蛋白质，具有消化吸收较快、降低血压血脂、促进生长免疫、提高激素调节、抵抗细菌病毒等多种人体新陈代谢功能和调节生理功能[7]。

因此，生物活性肽是筛选药物、制备疫苗和食品添加剂的天然资源宝库[8]。

另外，蛋白质为人体供应营养物质的形式也是多肽，更能最大限度的利用多肽的各种功能效应。

所以，相比游离态氨基酸，具有高生物效价和高营养价值的功能性多肽，更能有效的开发出多种对人体健康有利的保健食品，而且前景十分广阔。

1.3灵芝多肽的生物学活性

1.3.1免疫调节作用

生物有机体对侵入体内的各种病原微生物和它们所产生的毒素的抵抗作用的总称叫做免疫[3]。

已有研究证明，灵芝多肽有着免疫调节和促进细胞有丝分裂的作用。

从灵芝孢子粉中分离所获得的某种多肽经体外实验验证具有促进小鼠T淋巴细胞增殖的活性，且呈现出一定的剂量依赖效应。

还有学者研究表明灵芝多肽具有抑制人类外周血淋巴细胞分裂的作用，并有类似外源凝集素及植物凝血素等促细胞分裂素的效果。

1.3.2防癌与抗肿瘤作用

从薄树芝中分离提取的凝集素具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，该灵芝多肽还能有效抑制白血病细胞株及肝细胞瘤细胞株的增殖3]。

王关林等报道了富硒灵芝可以消除集体的自由基，增强机体免疫力，达到防癌、抗癌的多重效果。

多次实验研究结果都充分证明了灵芝多肽是一种生物大分子的活性物质，具有明显的防癌功效。

1.3.3抗氧化活性

灵芝中多糖、多肽及酚类物质都是有效的抗氧化剂成分。

最新的研究指出，灵芝多肽在体内、外实验中，由于它清除巨噬细胞中叔丁基氢过氧化物所产生的自由基，而具有强烈的抗氧化活性。

更有学者认为，灵芝多肽（GLP）是灵芝中主要的抗氧化成分。

通过油脂过氧化值评估，灵芝多肽在避光的大豆油和猪油中都表现出活跃的抗氧化活性。

在大豆油体系中，灵芝多肽甚至表现出比二丁基羟基甲苯（BHT）更强的抗氧化性。

灵芝多肽能有效的清除超氧化物阴离子自由基，另外，灵芝多肽在小鼠肝细胞匀浆和线粒体膜体系中，也显示出了较强的抗氧化活性。

1.3.4抗菌、抗病毒活性

从灵芝中分离提纯所获得的灵芝多肽经试验证实对疱疹单纯病毒表现出抗性活力，很有可能成为一种新型的抗疱疹制剂。

虽然详细的作用机理没有阐明，但并不妨碍很多学者认为灵芝多肽能抑制过滤性病原体的复制，通过干扰病毒早期进入目标细胞的吸附从而达到抗病毒的目的。

此外，Wang等从灵芝的子实体中分离提纯后获得的抗真菌蛋白在一定条件下表现出了对番茄灰霉病菌，尖孢镰刀菌和苹果轮纹病菌等多种病菌的抗真菌活性[9]。

1.4研究目的及基本思路

1.4.1灵芝多肽提取的研究目的

在查阅了相关文献后发现，关于灵芝活性多肽的研究鲜见于报道，而关于灵芝活性肽的不同提取方法对比研究更是有一大片的空白，本文旨在研究灵芝多肽最佳提取条件，为其提取应用的进一步研究提供方法，并且对比不同提取方法的最佳条件，分析其不同点和差异。

本试验旨在尽可能得到从灵芝提取液中得到高含量的灵芝活性肽，找到最佳的提取条件，为灵芝多肽的进一步研究提供试验方法与基础。

1.4.2实验基本思路

本次实验采用传统的超声提取和酶提取两种不同的方法，分别进行四因素三水平正交实验分析。

从实验结果中挑选出另种方法的最佳提取条件，并在各自的最佳条件下再次进行提取，从而得到得率最高的灵芝多肽提取工艺。

当然，也要对正交实验的结果进行极差分析，通过直观的计算和比对得出影响养灵芝活性肽提取率的各因素的排列顺序，为灵芝多肽的进一步研究和纯化奠定良好的基础。

2材料与方法

2.1实验材料、化学试剂与仪器

2.1.1实验材料

灵芝粉：

由浙江工商大学食品实验室提供，采自杭州吴山，粉碎后过60目筛，经凯氏定氮测定其蛋白质含量为18.96％。

碱性水解蛋白酶（Alcalase）：

购自诺维信中国生物技术有限公司。

纤维素酶、木瓜蛋白酶。

2.1.2主要试剂

芦丁、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、盐酸、碳酸钠、柠檬酸、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（以上所用试剂均为分析纯）。

浓盐酸、浓硫酸

2.1.3试剂的配制

30%乙醇；55%乙醇；70%乙醇；85%乙醇；95%乙醇，分别按相应的乙醇与水的体积比配置不同浓度的乙醇溶液。

0.3mg/ml芦丁溶液准确称取0.0752g芦丁标准物，用30%乙醇定容于250ml容量瓶；

5%NaNO2溶液：

准确称取5.0030g亚硝酸钠药品，用水溶解，并定容于100ml容量瓶；

10%Al（NO3）3溶液：

准确称取10.0067g药品用蒸馏水定容于100ml容量瓶；

1mol/lNaOH溶液：

准确移取56ml饱和氢氧化钠溶液用蒸馏水定容于100ml容量瓶；

0.05mol/lHCL溶液：

取4.5mL浓盐酸,注入蒸馏水中,并用蒸馏水定容于1L，摇匀；

0.1mol/l柠檬酸缓冲液：

称取2.1014g柠檬酸粉末，加一定蒸馏水溶解，并用蒸馏水定容至100ml容量瓶；

甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：

准确称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL（溶液Ⅰ）；准确称取0.2g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL（溶液Ⅱ），取30m