第七章蛋白质与多肽类药物制备原理.docx

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第七章蛋白质与多肽类药物制备原理

第七章蛋白质与多肽类药物制备原理

第一节概述

蛋白质是构成生物体的基本物质。

不管是简单的低等生物，还是复杂的高等生物，在它们机体内都有蛋白质存在。

病毒、细菌、植物和动物细胞原生质的物质基础是蛋白质。

对于人体和动物而言，体内最重要的组成成分是蛋白质，在新鲜组织中蛋白质的重量约占20%。

植物体内蛋白质的含量相差悬殊，在新鲜组织中一般只有0.5~3%，在植物种子中达15%，豆类种子含量最多，例如黄豆中蛋白质几乎高达40%。

一些动植物材料中蛋白质的含量如表7-1所示。

现代的科学实验已经证明，蛋白质是生物体各种重要生命活动不可缺少的物质。

其重要的生理功能可举例如下

（1）酶活性：

在人体新陈代谢的化学变化中，起着催化作用的酶都是蛋白质。

正是这些酶蛋白决定着生物系统的代谢类型。

（2）转运和储存：

许多小分子和离子是由特殊蛋白质转运的。

例如，氧气的运输就是由红细胞中的血红蛋白来完成的。

又如机体内的铁离子是与血浆中的运铁蛋白结合而转运的。

铁还可在肝中形成铁蛋白复合物而储存（铁蛋白和运铁蛋白是不同的蛋白质）。

有许多药物吸收进入血液之后，也常先与血浆白蛋白结合以促进其运输。

所以蛋白质与许多小分子物质的运输和储存有密切关系。

（3）协调运动：

蛋白质是肌肉的主要成分，肌肉的收缩就是由二类蛋白质细丝的滑动来实现的（即肌动蛋白和肌球蛋白），而肌肉收缩与舒张对生物的运动和各器官的活动都有密切关系。

（4）机械支持作用：

皮肤和骨骼有高度的抗牵拉强度，这是由于胶元蛋白质所形成的纤维具有很强的抗牵拉作用。

（5）免疫防护：

大家所熟知的抗体是一种高度特异性蛋白质，它能识别外源物质（如病毒、细菌和异种蛋白等）并与之结合而使之失去活性，从而预防各种疾病的发生。

（6）激发和传导神经冲动：

现已知道，视紫红质是视网膜的杆状细胞中的一种蛋白质，在光线作用下能够产生刺激神经的作用，再通过神经反射机制而产生视觉。

（7）生物体的生长繁殖和遗传变异：

生物的生长、繁殖、遗传和变异也都与核蛋白有密切关系。

而核蛋白就是核酸与蛋白质所组成的结合蛋白质。

从上面的例子中可知，蛋白质在生命活动过程中，起着非常重要的作用。

它们表现在，促进食物消化、促进和调节各种物质代谢，协调肌肉运动，转运和储存许多的小分子和离子、机械支持、免疫防护、激发和传递神经冲动以及控制生长、繁殖等生理功能。

自70年代后期开始，由于基因工程技术的兴起，人们首先把目标集中在应用基因工程技术制造重要的蛋白质药物上，已实现产品工业化的有胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、肿瘤坏死因子、促红细胞生成素、组织纤溶酶原激活因子等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。

鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗原性、容易失活、在体内的半衰期短、用药途径受限等难以克服的缺点，对一些蛋白质生化药物进行结构修饰、应用计算机图像技术研究蛋白质与受体及药物的相互作用、发展蛋白质工程及设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物并且起到增强或增加选择疗效的作用等，已成为前瞻性的重要任务之一。

一、蛋白质类药物的分类

蛋白质生化药物除了蛋白质类激素和细胞生长调节因子外，还有象血浆蛋白质类、粘蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等大量的其他生化药物品种，其作用方式也从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制物等多种领域。

主要蛋白质类药物有以下几种：

1.蛋白质激素

（1）垂体蛋白质激素

生长素，催乳激素，促甲状腺素，促黄体生成激素，促卵泡激素。

（2）促性腺激素

人绒毛膜促性腺激素，绝经尿促性腺激素，血清性促性腺激素。

（3）胰岛素及其他蛋白质激素

胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。

2.血浆蛋白质

白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白，免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，veil’s病免疫球蛋白，抗-D免疫球蛋白，抗-HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白质，抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。

3.蛋白质类细胞生长调节因子

干扰素α、β、γ，白细胞介素1~7，神经生长因子，肝细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，肿瘤坏死因子，集落刺激因子，组织纤溶酶原激活因子，促红细胞生成素，骨发生蛋白。

4.粘蛋白

胃膜素，硫酸糖肽，内在因子，血型物质A和B等。

5.胶原蛋白

明胶，氧化聚合明胶，阿胶，新阿胶，冻干猪皮等。

6.碱性蛋白质

硫酸鱼精蛋白

7.蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂等。

二、蛋白质提纯的一般方法：

1.根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质

蛋白质是两性电解质，在一定PH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点，在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解性、粘度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。

2.根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质

蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相同。

由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子分离，也可将大小不同的蛋白质分离。

3.根据蛋白质溶解度不同来纯化蛋白质

蛋白质的溶解度受溶液的pH值、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。

在同一特定条件下，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度，达到分离的目的。

4.根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质

离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团。

它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。

5.根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质

主要是利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。

6.根据蛋白质疏水基因与相应的载体基团结合来纯化蛋白质

蛋白质分子上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮酸酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起形成，并暴露于分子表面。

这些疏水区，能够与吸附剂上的疏水基团结合，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有去垢剂的溶剂，增高洗脱剂的pH值等方法将蛋白质洗脱下来。

用含酚基疏水基团的琼脂糖PhenylSepharose纯化重组人表皮生长因子（rhEGF），纯度可达94%，回收率达82%。

7.根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质

这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为逆流分溶。

利用逆流分溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。

8.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质

蛋白质易受pH、温度、酸、碱、金属离子、蛋白沉淀剂、络合剂等的影响，由于各种蛋白质都存在着差异，可利用这种差异来纯化蛋白质。

白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67℃的温度，而其他蛋白质将变性。

球蛋白或白蛋白在碱性条件下，可以和利凡诺作用，形成络合物而与其他蛋白质分离。

细胞色素C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀，而保存其活力。

9.根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质

在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附有结晶的磷酸钙（羟灰石）、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。

诸如催产素、胰岛素、细胞色素C等都可以通过吸附层析技术进行纯化。

三、多肽类药物分类

活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域，尤其是近年来更是有突飞猛进之势。

生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的。

主要多肽药物如下：

1.多肽激素

（1）垂体多肽激素

促皮质素，促黑激素，脂肪水解激素，催产素，加压素。

（2）下丘脑激素

促甲状腺激素释放激素，生长素抑制激素，促性腺激素释放激素。

（3）甲状腺激素

甲状旁腺激素，降钙素。

（4）胰岛激素

胰高血糖素，胰解痉多肽。

（5）胃肠道激素

胃泌素，胆囊收缩-促胰激素，肠泌素，肠血管活性肽，抑胃肽，缓激肽。

（6）胸腺激素

胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子。

2.多肽类细胞生长调节因子

表皮生长因子，转移因子，心钠素。

3.含有多肽成分的其他生化药物

骨宁，眼生素，血活素，氨肽素，妇血宁，脑氨肽，蜂毒，蛇毒，胚胎素，助应素，神经营养素，胎盘提取物，花粉提取物，脾水解物，肝水解物，心脏激素等。

第二节蛋白质类药物制备工艺

一、白蛋白（Albumin）的制备

1.结构和性质

白蛋白又称清蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，约占总蛋白的55%。

同种白蛋白制品无抗原性。

主要功能是维持血浆胶体渗透压。

白蛋白为单链，由575个氨基酸残基组成，N-末端是天门冬氨酸，C-末端为亮氨酸，分子量为65，000，PI为4.7，沉降系数（S20，w）4.6，电泳迁移率5.92。

可溶于水和半饱和的硫酸铵溶液中，一般当硫酸铵的饱和度为60%以上时析出沉淀。

对酸较稳定。

受热后可聚合变性，但仍较其他血浆蛋白质耐热，蛋白质的浓度大时热稳定性小。

在白蛋白溶液中加入氯化钠或脂肪酸的盐，能提高蛋白的热稳定性，可利用这种性质，使白蛋白与其他蛋白质分离。

自人血浆中分离的白蛋白有两种制品：

一种是从健康人血浆中分离制得的，称人血清白蛋白：

另一种是从健康产妇胎盘血中分离制得的，称胎盘血白蛋白。

制剂为淡黄色略粘稠的澄明液体或白色疏松状（冻干）固体。

2.生产路线

（1）工艺路线

（2）工艺过程

①络合（利凡诺沉淀）

收入血浆泵入不锈钢夹层反应罐内，开启搅拌器，用碳酸钠溶液调节pH8.6，再泵入等体积的2%利凡诺溶液，充分搅拌后静置2~4h，分离上清液与络合沉淀（上清液供生产人丙种球蛋白用）。

②解离

沉淀加灭菌蒸馏水稀释，0.5mol/LHCl调节pH至弱酸性，加0.15~0.2%氯化钠，不断搅拌进行解离。

③加温

充分解离后，65℃恒温1h，立即用自来水夹层循环冷却。

④分离

冷却后的解离液用篮式离心机分离，离心分离液再用不锈钢压滤器澄清过滤。

⑤超滤

澄清滤液以Sartocon-IV超滤器浓缩。

⑥热处理

浓缩液在60℃恒温处理10h。

⑦澄清和除菌

以不锈钢压滤器澄清过滤，再通过灭菌系统除菌。

⑧分装

白蛋白含量及全项检查合格后，用自动定量灌注器进行分瓶灌装，得白蛋白成品。

二、干扰素（Interferon，IFN）的制备

1.结构和性质

干扰素（IFN）是指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。

这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力”。

人干扰素按其抗原性的不同，分为。

α、β、γ三型。

同一型别，根据氨基酸序列的差异，又分为若干亚型。

2.生产工艺

我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法，基因工程。

α-于扰素已于1989年转人中试，1990年获得生产许可证而进入工业化生产阶段。

（1）工艺路线

（2）工艺过程

①分离灰黄层

取献血者血液（一般每份400m1）采入含有ACD抗凝剂的塑料袋内，离心后分离出血浆，小心吸取灰黄层。

每份血可吸取13~15ml，约为血中细胞的40~50%，放置4℃冰箱中过夜。

②氯化铵处理

每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加人为总体积9倍量的冷的0.83%的氯化铵溶液，混匀，40℃放置10min，然后在4℃离心（8，000转/min）20min。

小心弃去溶血上清液，并加入适量的缓冲盐水，收集沉淀的细胞，作成悬液，再用9倍量的0.83%氯化铵液重复处理1次，溶解残存的红细胞。

取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞。

培养液的基础成分为Eagle’s培养基，其中含4~6%的人血浆蛋白，无磷酸盐，合Tricine3mg/ml及适量抗生素。

③起动诱生

取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100μ/ml，置37℃水浴搅拌培养2h。

④正式诱生

起动后的白细胞加入仙台病毒（在10天龄鸡胚中培养48~72h，收获尿囊液），使其最后浓度为100~150血凝单位/ml，在37℃搅拌培养过夜。

⑤收获

次日晨将培养物离心（2，500r/min）30min，吸取上清液即得粗制干扰素。

取样作无菌试验并测定效价。

作效价测定的材料要在pH2的条件下处理24h后，再作检定。

每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素。

⑥纯化

将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5mol/L，用2mol/L盐酸调节pH3.5，离心弃去上清液。

沉淀1加入原体积1/5量的94%冷乙醇，离心弃沉淀，上清液1用盐酸调节pH至5.5；离心弃去沉淀，再调至pH5.8，离心，得上清液2和沉淀物。

沉淀物加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液（pH2）溶解，检测，得IIFN。

上清液2调节pH至8，离心弃去清液，沉淀2加原体积1/50量的0.1mol/LPBS0.5mol/L硫氰化钾（pH8）溶解，pH降至5.2，离心得上清液3和沉淀物。

沉淀物加原体积1/2，500量的pH8、0.1mol/LPBS溶解，调至pH7~7.5，对PBS（pH7.3）透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得PIFN-B。

上清液中加盐酸使pH值降至3，离心，沉淀物3加原体积1/5，500量的pH8、0.1mol/LPBS溶解。

加NaOH调节pH7~7.5，对PBS（pH7.3）透析过夜，离心，收集上清液，检测，得PIEN-A。

此法特点是一次纯化量大，回收率高于60%；经济，简便，易于普及，效价可达1.2×108u/ml，比活2.2×106u/mg蛋白。

PIFN-A中干扰素含量占回收干扰素的82%，比活也比较高。

IIFN的比活较低（5×104u／mg蛋白），一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。

3.作用与用途

由于干扰素的抗病毒、抗细胞分裂及免疫调节作用，可用于：

（1）病毒性疾病

普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎。

（2）恶性肿瘤

成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、鼻咽癌等，可获得部分缓解。

（3）用于病毒引起的良性肿瘤可控制疾病发展。

三、胰岛素（Insrlin）的制备

1922年从胰脏中提取得到一种较纯的降血糖物质，命名为胰岛素，1923年开始供应临床使用。

迄今胰岛素仍为治疗胰岛素依赖性糖尿病的特效药物。

我国在1965年完成了牛结晶胰岛素的全合成工作，并具有与天然牛结晶胰岛素相同的生物活性。

胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白质。

胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含200万个胰岛，约占胰脏总重量的1.5%。

胰岛由。

α-、β-、和δ-三种细胞组成，其中β-细胞制造胰岛素，α-细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，α-细胞制造生长激素抑制因子。

胰岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在的，进而分解为胰岛素进人血液循环。

1.结构和性质

胰岛素由51个氨基酸组成，有A和B两条链，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，两链之间由两个二硫键相连，在A链本身还有一个二硫键。

不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上，它们随种属而异。

表7-2仅列出人和几种动物的氨基酸差异，但它们的生理功能是相同的。

由于猪与人的胰岛素相比只有B30位的一个氨基酸不同，人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸，因此我国目前临床应用的是以猪胰脏为原料来源的胰岛素，抗原性比其他来源的胰岛素要低。

胰岛素的前体是胰岛素原，胰岛素原可以看成是由一条连接肽（C肽）的一端与胰岛素A链的N-末端相连，另一端与B链的C-末端相连。

不同种属动物的C肽也不同，如人的C肽为31肽，牛的为26肽，猪的为29肽。

胰岛素原通过酶的作用，C肽两端的4个碱性氨基酸被水解去除后，即形成一分子胰岛素和一分子无活性的C肽。

人胰岛素原的结构见图7-1

胰岛素的性质有：

①胰岛素为白色或类白色结晶粉末，为扁斜形六面体。

②牛胰岛素的分子量为5，733，猪为5，764，人为5，784。

胰岛素的等电点为5.30~5.35。

③胰岛素在pH4.5~6.5范围内几乎不溶于水，在室温下溶解度为10μg/ml；易溶于稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。

④胰岛素在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。

在pH8.6时，溶液煮沸10min即失活一半，而在0.25%硫酸溶液中要煮沸60min才能导致同等程度的失活。

⑤在水溶液中胰岛素分子受pH、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚现象。

在低胰岛素浓度的酸性溶液（pH≤2）时呈单体状态。

锌胰岛素在pH2的水溶液中呈二聚体，聚合作用随pH增高而增加，在pH4~7时聚合成不溶解状态的无定形沉淀。

在高浓度锌的溶液中，pH6~8时胰岛素溶解度急剧下降。

锌胰岛素在pH7~9时呈六聚体或八聚体，pH>9时则解聚并由于单体结构改变而失活。

⑥在pH为2的酸性水溶液中加热至80~100℃，可发生聚合而转变为无活性纤维状胰岛素。

如及时用冷0.05mol/L氢氧化钠处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶。

⑦胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。

高浓度的盐，如饱和氯化钠、半饱和硫酸铵等可使其沉淀析出；也能被蛋白质沉淀剂如三氯醋酸、苦味酸、鞣酸等沉淀；并有茚三酮、双缩脲等蛋白质的显色反应。

胰岛素能被胰岛素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活。

⑧还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素C及多数重金属（除锌、铬、钴、镍、银、金外）都能使胰岛素失活。

破坏活性的主要原因是分子中二硫键被还原、游离氨基被酰化、游离羧基被酯化和肽键水解。

⑨胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和酪氨酸基团。

光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。

超声波能引起其非专一性降解。

⑩胰岛素能被活性炭、白陶土、氢氧化铝、磷酸钙、CMC和DEAE-C吸附。

2.生产工艺

生产胰岛素的方法很多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。

现介绍酸醇法。

（1）工艺路线

（2）工艺过程

①提取

冻胰块用刨胰机刨碎后加入2.3~2.6倍的86~88%乙醇（W/W）和5%草酸，在13~15℃搅拌提取3h，离心。

滤渣再用1倍量68~70%乙醇和0.4%草酸提取2h，同上法分离之。

乙醇提取液合并。

②碱化、酸化

提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH8.0~8.4（液温10~15℃），立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH3.6~3.8，降温至5℃，静置不少于4h，使酸性蛋白充分沉淀。

③减压浓缩

吸取上层清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，滤液并入上清液，在30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04~1.06（约为原体积的1/10~1/9为止）。

④去脂、盐析

浓缩液转入去脂锅内于5min内加热至50℃后，立即用冰盐水降温至5℃，静置3~4h，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。

用盐酸调pH2.3~2.5，于20~25℃在搅拌下加人27%（W/V）固体氯化钠，保温静置数小时。

析出之盐析物即为胰岛素粗品。

⑤精制

除酸性蛋白盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol/L氨水调pH4.2~4.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7：

3。

充分搅拌后，低温放置过夜，使溶液冷至5℃以下，次日在低温下离心分离，或使用过滤法将沉淀分离。

锌沉淀在滤液中加入4mol/L氨水使pH为6.2~6.4，加入3.6％（V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为20%），再用4mol/L氨水调节pH至6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。

结晶将过滤的沉淀用冷丙酮洗涤，得干品（每千克胰脏得0.1~0.125g干品）再按干品重量每克加冰冷2%柠檬酸50ml、6.5醋酸锌溶液2ml、丙酮16ml，并用冰水稀释至100ml，使充分溶解，冷到5℃以下，用4mol/L氨水调pH8.0，迅速过滤。

滤液立即用10%柠檬酸溶液调pH6.0，补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为16%。

慢速搅拌3~5h使结晶析出。

在显微镜下观察，外形为似正方形或扁斜形六面结晶，再转人5℃左右低温室放置3~4天，使结晶完全。

离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醇脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素，效价每毫克应在26单位以上。

⑥回收

在上述各项操作中，应注意产品回收，从pH4.2沉淀物中回收的胰岛素量最多，占整个回收量的近一半，约为正品的10%。

从油脂盐析物中回收的胰岛量也可达到正品的5%左右。

四、绒膜促性激素（Humanchrionicgonadotrophin，HCG）的制备

1.结构和性质

绒膜促性激素或人绒毛膜促性腺激素是从受精卵着床第1天，即受孕的第8天开始，由胎盘滋养层合体细胞分泌的。

受孕后第20天尿中可测得HCG，到妊娠45天时，尿中HCG的浓度升高，60~70天时可达到高峰，24h尿中的排出量可达量可达30，000~50，000国际单位，约等于3mg。

此后逐渐下降，到妊娠第18周降至最低水平、分娩后4天左右消失。

HCG是一种糖蛋白，由α-链和β-链两个亚基100个氨酸组成，分子量47，000~59，000。

其核心部分由氨基酸组成，以共价键与寡糖链相合，此寡糖链占HCG分子量的31%，由甘露糖、岩藻糖、半乳糖、乙酰氨基半乳糖、乙酰氨基葡萄糖组成，在糖链的末端有一带负电的唾液酸，每个HCG分子中约含有凹个分子的唾液酸。

绒膜促使激素的性状呈白色或类白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有机溶剂，PI为3.2~3.3。

干品稳定，稀溶液不稳定。

2.生产工艺

（1）工艺路线：

（2）工艺过程

①吸附粗品

取用盐酸调节pH4~5的孕妇尿，加苯甲酸乙醇饱和液（按孕妇尿：

苯甲酸乙醇饱和液：

乙醇=1：

0.075：

5的配比）搅拌1h，静置2~3h，过滤，弃去上清液，得吸附物。

用95%乙醇在搅拌下洗脱HCG，直到苯甲酸全部溶解为止，即有絮状沉淀物产生，静置过夜，离心，沉淀物用95%乙醇和丙酮洗涤、干燥即得粗制品。

②提取

HCC粗制品加入10倍量4℃的1/15mol/L、pH4.8醋酸盐缓冲溶液中，搅拌4h，充分提取HCG，离心，取上清液。

沉淀再加上述缓冲液搅拌提取2h，离心，合并两次上清液。

沉淀弃去。

③透析

上清液兑水在5℃以下透析，过夜。

其间不断搅拌，使无机离子透析完全。

④离子交换层析

CMSepharose柱预先用0.01mol/L醋酸盐缓冲溶液平衡，透析内液上柱。

⑤洗涤

交换柱依次用pH4.8、0.01mol/L醋酸盐缓冲液和pH5.9、0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗涤。

⑥洗脱

洗涤后的交换柱用pH8.5、0.2mol/L醋酸盐缓冲溶液洗脱，至第Ⅲ个生物活性峰完毕。

⑦干燥

洗脱液-30℃冷冻干燥，得HCG精品。

比活3，000~4，000国际单位/mg蛋白质。

⑧再纯化、溶解透析

取HCG精品溶于100倍蒸馏水中，在5℃以下对1000倍pH6.8、0.5mol/L磷酸盐缓冲溶液进行透析，其间透析外液更换3次。