方法.docx
《方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《方法.docx（36页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
方法
药理学实验指导
药理学实验须知
1.课前预习实验指导，明确实验目的和要求，充分了解实验方法、步骤及原理，以避免在实验过程中出现忙乱和错误。
2.进入实验室，必须穿白大衣，实验前首先检查仪器、药品等实验器材是否与实验指导相符，然后仔细阅读实验指导。
根据实验内容进行小组内分工，尽可能使每位同学都有操作机会，每一实验过程全组同学都能看到。
3.必须严格地、准确地按照指导中的实验方法进行实验操作。
药品用后必须用原瓶塞塞好，拿过动物后必须将笼门随手关牢，玻璃器皿及注射器必须轻洗轻放。
注意节约药品、爱护器材及动物。
4.进行实验时，应认真、仔细、耐心；实验记录必须正确可靠。
根据每次实验课的要不同要求，写好实验报告。
5.实验室必须保持安静、整洁。
6.实验完毕，必须将器材洗净擦干，放在原来位置，每小组轮流负责搞好实验后室内卫生。
死亡动物放在指定地点；存活动物放入指定笼门。
并随手关好自来水开关，拔去仪器电源插头。
离开实验室前，应关灯，关好窗户。
药理学实验基本知识与技术
一、实验动物的捉拿、固定及给药方法
1.小白鼠：
右手抓住鼠尾，放在台上或鼠笼盖铁丝网下，然后用左手拇指沿其背部向前抓住其颈部皮肤，并以左手的小指和掌部夹住其尾固定在手上。
另一抓法是只用左手，先用食指和拇指抓住小鼠尾尖，后用手掌及小指夹住其尾巴，再以拇指及食指捉住其颈部皮肤。
前一方法易学，另一方法稍难，但便于快速捉拿给药。
小鼠灌胃（PO）法：
将小鼠固定后，右手持装有灌胃器的注射器，自口角外插入口腔，沿上颚插入食道。
如遇阻力，可将注射器拔出再插，以免穿破食道或误入气管，造成动物死亡。
灌胃容量一般为0.1—0.2ml/10g，不超过0.5ml/只。
小鼠皮下注射法：
两人合作，一人一手抓住小白鼠头部皮肤，另一手抓住鼠尾。
另一人注射药物。
注射部位在背部皮下组织。
如一人操作时，左手抓鼠尾，让鼠爬在铁丝笼上，右手将抽好药液的注射器针头插入背部皮下组织。
如一人操作时，左手抓鼠尾，让鼠爬在铁丝笼上，右手将抽好的药液的注射器针头插入背部皮下将药注入。
注射量不超过0.5ml/只。
小鼠腹腔注射法：
左手持鼠，右手持注射器从下腹左或右侧（避开膀胱）朝头部方向刺入，宜先刺入皮下，经2—3mm再刺入腹腔，此时针头与腹壁的角度约45度。
针尖插入不宜太深或太近上腹部，避免刺破内脏，注射量一般为0.1—0.25ml/只。
小鼠尾静脉注射法：
将小鼠置于固定器内，使其尾巴露出，用70%酒精擦尾部，或将鼠尾浸入50℃热水中。
待尾部静脉扩张后，左手拉尾，右手进针。
注射容量不超过0.5ml/只。
2.兔：
用手抓起它脊背近后颈处皮肤，抓的面积越大其持重点越分散。
如家兔肥大，应再以另一手托住它的臀部，将持重点承托于手上。
将兔作仰卧位，一手仍抓住颈部皮肤，另一手顺其腹部抚摸至膝关节，压住关节。
另一人用绳带捆绑四肢，使兔腹部向上，固定在兔手术台上。
头部则用兔头固定夹固定。
兔灌胃法：
二人合作，一人固定家兔于两膝之间，一手固定兔头，使头部后仰，另一手将开口器插入兔口，并向后翻转数次，使兔舌伸直并压在开口器下面。
另一人将胃管从开口器中央孔也插入口内缓慢插入食道和胃。
插管时感觉顺利，动物不挣扎，也不屏气，表示胃管在胃内，为慎重起见，将胃管外端放入水中，当兔呼气时，未见气泡出现，即证实胃管在胃内，然后将药液缓缓经胃管注入。
灌胃容量一般为10ml/kg。
兔耳静脉注射法：
两人合作，一人固定兔身及兔头，一人将兔耳后缘之毛拔去，显露耳缘静脉，用手指轻弹耳壳，使血管扩张。
助手左手指压住耳缘静脉根部，待血管明显充血后，将抽好药液的注射器从静脉近耳尖处插入血管。
针头刺入血管以后，以左手拇指和食指将针头与兔耳固定，不让针头滑动。
放开耳根静脉手指压力，即可注放药液，若针头确实在血管内，则推药通畅无阻力，并见血液被药液冲走，如沆入皮下则耳壳肿胀、推注不顺，需拔出重新注射。
注射守毕，用手指按在针眼上，然后将针尖抽出，并继续用手指或加棉球轻轻按压2—3分钟，以防出血，注射量0.5—2.5ml/kg。
3.大白鼠：
以左手或持夹子抓住鼠尾，左手戴防护手套或用厚布盖住鼠身作防护，握住其整个身体，并固定其头骨，防止被咬伤，注意不要握力过大，勿捏其颈部以免窒息致死，根据实验需要可指定于大鼠固定笼内或用绳绑其四肢，固定于大鼠手术台上。
大白鼠灌胃、腹腔注射、静脉注射均可一人操作，基本方法与小鼠相似。
也可将大鼠腹股沟切开，从股静脉注射药物，也可从外颈静脉插管给药（麻醉后）。
4.豚鼠：
以右手抓住豚鼠头颈部，将其两前肢挟在豚鼠头与右手拇指和食指之间，整个抓住颈胸部（不要抓得太紧以免窒息），左手抓住两后肢，使腹部向上，而后进行操作。
豚鼠腹腔注射可二人操作，一人固定，将动物置于仰卧位，另一人注射。
雄性豚鼠可作阳茎背静脉注射给药。
5.狗：
绑狗嘴法：
先将绳子绕过狗嘴，在嘴上部打一活节，再绕到嘴下部打结，最后绕到颈后打结固定，才能避免绳子脱掉。
固定法：
急性实验时，将麻醉狗固定在手术台，四肢绑上绳。
前肢的两条绳在狗背后交叉，然后将对侧前肢压在绳下面，再将绳拉紧，缚在手术台边缘楔子上。
头部用背夹或绳扎其颌骨固定之。
狗静脉注射法：
常用的注射部位是后肢小隐静脉，该血管从后肢外踝后侧走向外上侧，也可用前肢静脉，在脚爪上方背侧正前位，静注时先局部剪毛，一人用手抓紧腿使血液回流受阻，此时可看出血管走向。
另一人随即将药液注入静脉。
二、药理实验设计的基本原则
重复：
重复的目的是看实验结果的重现率，重现率越高，实验的可信性就越好。
重现率在95%以上者，可认为实验相当可靠，两药平均值或效率的差别有显著意义，并用“P（机率）<0.05”来表示，意即指：
“不能重现的可能性小于5%”，如重现率在99%以上者可信为实验非常可靠，可做出“差别有非常显著意义”的结论并用“P<0.01”来表示；重现率小于95%者，说明重复同样实验100次，将有5次以上机会出现相反的结果，固此认为两药的差别可能是个体差异而造成的，统计学上可做出“两组差别并无统计学意义”的结论，并以P>0.05来表示。
但这种结论并不意味着两组无差别。
一般可在检查原因后，改进实验条件，增加实验例数，还有可能提高实验的重现率，达到统计学上有显著意义的水平。
实验结果的实际价值，不但需从统计结论来看，还应从专业角度来看。
在统计学上都是达到P<0.05的水平，实验例数多者并不一定比例数少者更有价值。
但为了作出正确的结论，根据实验设计中的重复原则，对各类动物的重复数，可提出一个大体范围，以供实验设计参考。
（1）一般情况下选取的重复例数：
在动物实验时，小动物（鼠、蛙）每组10—40只；中等动物（豚鼠、兔）每组8—30只；大动物（猫、犬）每组5—20只。
（2）根据以住资料估算实验例数：
①以百分率为指标的实验：
已知A药有效率是P1，B药的有效率是P2，则欲以80%把握取得P<0.05水平的每组例数可用下估算
1－（P1+P2－1）2
n（80,0.05）=5.25×----------------------
（P1－P2）2
例如已知A药平喘率为90%，B药平喘率为60%（P1=0.9，P2=0.6），则：
1－（0.9+0.6－1）2
n（80,0.05）=5.25×-------------------=43.75
（0.9－0.6）2
即每组44例，共88例即可有80%把握取得P<0.05水平的结果。
②以均数为指标的实验：
两组均数对比实验时，可根据已知的两均数这差（D）和标准差（S），用下式估算出80%把握可得P<0.05水平的每组例数
S
n（80,0.05）=15.6×（--）2+1.6
D
例如已知某高血压动物模型，血压的均数及为180±33mmHg，现试用新降压药，以血压降低30mmHg（即降到150mmHg以下者）为有价值，应取的重复例数为
33
n（80,0.05）=15.6×（--）2+1.6=20.5
30
每组21例，共42例，即可有80%把握得到P<0.05水平的结果。
2.对照：
对照是比较的基础，没有比较就没有鉴别，也就谈不上科学性。
对照应符合“齐同可比”原则，除了所研究的因素（药物）外，其他条件各组也应一律“齐同”。
如动物的性别、年龄、体重。
一般健康状况等，也应基本一致，只有这样才能具备“可比性”。
所以实验设计必须设立对照组。
对照组的类型有以下三种：
（1）阴性对照：
包括①空白对照，即不给任何处理的正常动物作对照，较少用。
②假处理对照，即除不用被研究的药物外，对照组的动物重经受同样的处理，如麻醉、手术、注射不含药物的溶媒等。
这种对照的可比性好，较常用。
（2）阳性对照：
包括①标准品对照，即以典型药物划标准品作为对照，以便评定药物的作用强度。
②弱阳性对照，即以药效较弱的老药作为对照。
如果新药优于老药，并有显著意义，则可肯定新药的价值。
3．随机：
随机就是使每一个体在实验中都有同等的机会，随机遇而分组或接受处理。
随机可减少许多难以控制的干扰因素，消除偏差。
例如捉取小白鼠分组时，应按捉取顺序用抽签法决定分入何组，否则活泼敏捷的小鼠常是最后才被捉到，最后几组小鼠应比前面几组的耐受能力要强一些。
随机的方法与类型有以下几种：
三、实验动物随机分组法
数理统计学上，根据随机抽样的原则，编制了随机数目表，应用随机数目表代替抽签法，表中的数字都各自独立，全部数字无论从横行、纵行或斜行的顺序都是随机的。
因此使其用时可任自一个数目开始，可从左而右，亦可从右而左，可从上而下，也可从下而上，按顺序取得需要的数目，其结果比抽签更为理想。
1.安全随机法
（1）甲、乙两组安全随机法：
设有性别相同、体重在一定范围内的动物20只，试用完全随机法分成甲、乙两组：
先将动物分别称量体重，然后按体重从轻到重依次为1、2、3……20号。
在随机数目表中任自一数目开始，如自第三横第六纵列的数目56开始自左向右取20个数目，按动物编号和随机数目表上查得的20个数目对应排列，并令随机数目属于单数的归于甲组，属于双数的归于乙组，得下表格式：
这样列入甲组的动物有：
4、5、8、10、11、12、15、17共8只；列入乙组的有1、2、3、6、7、9、13、14、16、18、19、20共12只；为使两组动物数相等，须把乙组中的2只改为甲组，但乙组中12只动物，哪2只应改为甲组？
仍需用随朵法来决定。
可接着使用前面用过的随机数目，前面已用过20个数字，第三横行第20数字为10，本行已无数字，故应顺序在第四行第1纵列开始算21和22个数字为12和56，为使乙组中12只动物都有改为甲组的机会，故用12除12得余数为0，因动物中无0号，故后推一个数目为56和85，用12除56得余数8，则应将乙组中第8只动物改为甲组，12除85得余数为1，则应将乙组中第1只动物改为甲组。
以此类推。
（2）甲、乙、丙三组安全随机分组法：
设性别相同、体重在一定范围内的健康大鼠18只，试用完全随机分为甲、乙、丙三组。
先称量体重，按体重从轻到重依次编为1、2、3……18号，现从随机数目表上第六横行第一纵列的数目16开始，自上而下依次取18个数止，并与动物编号对应排列。
为使每一只动物有同样分到甲、乙、丙三组的机会，可把每一随机数目都除以3，余数1则归甲组；余2则归乙组；如除尽则归丙组，如随机数目不足3，由比随机数按余数归组。
如下表：
以上分配到甲组的有1、9、10、11、14、15共6只；分配到乙组的有7、8、12、16、17共5只；分配到丙组的有2、3、4、5、6、13、18共7只动物。
为使三组动物数目相等，应将丙组动物调出一只给乙组，应调丙组中哪一只动物，仍用随朵法，随机表上第六横行，第一纵列自上而下取了18个数目，可继续向下取一个数目，27个下是00，为了使丙组的7只动物都有机会进入乙组，可用7除00，仍得0，因丙组动物中无0号，故后推一个数字为29，29除以7得余数为1，则将丙组中第1只动物调到乙组去。
完全随机法使受试动物完全有均等的机会被分配到各组而不受任何固定因素的影响，但完全随机分配的结果，各组数目常不相等，而需要经过调整，平均体重亦有一定差别，是其缺点。
故此可采用下列分组法：
2.配偶设计随机分组法
在动物实验中，常把同窝同性别及体重极相似的两只动物人为配偶组（或配伍组），每个配偶组的动物数应与处理组相同，用随机法把动物分配到各级一内，分配完后，各组内动物数相等，不需再调整组别，各组体重相近，从而减少实验误差。
设有动物20只，同性别，试按配偶组设计分为两组。
先将动物称量体重，按体重从轻到重把体重相同或相近的动物每两只依次编为一个配偶组，计得10个配偶组，每个配偶组包含每一和第二两只动物，这两只动物应归入甲组或乙组，仍用随机法确定。
试在随机数目表第五横行第15组列90开始从右向左取10个数目，与10个配偶级号对应排列，令随机数目单数使配偶组第一个动物分配到甲组；双数使配偶组第一个动物分配到乙组，如下表：
这样甲、乙两组中，每组都有一只极相似的动物，如以体重论，两组动物平均原始体重基本相同。
3.随机单位组设计分组法
将上述配偶组的动物数扩大到三或更多时，应成为随朵单位设计，随机单位组的意义是指配伍组中的每一只动物为一实验单位。
把这些单位以随机的方法分配到各组中去。
设有性别相同的小鼠40只，分为甲、乙、丙、丁四组，按体重从轻到重依次编号为1、2、3……40号，使1—4号为一配伍组；第5—8号为一配伍组，余类推。
在随机数目表上第二横行第一纵列97开始自左向右。
每抄三个数字留一空位，如下表第二横行所示。
然后将同一配伍组中的三个随机数，依次以4、3、2除之，若第一位余数为1归甲组，余数2归乙组，余数3归丙组，除尽归丁组。
上例第三配伍组（9—12号）中，第9号鼠随机数目的余数是1，故分配在甲组，第10号鼠随机数目余数为2，因甲乙被用去，所乘的乙、丙、丁三组中，丙列在第二，故分配到丙组，第11号鼠余数为1，因甲已被用去，丙也被用去，所剩的乙、丁二组中，乙列在每一，故把11号鼠分配到乙组，12号鼠必须分配在丁组，以使该配伍组的小鼠在每个组中都分配1只，其余各配伍组均按此法分配。
这样分组的结果，每组中都可随机分配到一只体重（或其它因素）极为近似的动物，各组动物的平均体重基本相同。
动物数也一样。
各组分配的动物号数如下：
甲组 1、8、9、15、18、22、27、29、35、40
乙组 2、6、10、16、20、24、28、30、34、37
丙组 4、5、11、14、19、21、25、32、36、38
丁组 3、7、12、13、17、23、26、31、33、29
四、药物浓度表示法及剂量换算法
药物的重量以“克”为基本单位，容量以“毫升”为基本单位，这是衡量的公制，现将公制列表如下：
药物浓度是指一定量液体或固体制剂中所含主药的分量。
常用以下几种表示法：
1．百分浓度：
是按每100分溶液或固体制剂所含药物的分数来表示浓度，简写为%。
由于药物和溶液的量可以用体积和重量表示，因而有三种不同的表示百分浓度的方法：
（1）重量/体积（W/V）法：
即每100毫升溶液中含药物的克数，如5%葡萄糖即每100毫升含葡萄糖5克。
此法最常用，不加特别注明的药物%浓度即指此法。
（2）重量/重量（W/W）法：
即每100克制剂中含药物克数，适用于固体、半固体药物，如10%氧化锌软膏100克含氧化锌10克。
表1—1
公制重量与容量表
单位名称
简写符号
折算
注
微克
ug（r）
1/1000毫克
/
毫克
mg
/
克
g
1000毫克
0.3旧市钱
千克（公斤）
kg
1000克
2市斤
毫升
ml
1/1000升
/
升
l
1000毫升
/
（3）体积/体积（V/V）法：
即100毫升溶液中含药物的毫升数。
适用于液体药物，如消毒用75%乙醇，即为100毫升中含无水乙醇75毫升，相当于W/W法70%乙醇。
2.比例浓度：
常用于表示稀溶液的浓度，例如1:
5,000高锰酸钾溶液是指5,000毫升溶液中包含高锰酸钾1克；1:
1000肾上腺素即0.1%肾上腺素。
3.克分子浓度（M）：
一升溶液中所含溶质的克分子数称为该溶液的克分子浓度。
如0.1MNaCl溶液表示100ml中含NaCl5.844克（NaCl分子量58.44）。
4.克当量浓度（N）：
一升溶液中含有溶质的克当量数称为该溶液的克当量浓度。
如1NH2SO4表示1000ml中含49gH2SO4（H2SO4的分子量为98）。
剂量换算：
（1）动物实验所用药物的剂，一般按mg/kg（或g/kg）计算，应用时须从已知药液浓度换算出相当于每公斤体重应注射的药液量（ml），以便于给药。
例：
小白鼠体重18g，腹腔注射盐酸吗啡10mg/kg，药浓度为0.1%，应注射多少容量（ml）？
计算方法：
0.1%的溶液每毫升含药物1mg，与剂量10mg/kg相当的容积为10mg/kg小白鼠体重为18g，换算成公斤为0.018kg，故10ml×0.018=0.18ml。
小白鼠常以mg/10g计算，换算成容积时也以mg/10g计算，较为方便，上例18g重小鼠注射0.18ml，相当以0.1ml/10g，再计算给其它小白鼠药量时很方便。
如20g体重小白鼠，给0.2ml，以此类推。
（2）在动物实验中有时需根据药物的剂量及某种动物给药途径的药液容量，然后配制相当的便于给药。
例：
给兔静注苯巴比妥钠80mg/kg，注射量为1mg/kg，应配制苯巴比妥钠的浓度是多少？
计算方法：
80mg/kg相当于1ml/kg，因此1ml药液应含80mg药物，现算成百分浓度1:
80=100:
x，x=8000mg=8g，即100ml含8g，故应配成8%的苯巴比妥钠。
习题：
（1）给体重2.2kg的兔注射30mg/kg的尼可刹米，注射液浓度为10%，应注射多少毫升？
（2）大白鼠口服双氢氯噻嗪剂量为5mg/kg，规定灌胃所需药液量为2.5ml/100g，应配制的浓度是多少？
（3）硫喷妥钠注射剂每支0.5g，兔体重1.8kg，静注硫喷妥钠剂量为100mg/kg，容量为1ml/kg，该药0.5g应配成多少ml?
注射的药量是多少ml?
药理学实验
一、清醒动物实验
实验一、戊巴比妥钠半数有效量（ED50）和半数致死量（LD50）的测定
ED50是标志药物效价的一个参数，它是指在一定的实验条件下，一群动物用药后，约半数动物出现疗效的剂量。
LD50则是使半数动物死亡的剂量，它是ED50的一个特例。
为了对药物的毒性和疗效有一个较全面的考虑，可计算药物的治疗指数，治疗指数=LD50/ED50，比值越大就越安全。
求ED50和LD50的实验方法原则上相同，这里只介绍的LD50求法。
ED50和LD50均是以质反应为指标的。
如以最小致死量为横坐标，动物死亡累积百分率为纵坐标，可绘成“长尾”型曲线；如剂量改为对数值，则可绘出对儿的“S”型曲线。
该“S”型曲线向心对称，对称中心纵坐标为50%死亡率，横坐标为logLD50；该曲线两端平坦，中间坡度大，可以看出，中值剂量的死亡率变化很大，而两端死亡率变化很小，故用LD50来表示毒力（或用ED50来表示效力）比用LD50更为灵敏、精确，且误差也小。
[目的]测定戊巴比妥钠对小白鼠的ED50、LD50及其治疗指数，并了解其意义。
（一）戊巴比妥钠半数致死量（LD50）的测定
[材料]
器材：
注射器1ml 5支、5ml 2支
烧 杯5ml 5个、50ml 2个
鼠 罐10个
鼠笼10个
药品：
戊巴比妥钠
动物：
小白鼠50只
[方法]
1．预试0%及100%估计致死量（Dn、Dm）
将戊巴比妥钠配制成不同浓度的一系列药液。
在预试中以0.1ml—0.2ml/10g体重腹腔注射，求出一次给药后24小时死亡率为0%的最大剂量（Dn）和100%的最小剂量（Dm）。
假设预试结果求得戊巴比妥钠Dn值为49mg/kg，Dm值为100mg/kg。
则可在此范围内测定半数致死量（LD50）。
2．选择合理的剂量分组方案
经预试找到Dm和Dn值后，即可在此剂量范围内，按等比级数分成4—6个剂量组，并按下式计算各组剂量的公比（1/k或r）及分组组数（N）：
公比r或1/k=（N-1）（Dm/Dn）1/2
或N=1-log（Dm/Dn）/logk
一般k值多采取0.75—0.85，不宜超过0.6—0.9。
设本次实验分为5组，经计算k值为0.837，故各组剂量为Dm、Dmk、Dmk2、Dmk3、Dmk4。
3．随机分组
选体重20g左右小鼠50只，雌雄兼用，每组10只。
先将雌雄分开，然后分别称重标色，每一档体重即为一个配伍组，可于不同部位标以某种颜色（如黄头、黄背等）。
根据随机单位组设计分组法（见实习讲义第5页）将配伍组中的每只小鼠随机分配到各组中去。
并将各组编号。
同时可制作色标用药表，如黄头（20g）用0.4ml，黄背（21g）0.42ml……，以后无论何组均按色标决定用药剂量。
4．配制等比药液—低比系列稀释法
本法简便、快速、准确，不易出错而且节省药物。
例：
已知Dmax=100mg/kg，Dmin=49mg/kg，r=0.837，动物体重为20±2g，每组10只，总重为200g，用药量为0.2ml/10g（腹腔）。
（1）一号药液浓度=最高致死量/用药液量
=100（mg/kg）/20（mg/kg）
=5mg/ml
=0.5%
（2）每组药液量=每组动物总重×用药液量
=200g×0.02ml/g
=4ml（为留有余地本例取5ml）
（3）一号药液需用量=每组药液量/（1－r）
=5ml/（1－0.837）
=30.67
（4）精确配制0.5%药液约31ml，从中吸取5ml为一号液，供第一组用药。
（5）配二号药液，在余下的26ml一号液中加生理盐水5ml，混匀后吸出5ml为二号液，依次类推，配出一系列比值1:
0.837的药液。
5．随机确定各组给药剂量
将动物组别按甲、乙、丙、丁、戊顺序排列，查阅随机数字表，以随机确定各组动物的给药剂量。
药液容量均为0.2ml/10g，腹腔注射。
6．观察指标 观察及记录24小时内各组小鼠死亡数目，并记录中毒症状及死亡原因，观察时应随时取出已死的动物。
[LD50的计算]
计算LD50有以下几种方法：
加权机率单位法、机率单位图解法、序贯法及点斜法（又称孙氏综合简捷计算法）。
其中孙氏综合简捷计算法简便、精确度较好，计算LD50的全部数据，不受目测者个人的影响，下面仅介绍该方法。
本法要求以下实验设计条件：
（1）各组动物数相等，
（2）组间剂量呈等比级数，（3）死亡率包括0%及100%至少要包括20%以下及80%以上。
表1—2
孙氏简捷计算法求用表
Dmg/kg
logD
动物数
死亡数
死亡率（%）
P2
（n）
（P）
49
1.69
10
59
1.77
10
70
1.85
10
84
升级会员 