乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达.docx

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乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

【摘要】目的:

研究乙型肝炎病毒（HBV）多表位基因的在原核载体中的克隆、游离表达及其产物的抗原性。

方式:

设计、并合成HBV多表位抗原基因BPT,克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA,进而转化Top10大肠杆菌,阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白（BBPT）,并用Westernblot方式初步检测该抗原蛋白的抗原性。

结果:

成功构建了原核表达载体pBAD/BPT,在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白BBPT,Westernblot检测显示该蛋白具有良好抗原性。

结论:

HBV多表位抗原基因的设计是成功的,其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性,可能是较理想的HBV医治性疫苗候选物。

【关键词】乙型肝炎病毒多表位医治性疫苗

　　乙肝是严峻危害人类健康的疾病之一,但目前的乙肝医治药物如IFNα和拉米夫定（lamivudine）疗效都不很理想。

医治性疫苗作为一种新的医治途经,是乙肝医治的理想方向之一。

咱们基于HBV表位的现有资料及前期工作,从HBV基因组中挑选出5个高度保守的HLA识别表位肽,串联拼接成乙型肝炎多表位抗原基因,并在大肠杆菌中取得克隆表达。

　　1材料和方式

　　材料质粒pBAD/gIIIA及大肠杆菌BL2一、Top10由南方医科大学分子生物学院保留。

T4连接酶购自Promega公司,IPTG及T载体购自天象人一辈子物工程公司,DNA标志物及限制性内切酶EcoRI、BamHI购自华丽生物工程公司,HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程公司。

复合多表位抗原基因片段的选择见文献［1］。

引物合成由上海生工生物工程公司合成,浓度2OD/管,工作浓度6μmol/L。

　　方式

　　HBV复合多价抗原基因的设计与合成参照文献［1］。

　　基因的克隆及阳性重组子的挑选依照pMD18T载体和pBAD载体的结构特点,设计两头带有NcoI和EcoRI酶切位点的引物:

5′GCCCATGGCAATGCAGTGGAACTCC3′（上游引入NcoI酶切位点）;5′GCGAATTCCACCCAGACGAGCTAC3′（下游引入EcoRI酶切位点）。

以CAG176为模板［1］,PCR扩增出乙型肝炎预防医治性疫苗基因BPT（扩增条件:

94℃变性5min,94℃1min,55℃50s,72℃55s,扩增30个循环,最后72℃延长10min）。

PCR扩增产物以冻融法割胶回收,与T载体15℃连接留宿后转入大肠杆菌DH5α,涂板培育,挑取单菌落培育,抽提质粒T/BPT,以NcoI和EcoRI酶切T/BPT及载体pBAD,冻融法回收小片段和大片段,二者15℃连接留宿,转化入大肠杆菌Top10,涂板培育。

挑取单菌落抽提质粒,以NcoI和EcoRI双酶切,并以该质粒为模板,上述引物和PCR扩增条件进行扩增,酶切产物及扩增产物均以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,以挑选出阳性重组子。

　　BPT原核表达载体的构建和表达挑选出的阳性重组克隆转化入大肠杆菌Top10,涂板培育,挑取单菌落在LB培育基中培育留宿后,按1％接种量接种到2mLLB培育基中,培育4h后加200G/L的阿拉伯糖至质量终浓度为g/L诱导表达,3h后收菌,取菌液mL,离心后去上清,沉淀中加入100μLpH=的TE和100μL2×SDS蛋白上样缓冲液,混匀后滚水中煮10min,取20μL上样,行150g/LSDSPAGE蛋白电泳。

　　蛋白的纯化利用SPSepharose阳离子柱层析纯化HiTrap,SPSepharoseHP5mL预装柱经20mmol/L、的缓冲平稳液,将透析液上SP柱,用20mmol/L、缓冲液及含1mol/LNaCl的TrisHCl缓冲液（）进行梯度洗脱并分步搜集洗脱峰。

　　Westernblot检测融合蛋白与HBV患者血清反映的免疫特异性Westernblot方式参照《分子克隆实验指南》第2版进行,一抗为BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清［2］,1∶20稀释。

二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG,1∶300稀释,DAB显色。

　　2结果

　　pBAD/BPT重组表达质粒的构建以CAG176为摸板,按材料和方式所示引物及扩增条件行PCR扩增出BPT基因。

扩增产物的20g/L琼脂糖凝胶电泳在400bp处可见扩增条带,如上述方式所述,该基因克隆入表达载体Pbad,行PCR鉴定可扩增出400bp片段（图1）,NcoI和EcoRI双酶切该质粒可切出400bp片段（图2）,与设计完全相符,成功构建了重组质粒pBAD/BPT。

　　图1重组质粒pBAD/BPT的PCR扩增图（略）

　　Fig1ThePCRamplificationofrecombinantpBAD/BPT

　　1,2:

ThePCRamplificationofdifferentrecombinantplasmids;3:

100bpDNAladder.

　　图2重组质粒pBAD/BPT双酶切鉴定图谱（略）

　　Fig2EnzymaticanalysisofpBAD/BPT

　　1:

RecombinantpBAD/BPTdigestedwithNcoI/EcoRI;2:

VectorpBADdigestedwithNcoI/EcoRI;3:

100bpDNAladder.

　　重组质粒在大肠杆菌中的表达重组质粒pBAD/BPT转入大肠杆菌Top10,挑取单菌落阿拉伯糖诱导表达,行SDSPAGE电泳,在Mr15000处见一表达带,符合设计分子量,空菌及空载对照皆无表达（图3）。

　　图3SDSPAGE（150g/L）电泳分析BBPT蛋白（略）

　　Fig3SDSPAGE（150g/L）ofBBPTexpressedin

　　1:

LysateofBL21withoutplasmid;2:

LysateofpBAD/BL21;3-5:

ExpressionofBBPTproteinindifferentrecombinanttransformants;6:

Lowmolecularweightproteinmarker.

　　表达产物的纯化SPSepharose为强、阳离子型互换树脂,其树脂基为X连接琼脂,吸附容量3～120g/L,是较为理想的互换树脂。

利用该层析柱透析平稳后上样,于1mol/LNaCl时期洗脱取得乙型肝炎多表位抗原蛋白,SDSPAGE分析显示,在Mr约15000处有一单一的蛋白条带,纯度可达90%。

取得较纯重组蛋白,命名为BBPT（图4）。

　　图4BBPT表达蛋白纯化图（略）

　　Fig4PurificationofBBPTprotein

　　1,2:

Thesecondelutionofsupernatant;3:

Lowmolecularweightproteinmarker;4,5:

Thefirstelutionofsupernatant;6,7:

PurifiedBBPTprotein.

　　Westernblot结果BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白,而不可识别空载体pBAD表达蛋白（图5）,提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性。

　　3讨论

　　乙型肝炎是严峻危害人类健康的病毒性传染病。

可是,以干扰素和核苷类似物为主的抗病毒药物医治,成效不尽人意。

免疫耐受是造成慢性乙肝病毒携带者呈持续病毒感染状态的要紧缘故之一,也是现有的抗病毒药物对慢性乙肝病毒携带者疗效不佳的要紧缘故。

医治性疫苗属于特异性主动免疫疗法,国内外的研究初步证明,医治性疫苗能够打破慢性乙肝病毒感染患者最要紧的免疫学反映紊乱,即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答免疫耐受状态［3］。

　　图5BBPT蛋白的SDSPAGE及Westernblot结果（略）

　　Fig5AnalysisofproductionofBPTinbySDSPAGEandWesternblot

　　1,3:

SDSPAGEofpurifiedBBPTprotein;2:

SDSPAGEofcontrolvectorwithoutexogenousgene;4:

Lowmolecularweightproteinmarker;5,7:

WesternblotofpurifiedBBPTprotein;6:

Westernblotofcontrolvectorwithoutexogenousgene.

　　咱们在连年表位疫苗研究的基础上,设计了预期同时具有预防和医治作用的HBV多表位疫苗基因,并在大肠杆菌BL21中表达和纯化出含外源蛋白和β半乳糖酐酶部份氨基酸的融和蛋白PBPT（Mr75000）［1］,可是融合蛋白在实际应用中存在着必然的缺点,因此咱们尝试在游离表达载体中pBAD中表达并纯化该基因序列的蛋白产物BBPT,Westernblot结果显示BBPT具有较理想的抗原性,BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白,而不可识别空载体pBAD表达蛋白,提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性,为该多表位疫苗应用于临床实践奠定了初步基础。

　　从进展趋势来看,乙肝病毒医治性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染专门是慢性乙肝病毒携带者医治研究领域的热点,它与现有抗乙肝病毒药物的联合应用,将成为一种新的医治方式。

DNA疫苗因其与宿主整合的危险性而受到应用限制,多肽疫苗虽已在实验研究中表现出理想的成效［4,5］,可是多肽合成价钱昂贵且无法再生。

咱们设计的HBV复合多表位疫苗基因,从理论上讲更符合机体抗HBV免疫机制,并在大肠杆菌中表达和纯化出具有特异性抗原活性的重组融合及游离蛋白,为HBV多表位医治性疫苗的研究奠定了初步基础。

【参考文献】

　　［1］骆利敏,李明,夏虎,等.乙型肝炎病毒多表位疫苗基因的设计、合成及表达［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2004,24（6）:

426-431.

　　［2］骆利敏,李明,夏虎,等.乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性研究［J］.细胞与分子免疫学杂志,2004,20（5）:

517-520.

　　［3］CohenJ.Vaccinegetanewtwist［J］.Science,1994,264:

503-505.

　　［4］VitielloA,IshiokaG,HowardM,etal.DevelopmentofalipopepetidebasedtherapeuticvaccinetotreatchronicHBVinfection［J］.JClinInvest,1995,95:

341-349.

　　［5］BrianD,Livingston,CrimiC,etal.ThehepatitisBvirusspecificCTLresponsesinducedinhumanbylipopeptidevaccinationarecomparabletothoseelicitedbyacuteviralinfection［J］.JImmunology,1997,159:

1383-1392.　　Fig4PurificationofBBPTprotein

　　1,2:

Thesecondelutionofsupernatant;3:

Lowmolecularweightproteinmarker;4,5:

Thefirstelutionofsupernatant;6,7:

PurifiedBBPTprotein.

　　Westernblot结果BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白,而不可识别空载体pBAD表达蛋白（图5）,提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性。

　　3讨论

　　乙型肝炎是严峻危害人类健康的病毒性传染病。

可是,以干扰素和核苷类似物为主的抗病毒药物医治,成效不尽人意。

免疫耐受是造成慢性乙肝病毒携带者呈持续病毒感染状态的要紧缘故之一,也是现有的抗病毒药物对慢性乙肝病毒携带者疗效不佳的要紧缘故。

医治性疫苗属于特异性主动免疫疗法,国内外的研究初步证明,医治性疫苗能够打破慢性乙肝病毒感染患者最要紧的免疫学反映紊乱,即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答免疫耐受状态［3］。

　　图5BBPT蛋白的SDSPAGE及Westernblot结果（略）

　　Fig5AnalysisofproductionofBPTinbySDSPAGEandWesternblot

　　1,3:

SDSPAGEofpurifiedBBPTprotein;2:

SDSPAGEofcontrolvectorwithoutexogenousgene;4:

Lowmolecularweightproteinmarker;5,7:

WesternblotofpurifiedBBPTprotein;6:

Westernblotofcontrolvectorwithoutexogenousgene.

　　咱们在连年表位疫苗研究的基础上,设计了预期同时具有预防和医治作用的HBV多表位疫苗基因,并在大肠杆菌BL21中表达和纯化出含外源蛋白和β半乳糖酐酶部份氨基酸的融和蛋白PBPT（Mr75000）［1］,可是融合蛋白在实际应用中存在着必然的缺点,因此咱们尝试在游离表达载体中pBAD中表达并纯化该基因序列的蛋白产物BBPT,Westernblot结果显示BBPT具有较理想的抗原性,BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白,而不可识别空载体pBAD表达蛋白,提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性,为该多表位疫苗应用于临床实践奠定了初步基础。

　　从进展趋势来看,乙肝病毒医治性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染专门是慢性乙肝病毒携带者医治研究领域的热点,它与现有抗乙肝病毒药物的联合应用,将成为一种新的医治方式。

DNA疫苗因其与宿主整合的危险性而受到应用限制,多肽疫苗虽已在实验研究中表现出理想的成效［4,5］,可是多肽合成价钱昂贵且无法再生。

咱们设计的HBV复合多表位疫苗基因,从理论上讲更符合机体抗HBV免疫机制,并在大肠杆菌中表达和纯化出具有特异性抗原活性的重组融合及游离蛋白,为HBV多表位医治性疫苗的研究奠定了初步基础。

【参考文献】

　　［1］骆利敏,李明,夏虎,等.乙型肝炎病毒多表位疫苗基因的设计、合成及表达［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2004,24（6）:

426-431.

　　［2］骆利敏,李明,夏虎,等.乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性研究［J］.细胞与分子免疫学杂志,2004,20（5）:

517-520.

　　［3］CohenJ.Vaccinegetanewtwist［J］.Science,1994,264:

503-505.

　　［4］VitielloA,IshiokaG,HowardM,etal.DevelopmentofalipopepetidebasedtherapeuticvaccinetotreatchronicHBVinfection［J］.JClinInvest,1995,95:

341-349.

　　［5］BrianD,Livingston,CrimiC,etal.ThehepatitisBvirusspecificCTLresponsesinducedinhumanbylipopeptidevaccinationarecomparabletothoseelicitedbyacuteviralinfection［J］.JImmunology,1997,159:

1383-1392.