常规细胞培养方法.docx

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常规细胞培养方法

常规细胞培养方法2012年03月08日11:

56:

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初代培养

原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂

仪器：

培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：

动物组织块

试剂：

1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培养法

1.准备：

取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2.布局：

点燃酒精灯，安装吸管帽。

3.处理组织：

把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4.剪切：

用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。

加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5.消化：

或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6.分离：

在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：

用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO23调整。

8.培养：

置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

初代组织块培养法

1.剪切：

把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2.摆布：

用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4.培养：

从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。

置温箱中静止培养。

待细胞从组织块游出数量增多后。

再补加培养液。

传代培养法

原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时

也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

材料和试剂

1.细胞：

贴壁细胞株

2.试剂：

0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3.仪器和器材：

倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

操作步骤

1.吸除培养瓶内旧培养液。

2.向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3.置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4.吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。

注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5.用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6.计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

无菌操作注意事项

1.操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。

试剂等瓶口也要擦试。

2.点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5.瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。

6.吸溶液的吸管等不能混用。

细胞培养的一般过程

准备工作

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。

取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。

如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。

机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。

取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。

取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。

如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。

如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。

细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。

过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。

细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。

每传代一次称为“一代”。

二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。

转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。

冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。

然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

细胞培养常见问题分析

1.冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，须立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。

另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？

除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3.可否使用与原先培养条件不同之培养基？

不能。

每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4.可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

不能。

血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。

来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5.何谓FBS,FCS,CS,HS?

FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS（calfserum）则是指小牛血清。

HS（horseserum）则是指马血清。

6.培养细胞时应使用5%或10%CO2？

或根本没有影响？

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。

当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。

7.何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

8.培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

9.附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？

应如何处理？

一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na。

第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

10.悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。

分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

11.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg（约1,000rpm），5–10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。

12.细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。

细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13.细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5–10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90–95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。

注意：

由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

14.DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissueculturegrade之DMSO（如SigmaD2650），其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。

若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。

15.冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一：

冷冻管置于4℃30~60分钟→（-20℃30分钟*）→-80℃16~18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。

冷冻保存方法二：

冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。

*-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16.细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1×106cells/mlvial，融合瘤细胞则以5×106cells/mlvial为宜。

17.应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。

主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。

严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

18.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

加入相应抗生素。

直接灭菌后丢弃之。

19.支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

不能。

除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

20.支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。

故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

21.CO2培养箱之水盘如何保持清洁？

定期（至少每两周一次）以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

22.为何培养基保存于4℃冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？

培养基保存于4℃冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。

而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。

培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。

若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。

23.各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？

不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。

24.购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。

建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

25.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：

培养基使用错误或培养基品质不佳。

血清使用错误或血清的品质不佳。

解冻过程错误。

冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。

悬浮细胞误认为死细胞。

培养温度使用错误。

细胞置于–80℃太久。

26.收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。

另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

27.如何选用特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。

在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。

总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIMV（12005）培养基（SFM）。

28.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？

它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。

脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。

L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。

L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

29.GlutaMAX-I是什么？

培养细胞如何利用GlutaMAX-I？

这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。

一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

30.什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：

中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。

研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。

为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。

由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

31.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

32.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？

使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。

建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

33.书上说，Hank‘s平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。

原因是什么？

Hank’s平衡盐溶液（HBS）和Earle‘s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？

HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles（2.2g/L）中比在Hanks（0.35g/L）中高。

碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。

Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。

如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。

如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

血清:

34.保存血清最好的方法?

建议血清应保存在-5℃至-20℃。

然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。

若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

35.如何解冻血清才不会使产品质量受损?

）

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。

但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

36.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。

但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

37.为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。

激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。

在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

38.有必要做热灭活吗?

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

39.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

这应该不会影响血清的质量。

推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

40.如何避免血清里沉淀物的产生?

解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20℃至4℃至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20℃至37℃），实验显示非常容易产生沉淀物。

解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

请勿将血清置于37℃太久。

若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。

温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

细胞培养常用试剂

器材与试剂

干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等

具体步骤

1.水：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。

需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

2.PBS（也可用于其它BSS，如：

Hanks，D-Hanks液的配制）：

主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗

溶解定容：

将药品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4-H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

用HCl或NaOH调PH到7.4。

移入溶液瓶内待消毒：

将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。

注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

3.胰蛋白酶溶液：

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：

D-Hanks液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

称取胰蛋白酶：

按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

用注射滤器抽滤消毒：

配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

4.0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液

称取胰蛋白酶粉末（1：

250）0.05g，EDTA0.02g，加入PBSA100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。

5.青、链霉素溶液：

所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

具体操作均在超净台内完成。

青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。

链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

分装于－20℃保存。

使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

6.RPMI1640：

溶解、调PH值、定容：

先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并加入培养基中）,充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。

然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。

最后定容至1000ml，摇匀。

安装蔡式滤器：

安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。

然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

抽滤：

配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。

通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

分装