逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究.docx
《逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究
逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究（展板内容）
一.作品名称：
逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究
二.作者信息：
白金瑞内蒙古农业大学农学院11级园艺
三.指导老师信息：
赵君：
理学博士，教授，博士生导师
研究方向：
马铃薯抗晚疫病机制和向日葵病害综合防控技术
霍秀文:
博士，教授，硕士生导师
研究方向：
蔬菜种质资源和育种
4.作品简介：
本实验以内蒙古马铃薯栽培品种夏坡蒂为材料，通过定性和定量的方法，研究拟南芥（Arabidopsisthaliana）小G蛋白AtRop1在三种逆境（盐、干旱、低温）胁迫下对细胞内部H2O2产生量的影响。
本实验是研究逆境胁迫下对马铃薯叶片组织处理，测定H2O2的含量变化来反映出小G蛋白AtRop1在逆境胁迫中所具有诱导产生H2O2含量的作用。
从实验结果可以看出在盐分、低温胁迫下转DN-Rop1基因马铃薯积累的H2O2含量随着时间的推移整体的趋势（图1,3）。
但是PEG胁迫处理后，转基因马铃薯中产生H2O2的量均低于对照（图2）。
这些结果说明了转基因马铃薯小G蛋白AtRop1可以通过激活细胞膜上的NADPH氧化酶进而调控H2O2的产生。
图1NaCl胁迫下马铃薯产生的H2O2含量分析图
1-10
CK
图2PEG胁迫下马铃薯产生的H2O2含量分析图
图34℃低温胁迫下马铃薯产生的H2O2含量分析图
一、引言
马铃薯为茄科植物是重要的粮食作物。
但是，每年因为干旱、低温、土壤盐渍化等不利因素严重影响马铃薯的产量。
在干旱胁迫下，植物的细胞膜会受到伤害,细胞膜透性增加,同时,细胞质膜的稳定性降低,光合速度下降，同化物的形成速率和形成量降低，植物的生长速度明显减慢。
土壤盐渍化也是现代农业所面临的主要问题之一，长时间高盐胁迫，影响着植物产量、蛋白质合成和光合作用以及能量代谢。
低温也是限制作物产量的重要环境因子之一，是危害农业生产的主要自然灾害之一。
H2O2是一种重要的信号分子，参与多种信号路径的传递，是细胞正常代谢的产物,生物和非生物胁迫促使植物细胞产生H2O2,H2O2的产生能诱导植物抗性基因表达和细胞程序性死亡等。
因此，许多研究聚焦于H2O2的产生，通过诱导H2O2产量激发一系列信号通路，从而增加植物的抗逆性。
本实验主要研究在不同逆境条件下，植物小G蛋白AtRop1对H2O2产量的影响作用，确定AtRop1在不同逆境条件下对H2O2产量的调控作用，为今后改良植物抗逆性提供理论依据。
（一）植物中逆境胁迫与H2O2的关系
植物逆境生理是研究植物在逆境条件下的生理生化变化及其机制。
对植物产生重要影响的逆境主要有干旱、低温、盐碱、环境污染等理化逆境，和病虫杂草等生物逆境。
干旱条件下，叶片伸展受到抑制、气孔关闭、减少CO2摄取量、增加叶肉细胞阻力、降低光合作用过程中相关酶活性、破坏叶绿素结构和降低叶绿素含量等,最终降低CO2的固定还原和光合同化能力,影响植物光合作用和光合速率。
干旱胁迫能破坏植物细胞膜，使作物细胞的结构和功能遭到破坏。
植物在长期生长过程中产生了自我防御机制，通过酶系统保护细胞膜免遭氧化伤害。
植物本身有一套行之有效的清除活性氧的抗氧化策略。
这些活性氧“清道夫”抗氧化剂包括过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、过氧化物酶POD，在逆境胁迫下，SOD、CAT和POD可加速H2O2清除，表现为保护效应。
各种保护酶协调一致，使作物体内自由基维持在一个较低的水平，从而避免活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）伤害。
在植物不同生育期，各种酶发挥的作用不同。
前人的研究结果也因所选作物种类、品种特性和干旱胁迫强度而异,尚未得出较为一致的结论。
但在在水分胁迫下引发的丙二醛（MAD）含量可以反映细胞膜伤害程度,而SOD酶活性可以减少脂质过氧化，稳定膜的透性。
植物的膜系统主要是由膜脂和膜蛋白组成的。
植物受盐胁迫时，体内会产生大量的氧自由基（ROS），从而引起膜脂的氧化伤害。
植物体内有抗氧化的过氧化酶系统，当受盐胁迫时，过氧化酶系统活动加强，以清除过多的活性氧。
盐胁迫下植物体内抗氧化防御系统由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如SOD、POD、CAT、ASA、GSH、类胡萝b素等，它们协同起作用共同抵抗盐胁迫诱导的氧化伤害。
在盐胁迫下，植物体内SOD等酶的活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关，而且在盐胁迫下，盐生植物与非盐生植物相比，其SOD、CAT、POD活性更高，因而更能有效地清除活性氧，阻抑膜脂过氧化。
低温是一个重要的环境因子，低温条件下使植物产生冻害和冷害，严重地影响植物的生长发育，导致产量和品质降低。
低温胁迫下，植物体内代谢反应的不平衡导致活性氧的大量产生，若未及时清除，ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤，进而导致细胞及组织死亡。
植物在逆境下胁迫下，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积使细胞内核酸，蛋白质等生物大分子氧化，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢的积累意味着植物受到伤害，但是，植物体内的防御酶（SOD、CAT、和POD）是植物体内重要的防御酶系统，可以清除H2O2。
（二）小G蛋白与H2O2的关系
1.小G蛋白调节H2O2产生
小G蛋白（smallGTPases）是近年来细胞信号转导的研究热点，包括Ras、Rho、Rab、Arf和Ran等5个亚家族。
植物中存在一种特殊的小G蛋白ROP（Rho-relatedGTPasefromplants）是Rho家族成员，在调控细胞生长发育及植物防御反应体系的建立等方面起重要作用。
研究表明ROPs参与植物的生长和发育等途径的调控，如在细胞极性建立、细胞发育与分化、激素传导以及在各种生物、非生物胁迫中起关键的调控作用。
植物体内ROP还可以调节H2O2的产生。
对于这一功能的研究最早开始于利用人的Rac2的抗体，研究植物与人Rac2（一种调节NADPH氧化酶的物质）同源蛋白的功能Kawaski通过在水稻中分别表达Rac1的激活型和非激活型突变CA-OsRac1和DN-OsRac1,发现它们分别能够促进和抑制由病原菌入侵而引起的H2O2的产生。
更有趣的是，由CA-OsRac1介导的H2O2的产生可以被DPI（NADPH氧化酶抑制剂）所抑制，表明NADPH氧化酶处于小G蛋白OsRac1的下游位置调控着H2O2的产生。
同样，在拟南芥和大豆的悬浮培养细胞中过量表达棉花的rop基因GhRac13和人的Rac1的显性突变体，也可以促进H2O2的产生。
Baxter-Burrell利用缺氧胁迫的方法，证明了拟南芥的ROP作为信号分子可以调节H2O2的产生即在缺氧条件下，Rops在拟南芥幼苗中被快速、瞬时地激活，导致依赖ROP的H2O2的产生和H2O2产生所依赖的乙醇脱氢酶基因（ADH）的表达。
在拟南芥中ROP调控H2O2的产生同样也能被DPI（NADPH氧化酶抑制剂）抑制，同时，ROP调控着ROS（Reactiveoxygenspecies）产生所依赖NADPH氧化酶的活性并对拟南芥的根毛的发育具有调控作用。
这些结果预示着植物中的ROP可以通过激活细胞膜上的NADPH氧化酶进而调控H2O2的产生。
2.ROP调节植物防御反应
近年来,在水稻、豌豆、烟草、玉米和大麦中的研究结果已经证明ROP-GTPase在植物防卫反应体系的建成过程中具有十分重要的作用。
在植物中也发现OsRac1介导的防御反应也有MARK类似物介入。
研究还发现ROS（H2O2）能诱导水稻MARK的激活,预示着OsRac1通过NADPH氧化酶调节ROS的产生,进而激活下游的MARK来调节植物的防御反应。
另外,在大麦和烟草的研究中也证明ROP参与了植物防御反应。
在拟南芥中过量表达从烟草中分离到的小G蛋白的同源物NtRop1可以使得细胞内H2O2水平升高,间接地预示着NtRop1在烟草的防御反应中也具有一定的调控功能。
以上这些结果都表明ROP参与并调节植物防卫反应的信号通路,但是不同的作物可能由于ROP下游的作用底物的不同从而具有不同的调节机制。
3.研究目的及意义
综上所述，逆境胁迫对植物的影响的研究已引起了人们的广泛关注，但在马铃薯上的应用还未见报道。
为此，本课题研究目的和意义在于通过对马铃薯幼苗用不同逆境胁迫条件处理，研究其与植物相关的生理生化指标即产生H2O2的含量的测定，探索逆境胁迫下AtRop1诱导马铃薯H2O2产量的研究，明确小G蛋白对马铃薯在逆境胁迫的作用，确定马铃薯的生存对最佳处理的选择，为确立马铃薯在不同环境下存活提供理论依据及有效防治措施。
这对于当前和长远马铃薯生产具有重要的实践意义，并为逆境胁迫对其他作物上的影响提供参考。
二、材料与方法
（一）实验材料
材料选用马铃薯试管苗夏坡蒂（转基因系品种编号1-6，1-7，1-10，非转基因系品种编号CK），将生长4-6周的生长一致的组培苗移栽出来进行营养液培养，4周后，选择健壮且长势相同的植株插置于玻璃瓶中，预培养一天后进行不同的胁迫处理。
（二）实验方法
1.逆境胁迫的处理
实验设置3个处理：
I：
100mmol/LNaCl为盐胁迫，II：
10%PEG为干旱胁迫，III：
4℃为低温胁迫。
将水培马铃薯进行胁迫处理，于0h（hour），12h，24h，36h，48h，72h，96h收集样品，每个处理2次重复。
2.过氧化氢含量的测定
（1）标准曲线制作
仪器和用具：
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
试剂：
100μmol/LH2O2丙酮试剂：
取30%分析纯H2O257μl，溶于100ml；2mol/硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
制作标准曲线：
取10ml离心管7支，顺序编号，并按（表1）加入试剂。
表1测定H2O2浓度标准曲线配置表
试剂（ml）
离心管号
1
2
3
4
5
6
7
10mmol/LH2O2
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4℃下预冷丙酮
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0
5%硫酸钛
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
浓氨水
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
3000r/min离心10min，弃去上清夜，留沉淀
2mol硫酸
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
待沉淀溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
（2）H2O2含量的测定
称取新鲜植物组织0.1g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
用移液管吸取样品提取液100μl按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000r/min离心10min，弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
向洗涤后的沉淀中加入2mol/L硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
结果计算：
植物组织中H2O2含量（μmol/gFW）=
C：
标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）；
Vt：
样品提取液总体积（0.1ml）；
V1：
测定时用样品提取液体积（10ml）；
FW：
植物组织鲜重（0.1g）。
3.DAB染色法
H2O2的检测采用联苯胺（3,3-'diaminobenzidine-HCl,DAB）染色检测法。
试剂：
配制1mg/mLDAB（PH3.8）溶液100ml10.1gDAB溶于100mL蒸馏水调至PH3.8。
DAB检测的具体方法如下:
剪取不同逆境处理48h后的马铃薯叶片,作为实验材料;将叶片放入1mg/mLDAB（pH=3.8）溶液中,室温下静置8h;用系列丙酮溶液进行叶片脱水处理,步骤为:
30%→50%→70%→80%→90%→100%,每30min,最后在100%的丙酮中放置12h,以彻底脱去叶片中的色素;0.1%考马斯亮蓝（G-250）染色5min,在OlympusAD-10型光学显微镜观察和拍照。
三、结果与分析
（一）标准曲线制作
表2H2O2含量测定的标准曲线数据
浓度次数
1
2
3
0
0.054
0.057
0.049
0.053333
0.1
0.126
0.1
0.111
0.112333
0.2
0.147
0.157
0.148
0.150667
0.4
0.236
0.227
0.237
0.233333
0.6
0.35
0.371
0.357
0.359333
0.8
0.434
0.433
0.44
0.435667
1
0.459
0.474
0.473
0.468667
图1H2O2含量测定的标准曲线
此图为过氧化氢含量测定的标准曲线，横坐标为H2O2含量值，纵坐标为分光光度值，函数关系式为y=0.4354x+0.0662。
可依据此函数计算出对应的H2O2含量。
（二）盐胁迫下马铃薯H2O2产生的量分析
经盐胁迫处理后的不同植株，进行H2O2含量分析，试验结果如下（表3，图2）。
从实验结果可以看出在盐胁迫下马铃薯样品中H2O2的含量从36h后随着时间的推移整体呈现上升趋势。
本实验中取马铃薯幼苗夏坡蒂转基因系品种编号1-6，1-7，1-10同夏坡蒂非转基因系品种编号CK做比较分析，0h时编号1-6，1-7，1-10品系产生的H2O2含量分别与编号CK品系产生的H2O2含量差异显著。
12h时1-6，1-10分别与CK表现差异不显著，而1-7与CK表现差异显著。
24h只有1-10与CK表现差异不显著。
48h只有1-6与CK表现差异不显著，而1-7，1-10分别与CK表现差异显著。
说明1-6产生H2O2含量的内源基因被剪接，影响了H2O2含量的产生，而1-7，1-10产生H2O2含量与CK表现差异显著说明盐分胁迫下诱导内源基因产生H2O2。
对照下图片（3）72h只有1-6与CK表现差异显著。
96h1-6，1-10分别与CK表现差异不显著，而1-7与CK表现差异显著。
表3NaCl胁迫下马铃薯产生的H2O2含量（μmol/g）
ck
1-6
1-10
1-7
0h
0.133
0.214
0.076
0.453
12h
0.282
0.363
0.191
0.615
24h
0.328
0.179
0.273
0.097
36h
0.076
0.122
0.041
0.199
48h
0.306
0.368
0.427
0.452
72h
0.328
0.676
0.257
0.191
96h
0.730
0.799
0.765
0.822
图2NaCl胁迫下马铃薯产生的H2O2含量分析图
CK
1-10
图3DAB染色（48h）
通过在48（h）对马铃薯编号CK和1-10叶片的处理，经照片效果分析1-10产生H2O2含量较多说明对盐胁迫更为敏感（图3）。
（三）干旱胁迫下马铃薯H2O2产生量分析
经干旱胁迫处理后的不同植株，进行H2O2含量分析，试验结果如下（表4）。
从实验结果（图4）可以看出在干旱胁迫下马铃薯样品中H2O2的含量从24h后随着时间的推移整体呈现上升趋势。
0h时编号1-6，1-10品系产生的H2O2含量分别与编号CK品系产生的H2O2含量差异显著，而1-7与CK表现差异不显著。
12h时1-6，1-7分别与CK表现差异显著，而1-10与CK表现差异不显著。
24h1-6，1-10，1-7与CK表现差异显著。
36h1-10与CK表现差异显著，而1-6，1-7分别与CK表现差异不显著。
48h只有1-10与CK表现差异不显著，而1-6，1-7分别与CK表现差异显著。
说明1-10产生H2O2含量的内源基因被剪接，影响了H2O2含量的产生，而1-6，1-7产生H2O2含量与CK表现差异显著说明盐分胁迫下诱导内源基因产生H2O2。
对照下（图5）。
72h只有1-10与CK表现差异不显著。
96h也只有1-10与CK表现差异显著，而1-6，1-7与CK表现差异不显著。
表4PEG胁迫下马铃薯产生的H2O2含量
ck
1--6
1--10
1--7
0h
0.478
0.248
0.299
0.452
12h
0.524
0.466
0.431
0.345
24h
0.629
0.282
0.214
0.260
36h
0.443
0.351
0.076
0.363
48h
0.823
0.493
0.409
0.351
72h
0.765
0.294
0.581
1.362
96h
0.788
0.719
1.201
0.799
表5PEG胁迫下马铃薯产生的H2O2含量分析表
1-10
CK
1-10
CK
图4DAB染色（48h）
H2O2是过氧化作用的产物之一，它的产生会加剧对细胞膜的损伤。
马铃薯是在干旱的环境下生长，逆境胁迫衰老过程中，细胞内H2O2代谢的平衡被破坏的程度随着时间加剧，故细胞内的H2O2含量的积累相对较多，导致了植株衰老。
（四）低温胁迫下马铃薯H2O2产生量分析
取出经低温胁迫后的不同处理植株，进行H2O2含量分析，试验结果如下（表5）。
经实验在不同时段对马铃薯叶片中H2O2含量的测定以及对马铃薯植株的观察可以知道在低温时会受到冷害，即影响植株生理形态的变化。
从实验结果可以看出在低温胁迫下马铃薯样品中H2O2的含量随着时间的推移整体呈现波动趋势，48h后1-10，1-7H2O2的含量上升较明显。
0h时编号1-6，1-10品系产生的H2O2含量分别与编号CK品系产生的H2O2含量差异显著，而1-7与CK表现差异不显著。
12h时1-6，1-10，1-7分别与CK表现差异不显著。
24h1-6，1-10，分别与CK表现差异不显著，而1-7与CK表现差异显著。
36h1-6，1-10，1-7分别与CK表现差异显著。
48h只有1-6表现差异不显著，而1-10，1-7分别与CK表现差异显著。
说明1-6产生H2O2含量的内源基因被剪接，影响了H2O2含量的产生，而1-10，1-7产生H2O2含量与CK表现差异显著说明盐分胁迫下诱导内源基因产生H2O2。
对照下图片（7）。
72h只有1-10与CK表现差异显著。
96h也只有1-10与CK表现差异显著，而1-6，1-7与CK表现差异不显著。
各个编号品系产生H2O2含量与CK表现差异不显著说明产生H2O2含量的内源基因被剪接，影响了H2O2含量的产生，各个编号品系产生H2O2含量与CK表现差异显著说明盐分胁迫下诱导内源基因产生H2O2。
表64℃胁迫下马铃薯产生的H2O2含量
ck
1--6
1--10
1--7
0h
0.433
0.328
0.282
0.491
12h
0.570
0.386
0.409
0.570
24h
0.260
0.466
0.443
0.237
36h
0.041
0.225
0.363
0.076
48h
0.053
0.156
0.765
0.650
72h
0.179
0.087
0.478
0.248
96h
0.673
0.512
0.879
0.758
CK
表74℃低温胁迫下马铃薯产生的H2O2含量分析表
CK
1-10
图5DAB染色（48h）
四、讨论
过氧化氢作为信号分子，对它在植物中的作用机制研究还有很大领域拓展。
本研究实验是通过对马铃薯叶片组织在逆境胁迫下处理，测定产生H2O2的含量来反映出对逆境胁迫做出的感应现象。
分析结果得出：
逆境胁迫处理对植株产生的影响的可以借助测定H2O2含量变化实现，在不同逆境胁迫下植株都会表现相应的反应，从实验结果可以看出在盐、低温胁迫下马铃薯样品中H2O2的含量随着时间的推移整体呈现上升趋势，NaCl胁迫处理不同时间内，转DN-Rop1基因马铃薯中产生H2O2量均高于对照，在12h达到显著，H2O2的产生量为对照的2倍；低温胁迫处理后，转基因马铃薯中产生H2O2量在36、48、72、96h表现为增加的趋势，且48h差异最大，转基因马铃薯中产生的H2O2为对照的8倍。
但是PEG胁迫处理后，转基因马铃薯中产生H2O2量均低于对照，24h产生量最少，仅为对照的1/3，说明AtRop1在不同的逆境胁迫对H2O2的产生量影响不同。
DAB染色结果表明，盐、低温胁迫48h后，转DN-Rop1基因的马铃薯积累较多的的H2O2；干旱胁迫48h后，转基因马铃薯与对照差异不大。
在逆境胁迫下植株反应敏感，由内源基因诱导叶片H2O2含量升高，影响植株生理代谢。
从这些结果分析中可以得出：
转基因马铃薯与非转基因马铃薯的内源基因对植物组织产生的诱导作用，可能是受到不同逆境胁迫后的伤害程度随即也就不同，反应敏感度表现在植物组织的H2O2的产生量的不同。
本研究对含有转基因的马铃薯品系在逆境胁迫过程中小G蛋白AtRop1诱导产生H2O2含量变化进行了研究,为深入了解马铃薯抗逆能力与产生H2O2含量变化之间的关系提供了有益的信息,但因涉及的基因数和使用的品种数都不太多,并不能代表转基因马铃薯小G蛋白AtRop1的诱导在抗逆中的全部情况,因此有关在逆境胁迫条件下AtRop1诱导马铃薯基因的表达、调控以及在抗逆中的作用有待进一步深入研究。
升级会员 