第4章 提取的基本理论 06.docx
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第4章提取的基本理论06
第4章生化活性物质提取技术
一、生化活性物质提取技术概述
提取是指目标生化活性物质与细胞固体成分或其他结合成分的分离，由固相转入液相或由细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程。
有固液提取和液液提取两种形式。
固液提取是指被提取物在胞内呈固相或与固体结合存在,提取时由固相转入液相的过程,多指初级分离阶段。
如：
中草药有效成分的水煮、醇提，海藻中多糖的水提醇沉等。
液液提取是指被提取物原来呈液相存在,提取时由某一液相转入另一互不相溶的液相过程，多贯穿于整个分离纯化过程。
如：
石油醚萃取果蔬粗提液的叶绿素,热苯萃取发酵液中扁桃酸等。
二、提取的原理和策略
提取的原理主要是根据不同物质在不同溶剂中溶解度的差异，达到目标生化活性物质与杂质的分离。
溶解度的差异用于分离制备有两个主要目的或策略:
①选择一个对目标生化活性物质溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使目标生化活性物质从混合组分中选择性地被分离出来。
如：
酵母醇脱氢酶的热变性提取，就是基于醇脱氢酶的热稳定性较高，而杂蛋白的热稳定性较低的特性，采用55℃高温去除热变性杂蛋白、而醇脱氢酶多处于上清液中的方法。
②选择一个对目标生化活性物质溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使目标生化活性物质沉淀或结晶析出。
如：
利用啤酒酵母泥提取脱氧核糖核酸（DNA）就是基于RNA的PI=2.0～2.5，而DNA的PI=4.2的特点，以及当提取体系中NaCl浓度为0.14mol/L和1mol/L时，DNA的溶解液分别为NaCl浓度为0.5mol/L时的11%和200%，而RNA的溶解度变化不大的特点。
通常可采用在pH=2.0的1mol/LNaCl体系进行粗提，然后调整体系pH=4.0～4.5且NaCl浓度为0.14mol/L进行PI沉淀。
三、提取的基本原则
通常，提取的原则主要包括如下四方面：
①极性原则，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
②酸碱性原则，碱性物质易溶于酸性物质，酸物质易溶于碱性物质；
③温度效应原则，一般地温度升高则溶解度升高；
④pH原则，pH值远离生化活性物质的等电点则溶解度升高。
四、提取的主要影响因素
在实际操作中，影响提取的主要因素有三个：
被提取物在提取溶剂中溶解度的大小，被提取物由固相扩散到液相的难易程度和被提取物在不同溶剂中的分配效应。
1.溶解度大小的影响：
生化活性物质溶解度大小主要与物质的自身分子结构，如基团的亲水平衡值基团的排列和偶极距等内因有关，外部影响因素主要是指所用溶剂如水、有机溶剂、稀盐缓冲液等理化性质、提取过程的温度、提取体系的pH值和离子强度等。
尤其要注意的是，对特定的生化活性物质而言，一种物质溶解度的大小与溶质和溶剂的性质息息相关，是溶质-溶质，溶质-溶剂，溶剂-溶剂三个相互作用力综合平衡的结果，在此，相互作用力主要有：
偶极-偶极相互作用，偶极-诱导偶极相互作用，弥散力，氢键，离子基团的静电作用等。
外部因素更多时候是通过该种综合平衡来实现对溶解度大小的影响。
2．固液萃取中扩散难易的影响：
被提取物由固相扩散到液相的难易程度主要遵从Fick扩散第一方程式：
dM=DFdC/（dXt），
其中D=kT/（µM）
式中：
dM-已扩散的物质量；D-扩散系数；F-扩散面积；dc-两相界面浓度差，为扩散过程的推动力；dx-溶质扩散的距离；t-提取时间；T-提取温度；µ-粘度；M-分子量；k-校正因子。
扩散的影响因素及其应用:
1）升温有助于扩散量dM的提高，但对生物大分子而言，升温是有一定限度的，否则将破坏其生理活性
2）粘度下降则扩散系数上升，导致扩散量dM的提高如：
提取蛋白质或酶时，加入核酸酶破坏大分子核酸或加入鱼精蛋白硫酸链霉素沉淀核酸，可使溶液粘度下降，dM提高
3）搅拌使已扩散的溶质迅速与溶剂混合，能保持两相界面的最大浓度差,则扩散系数上升
4）提高细胞破碎程度,则扩散面积F提高，dx下降，有助于扩散量dM的提高。
5）延长提取时间t，则dM上升
6）采用分次提取有助于提高dC，从而扩散量dM大为提高。
Xn=[K*W/（K*W+L）]n这点与分批洗涤过滤类似
①中成药胃得安有效成分胎盘活性蛋白因子的提取：
将人或动物胎盘破碎至一定程度，过16～30目筛，取胎盘颗粒于水提系统中，加入10倍量水，加入适量核酸酶，100rpm搅拌下，采用文火加热的方式提取2h，其间换水2～3次。
②酵母异柠檬酸脱氢酶的提取：
取微生物发酵液的新鲜面包酵母泥100g，加入20ml0.1mol/LNaHCO3溶液和适量的玻璃砂，于研钵中，冰浴下反复研磨，2000rpm离心10min后收集上清液，加入pH7.430mmol/LTrisHCl缓冲液配制的异柠檬酸，于37℃恒温水浴10min后，340nm测定酶活。
③酵母RNA的提取：
通常采用0.14mol/LNaCl溶液将组织匀浆后反复提取细胞质的核糖核蛋白，而留下含有DNA的细胞核物质。
然后用10％HAc调pH4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5mol/LNaCl，后用水洗涤沉淀，保持核糖核蛋白后溶解于0.5mol/LNaHCO3溶液中，离心，取上清液，调pH4.2，沉淀用0.5mol/LNaCl洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。
核糖核蛋白中蛋白质可用少量辛醇－氯仿溶液抽提去除，核核酸留在NaHCO3水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来
3.分配定率
在应用有机溶剂提取中，由于存在着物质在两个互不相溶的液相中能够由于存在着物质在两个互不相溶的液相中浓度分配问题，此时物质分离主要有分配定律起作用。
在恒温，恒压状态下的稀溶液，
（C1/C2）=K
C1：
分配达到平衡后溶质在上层有机相中的浓度
C2：
分配达到平衡后溶质在下水相中的浓度
K：
分配系数
注：
1、不同溶质在不同溶剂中的K值不同
2、混合物中各组分K值彼此接近时，分离较困难，只能在不断更新的溶剂中反复抽提才能分开
3、在生物大分子的制备中，分配定律的应用常与溶解度的影响因素结合加以运用。
如：
乙醇沉淀血浆蛋白
五、蛋白质和酶的提取
1．蛋白质的分类：
按功能分：
活性蛋白与非活性蛋白
✧活性蛋白：
酶、激素蛋白、运输和贮存蛋白、运动蛋白、防御蛋白、病毒衣壳蛋白、受体蛋白、毒蛋白和控制生长与分化的蛋白
✧非活性蛋白：
胶原蛋白，角蛋白
按结构和溶解度分：
见表4-1
从上表可以看出大部分蛋白质可溶于稀盐,稀碱,水,有机溶剂中.因而可用不同的溶剂提取,分离纯化蛋白质和酶.蛋白质和酶在不同溶剂中的溶解反应差异主要取决于:
分子结构性质和溶剂理化性质（T,PH,I等）
2．蛋白质的性质：
⑴蛋白质的两性解离和等电点：
（用于提取PH选择或PI沉淀）
蛋白质和氨基酸一样，既含有酸性的基团又含有碱性的基团，在特定的PH范围内能解离产生带正电荷或带负电荷的基团。
对于某一特定蛋白质来说，当在某一PH时，其所带电荷正负相等（及静电荷为0），这一PH值被称为蛋白质的等电点。
蛋白质处于等电点时具有一些特殊的性质，此时不仅是蛋白质的阴阳离子向相反的方向转化的转折点。
而且在此特定条件下，其电导率，渗透压，粘度及溶解度等性质均处于最低值，因此我们通常采用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。
注意：
等电点随溶剂性质，离子强度等因素而改变，中性盐的存在可以明显地改变蛋白质的等电点。
⑵蛋白质的胶体性质：
（用于透析、浓缩、电泳、层析）
凡质点大小在1-100nm范围内所构成的分散系统称为胶体，蛋白质分子的直径一般在2-20nm范围内，且蛋白质分子表面分布着亲水氨基酸的极性R基。
通常与水分子结合着，故蛋白质溶液是一种亲水基团。
蛋白质溶液具有丁达尔效应，布朗运动，膜半透性和电泳现象等性质。
而后两个性质常用于蛋白质的分离、提取、测定中。
⑶蛋白质的沉淀作用：
（用于沉淀分离、结合PH）
天然蛋白质溶液保持稳定的亲水胶体性质，其稳定性取决于：
水化作用（水化膜的存在，能防止蛋白质分子相互碰撞而聚集）和电荷的排斥作用（两性解离，同性电荷相互排斥而使蛋白质无法聚集）。
当改变蛋白质的质点大小，电荷情况和水化作用的强弱，将破坏蛋白质的稳定性，蛋白质就从溶液中沉淀出来，这就是蛋白质的沉淀作用（precipitation）
因此，我们在生物大分子的分离纯化中，常利用蛋白质的沉淀作用来分离和制备蛋白质和酶。
如采用等电点沉淀法分离牛奶酪蛋白。
⑷蛋白质的变性作用：
（可用于选择性变性沉淀除杂质）
当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响后，由氢键，盐键等次极键维系的高极结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质，物理化学性质改变。
这种现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）
蛋白质的变性作用的影响因素包括：
1）物理因素：
加热，紫外线，X射线，超声波处理
2）化学因素：
强酸，强碱，尿素，乙醇，TCA
变性特点：
变性蛋白质的理化性质均发生改变，最显著的是溶解度溶解度降低，粘度增大，分子扩散速度增大，渗透压降低，等电点改变，生物活性降低或丧失，易被酶水解等。
因此我们在制备酶制剂或具生物活性物质使防止蛋白质变性的发生。
变性原因：
由于分子内部的结构发生改变所致。
变性后，分子内部的氢键被破坏，蛋白质分子就从原来有秩序的紧密结构变为无秩序的松散结构，即蛋白质的变性是由于二级以上的空间结构发生改变或被破坏所致。
变性作用并未引起一级结构的破坏（即肽键不被破坏）。
因此变性后的蛋白质在结构上虽然有改变，但其组份及分子量没有改变。
⑸蛋白质的颜色反应：
蛋白质分子中存在某些特殊的氨基酸，他们可与多种化合物作用产生各种颜色反应，这些颜色反应可作为蛋白质的定性定量测定。
重要的颜色反应如：
✓双缩脲反应，
✓米伦反应
✓黄色反应
✓乙醛酸反应
✓茚三酮反应
✓酚试剂反应
✓萘酚-次氯酸盐反应
3、蛋白质的提取方法：
（1）、水溶液提取，如表示：
（2）、有机溶剂提取：
如表示：
（3）、从细胞膜上提取水融性蛋白质和酶
◆膜上蛋白质和酶的存在状态：
a）在膜面上与膜成分联系疏松
b）为膜的成分之一，或与膜成分紧密结合
◆提取方法
c）对结合较松的经充分破碎细胞，在一定PH范围的稀盐溶液中提取：
如：
线粒体上的细胞色素C，采用PH＝4的盐酸或等渗NaCl液
d）对结合较牢的可以采用化学处理：
Ø浓盐或尿素提取：
2M浓度即抽取>=27％的膜蛋白，但易变性
Ø碱溶液：
PH＝11约抽取40～50％的膜蛋白
Ø金属螯合剂：
EDTA可使蛋白质释放出来，因为蛋白质以金属离子与膜成分结合
Ø有机溶剂：
使用乙醇、吡啶、正丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮制成丙酮粉，是提取脂蛋白及其组分最常用方法之一。
如：
碱性脂酶
Ø去垢剂处理：
1）弱离子：
脱氧胆酸盐、胆酸盐、溶解性小、温和性好
2）强离子：
SDS溶解性好，温和性差
3）非离子：
Tritonx-100、Tween溶解性小，温和性好
该法目前广泛用于膜上水溶性蛋白和脂蛋白的提取，通常溶度为1％，选择时考虑去垢剂的溶剂能力和温和性.
酶水解蛋白的脂蛋白：
加入酯酶或磷酸酯酶。
如：
细胞色素C也可以用超声波振荡
六、核酸的提取：
1．分类：
RNA：
A，G，C，U，磷酸，核糖
DNA：
A，G，C，T，磷酸，脱氧核糖
2．核酸的性质：
⑴溶解性：
DNA和RNA均是极性化合物，一般地，它们均微溶于水而不溶于乙醇等有机溶剂，但它们的钠盐比自由酸易溶于水。
DNA和RNA在生物细胞内大多数与蛋白质结合成核蛋白，其溶解度的影响因素有：
溶液的盐浓度：
DNA蛋白的溶解度在低溶度盐溶液中随盐浓度的增加而增加。
在1MNaCl溶液中溶解度比在纯水中高2倍，而在0.14M的NaCl溶液中溶解度最小，仅为纯水中的1％。
RNA蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在在0.14M的NaCl溶液中溶解度较大。
因此，在核酸的提取中，常用改变盐浓度的方法分别提取这两种核蛋白，然后再用蛋白变性剂（如十二烷基硫酸钠）去除蛋白质。
PH值:
DNAPI=4.2
RNAPI=2.0-2.5
因此,在核酸的分离和制备时,可用调节溶液的PH值,使二者达到分离的目的.
⑵核酸及其组分的两性性质:
核酸和核苷酸既有磷酸基（呈酸性）,又有氮碱基（呈碱性）,属两性电解质.
核酸分子种磷酸残基解离的pKa`较低，而且具有多价解离性，故当溶液的PH值高于4时，核酸分子几乎全部解离，呈多阴离子状态。
因此，可把核酸视为较强酸性的多元酸。
多阴离子状态的核酸即可与金属离子结合成盐，也可与碱性蛋白质（如组蛋白）结合。
溶液的PH值直接影响核酸双螺旋结构中碱基对之间氢键的稳定性。
对DNA、碱基对在PH＝6～11最稳定。
⑶核酸的等电点:
核酸大分子是多级解离，pKa`值较低，约为1.5，故等电点较低。
一般地，RNA地PI约为PH2～2.5时DNA的PI值约为PH4～4.5。
⑷紫外吸收:
（用于核酸定性、定量测定）
在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，尤其是对240-280nm紫外线有强烈的吸收能力.一般地，λmax=260nm。
紫外线吸收光谱与分子中可解离基团的解离状态，PH、光波波长等因素有关。
一定组分具有特征的λmax、λmin，因而具有特定的消光系数（εmax、εmin）,这些数据即作为核酸及其组分定性定量测定的依据。
核酸吸收紫外线的强度的表示方法有：
Ø光密度OD：
利用紫外分光光度计测定各波长下的OD值
Ø克原子磷消光系数：
每升含一克磷原子的核酸浓度（PH=7）的ε值。
λ＝260nm时，天然RNA的ε＝7000～10000，
而DNA的ε＝6000～8000
核酸紫外吸收的性质常用作核酸组分含量的测定。
在某PH值下测样品的O.D值，再根据下表查出测定波长的克分子消光系数（ε），即可由下式计算样品中核苷酸的含量。
在固定PH的条件下：
C=M*O.D/ε/l；
式中C:
核苷酸的含量；M：
核苷酸的分子量；O.D：
紫外吸收光密度；ε：
克分子消光系数；l：
光程（即比色皿内径厚度，cm）
⑸核酸的变性和复性：
a.变性:
核酸与旦白性一样,分子均具有一定空间构象,维持这种空间构象的主要是氢键和碱基堆积力.
某些理化因素会破坏氢键和碱基堆积力,使核酸分子的高级结构改变,从而引起核酸理化性质及生物学功能改变,这种变化称为变性（denaturation）.
b.变性的影响因素:
外部因素:
加热,过高过低PH，有机溶剂，尿素，酰胺
等。
内部因素：
核酸分子本身结构，如分子中G，C含量高，分子就稳定,不变性，因为形成三个氢键。
C．变性特点：
核酸变性后，粘度下降，某些颜色反应加强，生物学功能改变，紫外线吸收增加。
如天然DNA完全变性后，入260
nm吸收能力增强25-40%,RNA变性后约增加1.1%.
这种由于核酸变性（或降解）而引起对紫外线吸收增加的现象称为增色效应或高色效应（hyperchoromicity）.
d.复性:
某些变性是可逆的,在一定条件下,变性DNA（单链）又可以相互结合成双链,该过程称复性（renaturation）.复性后,紫外线吸收减少,称为减色效应（hypochoromicity）.
e.通常用加热的方法来研究核酸的变性过程.加热后的DNA溶液若缓慢冷却至室温,变性后的DNA可以恢复其原有的理化性质,若加热后迅速冷却,则变性的DNA不能重新组合成双螺旋,属不可逆变性.
3、核酸的提取：
（以溶解性为依据）
1）RNP核DNP的分离
a）常用0.14MNaCl溶液提取RNP，此时DNP的溶解度极少，而RNP的溶解度依然很大，因此二者得以分离（RNP的溶解度基本稳定）
b）提取DNP则用1MNaCl溶液，使其达到最大提取效果（DNP的溶解度随NaCl溶度增大而增大）
c）两种蛋白的溶解度和PH值有关，DNP蛋白在PH4.2时，溶解度最低，而RNP蛋白在PH2.0～2.5时最低
2）RNA的提取
a）RNA的分类：
Ⅰ、rRNA：
从核糖体中提取
Ⅱ、tRNA：
从细胞质中提取
Ⅲ、mRNA：
从多聚核糖体中提取
b）RNA的提取方法：
胞内的三种RNA随不同的细胞位置而异，常将组织进行差速离心，分别制得细胞核、叶绿体、线粒体等细胞器或细胞质后，分别从中提取某一类RNA。
c）实例：
Ⅰ、植物中RNA的提取分离
Ⅱ、大肠杆菌中tRNA的提取分离
Ⅲ、T4感染的大肠杆菌中RNA的提取
Ⅳ、动物肝脏中rRNA的提取分离
d）、核酸提取中杂蛋白的去除：
Ⅰ、用氯仿－辛醇混合液振荡，使蛋白质变性，于氯仿－水的界层形成凝胶而得以去除
Ⅱ、用冷的2M盐酸胍溶液溶解大部分的蛋白质，使RNA沉淀而去除。
Ⅲ、用SDS使蛋白质变性，发生沉淀而去除
Ⅳ、用光谱蛋白酶分解蛋白质而去除
Ⅴ、用含水苯酚液和组织匀浆一起振荡，使变性的蛋白质及DNP处于下层酚相或两相界层处，而RNA处于水相
3）DNA的提取：
Ⅰ、含水苯酚法：
DNP和杂蛋白处于下层酚相中，而RNA于水相
Ⅱ、1MNaCl法：
1MNaCl溶液提取DNP溶液，然后与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡，去除蛋白质Ⅲ、0.14MNaCl法：
（或0.1MNaCl＋0.05M柠檬酸）用0.14MNaCl反复洗涤匀浆除去RNP，再用1MNaCl抽提DNP，用氯仿－辛醇去除蛋白质
七、包含体的破碎与提取
外源基因在微生物宿主中表达能产生重组蛋白，当重组蛋白高度表达时，将导致在细胞中形成包含体。
一般地，包含体在透视性相差显微镜下为不透明的颗粒，直径可达0.1～3.0µm，性质稳定，难溶于水，仅在变性剂溶液中才能溶解，而且密度较大，有折光性。
基因工程产物形成包含体的原因很复杂，可理解为外源蛋白在新的环境中，由于外界条件变化而引起折叠错误的结果，与所用的系统和蛋白质的种类无关，与蛋白质的内在性质也无直接关系。
由于包含体是在翻译的后阶段蛋白形成时折叠发生错误的产物，虽然具有正确的一级结构，但高级结构出现错误，所以不具有生物活性。
必须通过洗涤、变性和复性才能体现目标蛋白质的天然结构和活性。
目标蛋白质凝聚形成包含体后，由于密度较大，易于离心分离，而且能减轻蛋白酶对其的降解作用和其对宿主细胞的毒害作用。
但是，包含体的形成为重组蛋白的分离纯化带来很大的困难，常因重组蛋白的变性和复性效率不高，而使目标蛋白的活性和回收率很低。
通常包含体中目标蛋白含量很高，有时可占细胞总蛋白的50％以上。
包含体中目标蛋白的制备，包括细胞破碎、包含体的沉淀、包含体的变性溶解和蛋白质的复性等步骤。
细胞的破碎常用水解处理和高压破碎方法，细胞破碎后，采用低速离心沉淀包含体，用表面活性剂洗涤去除脂类和膜蛋白，然后用高浓度的变性剂（如6mol/L盐酸胍或8mol/L脲）溶解包含体，在变性剂溶液中溶解的蛋白质呈变性状态，但一级结构和共价键未被破坏，去除变性剂后，蛋白质可复性成正确构型。
蛋白质的复性操作主要有两种方法：
（1）将溶液稀释，降低变性剂的浓度和降低蛋白质的浓度，使蛋白质复性。
该法的缺点是增大了后处理体积。
（2）利用透析、超滤等膜分离技术去除变性剂。
该法适用于较高浓度的蛋白质复性。
复性的效果取决于蛋白质聚集和正确折叠之间的竞争。
为了减轻聚集，复性通常在低浓度（10～100µg/ml）下进行。
目前，提高目标蛋白质复性效率的对策主要有：
（1）加入聚乙二醇等共溶剂，可逆修饰折叠中间体的疏水表面；
（2）加入二硫苏糖醇等巯基还原剂，重建二硫键；（3）加入二硫键异构酶与脯氨酸顺反异构体酶，提高重组蛋白质的正确折叠率；（4）添加分子伴侣，提高折叠中间体的缓冲体系，防止肽键的错误折叠；（5）利用疏水作用色谱，离子交换色谱，金属鳌合色谱和凝胶过滤色谱等进行色谱复性。
八、中药有效成分的提取、分离与纯化
植物体内的成分是由复杂的化学成分所组成，其中有药用价值的是生物碱、萜类、甾体、苷类、黄酮体、蒽醌、香豆素、有机酸、氨基酸、单糖、低聚糖、多糖、蛋白质、酶及鞣质等。
而纤维素、叶绿素、蜡、油脂、树脂和树胶等是具有经济价值的成分，在研究植物生理活性成分时作为杂质除去。
1.有机溶剂提取法
有机溶剂提取常采用回流提取法、索氏提取法、浸渍法和渗漉法。
可采用几种极性不同的溶剂，由低极性到高极性分步提取，使各成分以其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。
也可采用单一溶剂提取。
因乙醇溶解性能好，对植物细胞的穿透能力强，单一提取的常用溶剂为不同浓度的乙醇，浓度根据被提取物质的性质而定。
2.水提取法
水提取可分为水煎、水浸和水渗漉三种，也可用酸水或碱水提取。
碱性、酸性或苷类化合物，如小檗碱、甘草酸、芸香苷等，较溶于水，可选用水为提取溶剂。
但是用水提取时，提取液中杂质较多（如无机盐、蛋白质、糖和淀粉等），不利于进一步分离。
因此，有些化合物虽能溶于水，但为了使杂质尽量少带出来，也常常用有机溶剂提取。
3.水蒸气蒸馏法
挥发油和某些挥发性成分能用水蒸气蒸馏得到。
如麻黄碱就可以用水蒸气蒸馏法从麻黄中直接蒸馏出来。
4.液-液萃取法
通常所指的萃取，即液－液分配萃取，是利用混合物中的各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。
当提取溶剂选用的是水或醇水溶液时，提取后浓缩成浓缩水液，选择合适的有机溶剂与其萃取。
若所需成分是脂溶性，可用有机溶剂如石油醚、氯仿或乙醚；若所需成分是亲水性物质，用弱亲脂性溶剂如正丁醇等进行萃取。
5．酸碱法
如果要分离成分是酸性或碱性化合物，常可向提取溶剂中加适当的碱或酸，使其成盐，而再加入适当的酸或碱，则可恢复原来的游离状态。
这些化合物的盐类水溶性较大，其相应的游离状态酯溶性较大。
利用酸碱处理使生成物的溶解性改变，再加以两相萃取，则可分离酸性或碱性的天然化合物。
6.沉淀法
酸性和碱性的化合物，可以通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀析出，如酸性化合物可做成钙盐、钡盐、铅盐等，碱性化合物可做成苦味酸盐、磷钼酸盐、磷钨酸盐、雷氏盐等。
用过滤法分离沉淀，再使用适当的方法对沉淀进行复分解而得到原来的酸性或碱性化合物。
7液相层析法
液相层析（LC）分离纯化法包括制备薄层层析（PTLC）、离心薄层层析和柱层析（CC）等。
层析用分离介质有硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺、葡聚糖凝胶、活性炭等，有正相层析和反相层析之分。
柱层析可按压力大小分为常压柱层析、低压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。
8重结晶
固体天然化合物达到一定的纯度，可呈结晶状，用过滤法可以使结晶和母液分开，达到进一步分离纯化的目的。
常用混合溶剂法进行重结晶操作，即将粗晶溶于少量第一溶剂（使结晶易溶解的溶剂）中，然后加入恰好使溶液变成轻微混浊状所需要的第二溶剂，静置析晶，过滤收集晶体。
若结晶的纯度还不够，可进行第二次重结晶或反复重结晶，以得到高纯度的天然化合物结晶。
九、天然动物药物的制备
1．天然动物药物概述
天然动物药物与天然植物药物和化学合成药物一样，也是人类防病、治病的重要药源，在人类历史上占有举足轻重的地位。
最初，天然动物药物大多数来自动物脏器，俗称脏器药物。
其原料来源主要是家畜、家禽的组织、器官、血液和毛发等；如：
①从动物大脑可制备脑磷脂、卵磷脂、胆固醇、褪黑激素和催眠多肽等；②从动物心脏可提取细胞色素C、心脏激素、辅酶Q10、辅酶A和辅酶I等；③从动物肝脏可分离过氧化氢酶、肝解毒素和超氧化
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