高中生物 第一章 基因工程 第2节 基因工程的原理和技术教案 浙科版选修3.docx
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高中生物第一章基因工程第2节基因工程的原理和技术教案浙科版选修3
第二节基因工程的原理和技术
课 标 解 读
重 点 难 点
1.简述基因工程的原理。
2.描述基因工程的基本步骤。
3.举例说明筛选含有目的基因的受体细胞的原理。
基因工程的原理及基因工程的基本操作步骤。
（重难点）
基因工程的基本原理
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达。
基因工程的操作步骤
1.获取目的基因
（1）目的基因的种类
抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。
（2）①目的基因碱基序列已知时：
a．用化学方法合成目的基因。
b．用聚合酶链式反应（PCR）扩增。
②目的基因碱基序列未知时：
从基因文库中获取。
2．形成重组DNA分子（如图）
据上图填充以下相关内容：
1．表述图示重组载体中的ampR（标记基因）有何作用？
【提示】 筛选、鉴定人乳铁蛋白基因是否导入受体细胞。
3．将重组DNA分子导入受体细胞（如图）
若上图中受体细胞为大肠杆菌，则导入过程的流程图为：
受体细胞：
大肠杆菌
↓氯化钙
细胞壁的通透性增大
↓
重组质粒导入受体细胞
↓
目的基因随着受体细胞的繁殖而复制
4．筛选含有目的基因的受体细胞
利用载体上的标记基因进行筛选。
如质粒上含有四环素抗性基因，可把受体细胞接种在含四环素的培养基上筛选，以获取含目的基因的受体细胞。
5．目的基因的表达
目的基因（如胰岛素基因）
相应蛋白质（如胰岛素原
生物活性的胰岛素）。
2．基因工程中限制性核酸内切酶与DNA连接酶的作用场所是生物体内还是体外？
【提示】 在生物体外。
1．用PCR扩增目的基因时，目的基因的序列可以是未知的。
（×）
【提示】 目的基因的序列应是已知的。
2．构建重组DNA分子时，只需限制性核酸内切酶即可完成重组过程。
（×）
【提示】 还需DNA连接酶等工具。
3．基因工程中的宿主细胞可以是植物细胞、动物细胞或微生物细胞。
（√）
4．抗虫棉的抗虫基因是否表达可用害虫感染抗虫棉进行检测。
（√）
5．CaCl2处理大肠杆菌，可使其细胞膜的通透性增加。
（×）
【提示】 增加其细胞壁的通透性。
目的基因的获取途径及重组DNA分子的构建
【问题导思】
①目的基因的获取方法有哪几种？
②PCR扩增技术与DNA复制有何区别？
③重组DNA分子重要组成部分有哪些？
1．获取目的基因方法
（1）从基因文库中获取目的基因
基因文库是指将含有某种生物不同基因的许多DNA片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
（2）人工合成目的基因
①目的基因转录成的信使RNA通过逆转录合成单链DNA，再按碱基互补配对合成双链DNA（目的基因）。
②根据蛋白质中氨基酸序列推测信使RNA的碱基序列，再推测DNA碱基序列，最后通过DNA合成仪人工合成出目的基因。
由于一种氨基酸可对应一种或多种密码子，因此根据蛋白质中已知的氨基酸序列合成出的目的基因可能有多种，但并不影响目的基因表达的产物。
（3）利用PCR技术扩增目的基因
①原理：
DNA双链复制。
②扩增过程：
目的基因DNA受热→变性解旋为单链→引物与单链相应互补序列结合→在TaqDNA聚合酶作用下延伸→形成新的DNA分子→循环重复以指数形式扩增。
2．PCR技术与生物体内DNA复制的比较
项目
PCR技术
DNA复制
相
同
点
原理
DNA双链复制（碱基互补配对）
原料
四种游离的脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶等
不
同
点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
主要在细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶
细胞内含有的DNA聚合酶
温度条件
需控制温度，在较高温度下进行
细胞内温和条件
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
3.重组DNA分子的构建
（1）构建重组DNA的目的：
使目的基因在受体细胞内稳定存在，并可遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）构建方法（以质粒为例）：
用同一种限制性核酸内切酶分别切割质粒和目的基因，使其产生相同的粘性末端，加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
（3）图例
用同一种限制性核酸内切酶（单酶切）分别切割目的基因与运载体是最简单的一种方法，因为切割后能产生相同的粘性末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重组DNA分子，操作简单，但连接后会出现两种不需要的连接产物：
目的基因—目的基因（环状）连接物、质粒—质粒（环状）连接物，加大了筛选的工作量。
所以可用两种不同限制性核酸内切酶（双酶切）分别同时切割含目的基因的DNA片段和质粒，这样可以防止目的基因与质粒自身连接体的产生，克服单酶切的缺点。
但由于每种限制性核酸内切酶作用的条件不同，一般两种酶不能同时使用，而是用完一种酶后就要更换另一种酶作用的外界条件，以保证酶的高效性，因此双酶切操作复杂。
下图为某种质粒简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。
已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。
据图回答：
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有__________、__________、__________三种。
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。
之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有_____________________________；
若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有________________。
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是____________。
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________________。
【思维导图】
【精讲精析】
（1）将含有目的的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：
目的基因—目的基因、目的基因—载体、载体—载体。
（2）在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有载体—载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。
（3）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。
（4）由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。
【答案】
（1）目的基因—载体连接物 载体——载体连接物 目的基因—目的基因连接物
（2）载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体、载体—载体连接物
（3）启动子 mRNA （4）EcoRⅠ和BamHⅠ
在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该目的基因的最佳方法是（ ）
A．以mRNA为模板逆转录合成DNA
B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选
D．由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA
【审题导析】 由题干关键信息“已知该目的基因碱基序列”可推出此段目的基因的脱氧核苷酸序列，用原料直接合成为最佳途径。
【精讲精析】 本题考查目的基因的获取途径。
在已知某小片段基因碱基序列的情况下，就能确定基因中脱氧核苷酸的排列顺序。
因此，获得该基因的最佳方法是在体外以4种脱氧核苷酸为原料人工合成基因。
【答案】 B
将重组DNA分子导入受体细胞
【问题导思】
①不同受体细胞基因表达载体导入的方法是否相同？
②CaCl2处理大肠杆菌的目的是什么？
③对于动物而言，可否用体细胞（除受精卵外）作受体细胞？
1．受体种类不同，导入方法不同
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
目的基因插入Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
2.受体种类不同，所用的受体细胞种类也不同
（1）植物：
可以是受精卵，也可以是体细胞（可经植物组织培养成为完整的个体）。
（2）动物：
只能是受精卵（因为体细胞的全能性受到限制）。
采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ）
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 ④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵
A．①②B．③④ C．②③ D．①④
【审题导析】 毒素蛋白具有抗虫作用，但不能遗传，基因工程中导入受体细胞的应为含有抗虫基因的重组DNA分子。
【精讲精析】 基因工程中导入目的基因前，首先要获得目的基因（即题目中的编码毒素蛋白的DNA序列），然后要将目的基因与载体结合（即与细菌质粒重组）。
完成上述两步以后才能将目的基因导入受体细胞（即棉花的体细胞或受精卵），目的基因导入受体细胞后，可随受体细胞的繁殖而复制，所以上述③④操作是正确的。
【答案】 B
目的基因的检测与表达
【问题导思】
①检测目的基因的方法有哪些？
②怎样对受体细胞进行筛选？
③目的基因表达的标志是什么？
1．直接检测方法
（1）检测目的基因翻译产物蛋白质：
可把生物体内蛋白质提取出来，利用抗原—抗体反应检测。
（2）检测目的基因转录的产物mRNA：
从生物体内提取mRNA，利用基因探针检测。
（3）检测生物的DNA分子是否插入目的基因：
从生物细胞中提取DNA，利用DNA探针技术检测。
（4）其他检测：
如从个体性状水平检测，把抗虫基因转入棉花细胞中，可让棉铃虫取食抗虫棉的叶片或棉铃直接检测。
以上为直接检测目的基因的方法，还可间接筛选检测。
2．筛选含有目的基因的受体细胞
（1）依据：
质粒上有抗生素的抗性基因。
（2）方法：
利用选择培养基筛选。
（3）举例
注意：
根据标记基因所控制的性状，筛选出含有目的基因的受体细胞的方法有许多，如：
①如果是抗性基因，可以直接用选择培养基筛选，存活的就是含有目的基因的受体细胞。
②根据菌落的颜色、形状等也可判断。
③通过如上的检测后，实际也不能确定细胞中就含有目的基因，因为可能有一些质粒并未插入目的基因。
3．目的基因的表达
目的基因能在受体细胞中保持稳定，并指导合成相应的蛋白质。
1．进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
2．不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
3．在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA单链片段。
如图，是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用载体为质粒A。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。
（1）如何将目的基因和质粒相结合形成重组DNA分子？
__________________________________________________________。
（2）目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高；导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。
此处可以通过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：
将得到的细菌涂抹在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就是导入质粒A或重组质粒的，反之则没有。
使用这种方法鉴别的原因是
___________________________________________________________。
（3）若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是____________________________。
分析说明：
_________________________________________________________
_________________________________________________________。
（4）导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？
__________________________________________________________________。
【审题导析】
（1）由题图可知其包含重组DNA分子构建、导入受体细胞以及目的基因的检测等步骤。
（2）各步骤中的关键点、注意事项要把握好，如用同一种限制性核酸内切酶切割。
【精讲精析】 本题主要对基因工程操作的步骤进行了比较全面的考查。
要用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和载体，产生能互补的粘性末端，然后用DNA连接酶将其连接形成重组的DNA分子，通过一定手段导入受体细胞内表达。
【答案】
（1）①用特定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口。
②用同种限制性核酸内切酶切割目的基因，产生相同的粘性末端。
③加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒
（2）普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因
（3）有的细菌能生长，有的细菌不能生长 导入普通质粒A的细菌能生长，因普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏
（4）受体细胞通过转录和翻译过程合成出相应的蛋白质，即人的生长激素
科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。
下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。
请根据实验过程回答下列问题：
（1）经过步骤①和②后，有些质粒上的____________基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒。
（2）步骤③是________________的过程。
为了促进该过程，应该用________________处理大肠杆菌。
（3）步骤④：
将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是筛选_________________________________________________________。
能在C中生长的大肠杆菌有________种。
（4）步骤⑤：
用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D（含氨苄青霉素和四环素）和E（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。
含目的基因的菌落位于（选填“D”或“E”）________上，请在图中相应的位置上圈出来。
【审题导析】 解答此题应注意以下两点：
（1）由②构建的质粒有两种，一为切割后自身环化，与原质粒相同；另一为目的基因与氨苄青霉素抗性基因重组后形成的质粒。
（2）由①到②的过程，质粒中的四环素抗性基因始终不受影响。
【精讲精析】 本题探究如何筛选含目的基因的受体细胞，通过使用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，使之产生相同的粘性末端，在DNA连接酶的作用下将目的基因与质粒连接起来形成重组质粒。
将重组质粒导入大肠杆菌后进行检测是通过检测质粒上的标记基因来实现的，导入细菌需用Ca2＋处理来增大细胞壁的通透性，使其成为感受态的细胞。
C过程是选择培养，所用的培养基是选择培养基，在培养基中加入四环素后，只有具有四环素抗性基因的大肠杆菌才能存活。
再利用D、E对比培养就可确定含目的基因的受体细胞位于E中的什么位置。
【答案】
（1）氨苄青霉素抗性
（2）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细胞） CaCl2溶液 （3）含四环素抗性基因的大肠杆菌（含抗性基因的大肠杆菌也可，但回答含目的基因的大肠杆菌不可） 2 （4）E
本课知识小结
网络构建
结论语句
1．基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定和高效地表达。
2．基因工程的基本操作步骤包括：
目的基因的获得、重组DNA分子的形成、重组DNA分子导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。
3．获得目的基因的方法有两种，一是化学合成的方法，二是从基因文库中获取。
4．形成重组DNA分子过程中要用同一种限制性核酸内切酶进行切割目的基因和质粒，即形成相同的粘性末端。
5．利用载体上的标记基因筛选含有目的基因的受体细胞。
1．基因工程技术也称DNA重组技术，其实施必须具备的4个必要条件是（ ）
A．工具酶、目的基因、载体、受体细胞
B．重组DNA、RNA聚合酶、内切酶、连接酶
C．模板DNA、信使RNA、质粒、受体细胞
D．目的基因、限制性核酸内切酶、载体、受体细胞
【解析】 该题考查基因工程的基本知识。
基因工程是按照人们的意愿，把一种生物的个别基因（目的基因）复制出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞（受体细胞）里，定向地改造生物的遗传性状。
基因操作的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，基因进入受体细胞的运输工具是载体。
【答案】 A
2．下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容全部正确的是（ ）
供体
剪刀
针线
载体
受体
A
质粒
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
提供目的基因的生物
大肠杆菌等
B
提供目的基因的生物
DNA连接酶
限制性核酸内切酶
质粒
大肠杆菌等
C
提供目的基因的生物
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
质粒
大肠杆菌等
D
大肠杆菌等
DNA连接酶
限制性核酸内切酶
提供目的基因的生物
质粒
【解析】 基因工程中供体指的是提供特殊目的基因的生物；“剪刀”指的是限制性核酸内切酶；“针线”指的是DNA连接酶；常见的载体有质粒、λ噬菌体、动物病毒和植物病毒；受体指的是有待定向改造的大肠杆菌等微生物或者动植物细胞。
【答案】 C
3．下图表示一项重要生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述正确的是（ ）
A．d的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构
B．若要获得相同的粘性末端，可以用不同种b切割a和d
C．c连接双链间的A和T，使粘性末端处碱基互补配对
D．若要获得已知序列的d，可到基因文库中寻找
【解析】 质粒的基本骨架是磷酸和脱氧核糖交替连接而成的结构。
不同种b（限制性核酸内切酶）切割a和d，可以获得相同的粘性末端。
c（DNA连接酶）连接DNA片段之间的磷酸二酯键，双链间的A和T互补配对，不需要酶连接。
若要获得未知序列的d（目的基因），可到基因文库中寻找。
【答案】 B
4．我国中科院上海生化所合成了一种具有镇痛作用而又不会像吗啡那样使病人上瘾的药物——脑啡肽多糖（类似于人体中的糖蛋白）。
在人体细胞中糖蛋白必须经过内质网和高尔基体的进一步加工才能形成。
如果要采用基因工程和发酵工程技术让微生物来生产脑啡肽多糖，应该用下列哪种微生物作受体细胞（ ）
A．大肠杆菌B．酵母菌
C．T4噬菌体D．大肠杆菌质粒
【解析】 脑啡肽多糖的化学本质类似于人体中的糖蛋白。
从题中可以看出，糖蛋白的合成必须经过内质网和高尔基体的进一步加工，内质网和高尔基体只存在于真核生物的细胞中。
大肠杆菌是原核生物，只有核糖体，没有内质网和高尔基体；T4噬菌体属于病毒，没有细胞结构，不能合成蛋白质；酵母菌是真核生物，其细胞中有内质网、高尔基体和核糖体，可以合成糖蛋白。
【答案】 B
5．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。
下列属于目的基因检测和鉴定的是（ ）
①检测受体细胞是否有目的基因
②检测受体细胞是否有致病基因
③检测目的基因是否转录出信使RNA
④检测目的基因是否翻译出蛋白质
A．①②③B．②③④
C．①③④D．①②④
【解析】 本题考查目的基因检测的相关知识。
目的基因的检测包括：
检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针与基因组DNA杂交。
检测目的基因是否转录出了信使RNA，方法是用基因探针与信使RNA杂交。
最后检测目的基因是否翻译出了蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。
【答案】 C
6．根据基因工程的有关知识，回答下列问题。
（1）限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和平末端。
（2）质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_________________________________________________________________。
（3）逆转录作用的模板是________，产物是________。
若要在体外获得大量逆转录产物，常采用________技术。
（4）基因工程中除质粒外，________和____________也可作为载体。
（5）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是______________________________________________
______________________________________________________________。
【解析】 限制性核酸内切酶切割DNA分子形成的末端通常有两种，即粘性末端和平末端。
为使载体和目的基因连接，二者必须具有相同的粘性末端，因而当使用除EcoRⅠ之外的其他酶进行切割时，应该产生相同的粘性末端。
逆转录是由RNA形成DNA的过程，获得大量逆转录产物时常用PCR扩增技术。
基因工程常用的载体是质粒，除此以外，噬菌体和动植物病毒也可作为载体。
如果用大肠杆菌作受体细胞，必须用钙离子处理，使其处于感受态（此状态吸收外源DNA的能力增强）。
【答案】
（1）粘性末端
（2）切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同 （3）mRNA（或RNA）cDNA（或DNA） PCR （4）噬菌体 动植物病毒
（5）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
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