制药工程专业基础实验药物分析部分.docx

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制药工程专业基础实验药物分析部分

制药工程专业基础实验

《药物分析》部分

氯霉素眼药水的HPLC分析

一、实验目的

1.学习内标法和外标法测定组分的含量。

2.了解高效液相色谱仪的结构及正确使用。

二、实验内容和要求

（一）实验原理

高效液相色谱是在经典液相色谱的基础上由于引入了气相色谱的理论而发展起来的。

以液体作为流动相，根据柱填料不同。

可分为吸附，分配，离子交换，凝胶渗透四种高效液相法、本实验采用ODS柱进行反相高效液相色谱。

通过本实验应掌握内标法，外标法定量的原理，方法及优缺点并加强高效液相色谱仪的操作技能训练。

内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差，精密称取样品后，加入一定量的内标物，然后制成适当溶液进样分析。

根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积比，求出某组分的含量。

外标法又称校正法或定量进样法。

本法要求能准确地定量进样，配制一系列已知浓度的标准液，在同一操作条件下，按同量注入色谱仪，测量其峰面积（或峰高），作峰面积（或峰高）与浓度的标准曲线.然后在相同条件下，注入同量样品溶液，测量待测组分的峰面积（或峰高），根据标准曲线，计算样品中待测组分的浓度。

氯霉素是抗生素类药物，微溶于水，且具苯环结构，所以可以用反相高效液相色谱法进行分离，并用UV254nm进行检测，甲醇-水作流动相。

三、实验主要仪器设备和材料

试剂及仪器

高效液相色谱仪，柱ODS柱（15cm×5mm），电子天平，100ml容量瓶，氯霉素标准品，2mg/ml对硝基苯酚（内标）标准贮备液，氯霉素眼药水样品，甲醇等。

氯霉素：

广谱抗生素，原在土壤中。

1947年从南美洲委内瑞拉的委内瑞拉链霉菌中提取，1949年实现人工合成

四、实验方法、步骤及结果测试

（一）实验条件

高效液相色谱仪

柱ODS柱（15cm×5mm）

流动相：

内标法甲醇:

水（60:

40）；外标法甲醇:

水（80:

20）

流速：

0.7ml/min

波长：

254nm

采样时间设置：

5min

进样量：

10ul

（二）标准贮备液的制备（待修改）

1mg/ml氯霉素标准贮备液的配制：

精密称取氯霉素100mg至100ml容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

2mg/ml对硝基苯酚（内标）标准贮备液的配制：

精密称取对硝基苯酚约200mg置100ml量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

（三）内标法测定氯霉素的含量

1、相对校正因子的测定

分别精密吸取对硝基苯酚标准贮备液各2.5ml，置5个10ml容量瓶中，再分别精密加入氯霉素标准贮备液1，2，3，4，5ml？

，用甲醇稀释至刻度，摇匀.色谱仪基线平稳后。

分别进样0.5ul得色谱图。

测量对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子：

fi内标=（Wi/Ai）/（W内标/A内标）

或fi内标=（Wi/hi）/（W内标/h内标）

式中：

Wi--氯霉素重量；

W内标--对硝基酚的重量；

Ai（hi）--氯霉素的峰面积（峰高）；

A内标（h内标）--对硝基苯酚的峰面积（峰高）。

本实验中，由于峰形较窄，可采用峰高法。

2、样品含量测定

精密吸取眼药水适量（约相当于氯霉素5.0mg，标示量为2.5mg/ml），置10ml容量瓶中，并加入对硝基苯酚的贮备液2.5ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样0.5ul，得色谱图。

按下式计算标示量的百分含量。

标示量%=（Wi/W）×100%=（hi/h内标）•（W内标/W样）•fi内标×100%

（四）外标法测定氯霉素的含量

1、标准曲线的制备

分别吸取氯霉素标准贮备液各1，2，3，4，5ml置10ml容量瓶中。

甲醇稀释至刻度，各进样10ul，以峰高对浓度作图，得标准曲线。

2、样品测定

精密吸取眼药水适量（约相当于氯霉素2.5mg）置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样10ul，得色谱图，根据峰高从标准曲线上查得相应的浓度，并计算标示量的百分含量。

五、思考题

1.怎样选择流动相？

水在流动相中有什么作用？

2.如何保证进样的准确性？

3.内标物应该具备什么条件？

4.内标法和外标法各有什么特点？

六、实验安排

每班分5组，每组确定一个组长

第一组：

老师讲解，标准样品进样，5个标样，1个待测样，负责绘制保准曲线，采用标准曲线法进行定性定量分析。

其他组：

依次实验，由上一组组长讲解，进2个样：

待测样+标样中的任何一个。

采用外标一点法进行定性定量分析

盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸检查

一、实验目的

1．掌握TLC法测定有关物质的原理与测定方法。

2．熟悉粘合薄层板的制备与活化。

二、实验内容和要求

（一）．薄层色谱法（本实验不做铺板实验，直接用买来的硅胶G板）

（1）玻板用5cm×20cm或l0cm×20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

（2）固定相常用固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。

其颗粒大小．一般要求直径为10-40µm,取各品种项下规定的固定项一定量，按“薄层板制备”法制备薄层板。

（3）薄层涂布一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系固定相直接涂布于玻板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10％-15％煅石膏（CaSO4.2H2O在140oC加热4h）,混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5％-0.7％）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。

（4）展开室应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子，底部应平整光滑，便于观察。

薄层板制备根据各品种项下规定，取1份固定相和3份水（或粘合剂）在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，用倾注法或平铺法或涂布器法，在玻板上涂布厚度为0.2-0.3mm的薄层板。

将涂好薄层的玻板置水平台上，于室温下晾干后在110oC烘30min；置有干燥剂的干燥箱中备用。

使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）.

点样用微量注射器或微量吸管吸取规定量样品溶液，点样于薄层板上，—般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为2-4mm，点间距离约为1．5-2．0cm，点样时必须注意勿损伤薄层表面。

展开展开缸如需预先用展开剂饱和，可在缸个加入足够量的展开剂，并在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中,一端浸入展开剂中，密封缸顶的盖，使系统平衡.将点好样品的薄层板放人展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底0.5-1.0cm（切勿将样点浸入展开刑中），密封缸盖，待展开至规定距离（一般为10-15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。

三、实验主要仪器设备和材料

层析缸，玻板，喷雾器，点样用微量注射器或微量吸管。

硅胶H,硅胶GF254，对二甲氨基苯甲醛，盐酸普鲁卡因注射液.

四、实验方法、步骤及结果测试

盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸检查

精密量取本品，加乙醇制成每1mL中含盐酸普鲁卡因5mg>的溶液（浓度高，显色明显）（显色快），作为供试品溶液。

另取对氨基苯甲酸对照品，加乙醇制成每1mL中含60ug>（浓度高，显色明显）（显色慢）的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（附录A）试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于含有羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H薄层板上）（在保证不弄破薄层板的基础上，重复点三次，便于显色）用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇（14：

1：

l：

4）为展开剂，展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液（2％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100mL，加冰醋酸5mL制成）喷雾显色（盐酸普鲁卡因显色快，对氨基苯甲酸显色慢）。

供试品溶液如显与对照品溶液相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深。

五、实验报告要求

记录实验详细步骤及分析结果。

六、思考题

1．TLC分析定性定量方面的应用？

七、实验说明及注意事项

1．薄层色谱分析中为使斑点集中，点样应分次点加，每次点加后，候其自然干燥、低温烘干或经温热气流吠干。

2．荡层板故入层析缸时，薄板底边应水平浸入展开剂中，待展开至溶剂前沿距玻板顶端2-3cm时，取出薄层板。

3．展开缸必须密封，为使缸内展开剂饱和，薄层板故人前可在层析缸内壁贴滤纸条，让滤纸条一端浸入展开剂中，密封层析缸，待系统平衡后再将薄层板故入，展开。