链霉菌室实验操作手册.docx
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链霉菌室实验操作手册
链霉菌室实验操作手册（2003年）
第一章培养基抗生素生长因子3
常用抗生素及其使用浓度3
LB（Luria-Bertani）培养基3
LA3
基本培养基（MM）3
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用4
YEME（酵母膏-麦芽膏培养基）1L（液体培养链霉菌）4
TSBY（1L）（液体培养链霉菌）4
MS培养基5
2CMY培养基（用于井岗的接合转移）5
YMS培养基（阿维，井岗产孢）5
YD培养基5
生长因子补充物的使用浓度6
第二章DNA基本操作7
大肠杆菌质粒的抽提7
酶连反应7
DNA片段凝胶回收8
DNA纯化9
E.coil总DNA的提取9
链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）10
去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）10
AT克隆（详见说明书）10
SouthernBlot11
第三章PCR及相关技术13
PCR13
PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术）14
PCR定点诱变（DpnI法）14
第四章基因片段转移技术15
大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化15
DNA转化15
大肠杆菌质粒的快速检测15
接合转移（详见英文《手册》249页）16
链霉菌原生质体的制备16
链霉菌原生质体的转化17
PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化17
第五章RNA操作技术19
链霉菌总RNA的抽提19
链霉菌的RT-PCR（promegaRTkit）19
第六章蛋白质基本操作技术21
SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色21
大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：
21
链霉菌总蛋白抽提：
22
大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）：
22
WesternBlot23
第七章遗传作图相关技术25
链霉菌孢子悬液的制备25
链霉菌中NF的证明25
孢子杂交25
在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因25
第八章其他技术27
链霉菌菌种保藏27
检测链霉菌淀粉酶的活性27
第一章培养基抗生素生长因子
常用抗生素及其使用浓度
抗生素
英文名称及缩写
抗性基因
贮藏液浓度（mg/ml）
使用终浓度（μg/ml）
链霉菌
大肠杆菌
MM
2CM
YEME
LA或LB
氨苄青霉素
氯霉素
潮霉素
卡那霉素
壮观霉素
链霉素
硫链丝菌素
红霉素
阿泊拉霉素
Ampicillin,AmpChloramphenicol,Cml
Hygromycin,Hyg
Kanamycin,Km
Spectinomycin,Spc
Streptomycin,Str
Thiostrepton,Thio
Erythomycin,Ery
Apramycin,Am
bla
cat
hyg
aac或aph
aadA
str
tsr
ermE
aac（3）IV
100
25（无水乙醇配）
50
25
50
50
25（DMSO配）
100
50
R
10
10
2?
50
10
5
100
10
R
－
25
50
50
25
10
－
50
R
－
－
－
50
－
2.5
－
50
50-100
25
50
50
50
25
不敏感
20
30-50
*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制
*此表仅供参考！
！
！
*R表示不敏感
*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,Vio
LB（Luria-Bertani）培养基
胰蛋白胨10g，
酵母抽提物5g，
NaCl5g，葡萄糖1g，
蒸馏水加至1000ml，
pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）
LA
LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉（不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%）。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖
基本培养基（MM）
溶液：
L-天冬酰胺0.5g，
K2HPO40.5g,
MgSO4·7H2O0.2g,
FeSO4·7H2O0.01g,
蒸馏水至1000ml
将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
配置MM的琼脂有labagar、Iceagar（IA）
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用
蔗糖103g
K2SO40.25g
MgCl2·6H2O10.12g
葡萄糖10g
Difco酪蛋白氨基酸0.1g
微量元素溶液2ml
Oxoid酵母提取物5g
TES5.73g
加蒸馏水至1000ml
称取5.5gDifco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。
使用时，将培养基融化，每瓶中加入：
KH2PO4（0.5%）2.5ml
CaCl2·2H2O（5M）1ml
L-脯氨酸（20%）3.75ml
NaOH（1M）调pH至7.3
对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）
YEME（酵母膏-麦芽膏培养基）1L（液体培养链霉菌）
Oxoid酵母提取物3g
Oxoid蛋白胨Tryptone5g
麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g
葡萄糖10g
蔗糖＊340g
蒸馏水至1000ml
高压灭菌后加入：
（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。
）
MgCl2·6H2O（2.5M）2ml/L
制备原生质体时，还要加入：
甘氨酸（20%）＊25ml/L
＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。
TSBY（1L）（液体培养链霉菌）
Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g
蔗糖＊340g
Oxoid酵母抽提物5g
蒸馏水至1000ml
*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
MS培养基
将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。
2CMY培养基（用于井岗的接合转移）
可溶性淀粉10g
胰蛋白胨2g
NaCl1g
（NH4）2SO42g
K2HPO41g
CaCO32g
无机盐溶液*1ml
琼脂20g
蒸镏水1000ml
PH7.2
无机盐溶液（每升）
FeSO4.7H2O1g
MgCl.6H2O1g
ZnSO4.7H2O1g
YMS培养基（阿维，井岗产孢）
酵母抽提物4g
可溶性淀粉4g
麦芽糖10g
CoCl..6H2O5mg
琼脂20g
蒸镏水1000ml
PH7.2
YD培养基
酵母抽提物4g
麦芽糖10g
葡萄糖4g
MgCl2g
CaCl1.5g
琼脂15g
蒸镏水1000ml
PH7.2
生长因子补充物的使用浓度
天蓝色链霉菌1258、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表
生长因子补充物的使用浓度表
化合物
储存液（mg/ml）1
终作用浓度（μg/ml）
组氨酸（Histidine）
10
50
其它氨基酸2
7.5
37
腺嘌呤，鸟嘌呤，
胸腺嘧啶，尿嘧啶
1.5
7.5
维生素
0.1
0.5
1.储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4oC保存。
2.对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。
第二章DNA基本操作
大肠杆菌质粒的抽提
苯酚/氯仿溶液抽提法
1.接种5mlLB，37℃摇床过夜培养（12小时）
2.离心，3000rpm，5min去上清
3.振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I（50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris·Cl（PH8.0）,10mmol/LEDTA（PH8.0）在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。
4.加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH,1%SDS,用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。
5.加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。
6.用120ul氯仿重复操作5。
7.加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。
8.沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。
50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
氯化锂抽提法
1.前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用SolutionIIIIII处理）
2.加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。
去上清，尽量去干净。
3.用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。
4.12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。
5.将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。
50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
酶连反应
一般采用10μl反应体系：
T4连接酶1μl，连接酶缓冲液1μl，外源片段与载体按DNA摩尔含量3:
1加入即可。
如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。
平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。
＊外源片段与载体按DNA摩尔含量为3:
1或外源更多。
DNA片段凝胶回收
1试剂盒回收（离心法）（详见说明书）
（1）在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积（如1oomg=1ooul）
（2）根据凝胶的浓度,加DE-A液
凝胶浓度DE-A溶液体积
≤1.0%3个凝胶体积
≤1.5%4个凝胶体积
≤2.0%5个凝胶体积
混匀后于75oC加热,（低熔点琼脂糖凝胶于45oC加热）,间断混合,直到凝胶熔化（6-8分钟）.
（3）加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀（是否需调整PH值,见注意事项1）;当分离的DNA片段小与400bp时,加入异丙醇至终浓度为20%;
（4）吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;
（5）将制备管置回离心管,加0.5mlW1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
（6）将制备管置回离心管,加0.7mlW2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次;（W2中含有酒精，应保证瓶子密封。
）
（7）将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
（8）将制备管置洁净的1.5ml离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
注意事项;
1.此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.
2.勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
3.2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
4.步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60゜C,可提高回收效率。
（重要）
5.DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。
（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。
）
2silica回收
1在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
2.加入2-3倍体积的6MKI或NaI（避光4度保存）;
1.65oC温浴,间断混合,直到凝胶熔化;
2.加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀,冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;
3.5000rpm离心3分钟,弃上清;
4.加1ml预冷的NEWbuffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上洗盐2分钟，间断混合;
5.12000rpm离心10s,弃上清;
6.重复6,7步骤1次;
7.于50oC烘箱烘干;
8.加10ul的去离子水用枪头打匀,65oC水浴15分钟,间断混匀;
9.12000rpm离心10s，把上清转移到另外洁净的离心管中;
10.跑胶检测回收效率.
注意事项
＊4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。
＊NEWBuffer：
（100ml）
1ml5MNacl,1ml1MpH7.5This-HCl,0.5ml0.5MEDTA,50ml100%ETOH,去离子水加至100ml。
（-20度保存）
＊Silica配法见：
TIGJanuary1995Vol.11No.1.AninexpensivealternativetoglassmilkforDNApurifyication.
DNA纯化
用苯酚:
氯仿抽提
1.把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:
氯仿,
2.混匀,使之成为乳浊状;
3.12000rpm离心,5分钟:
4.用枪头把水相移到另一离心管中.
5.加入等体积氯仿并重复2—4
6.用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长时间沉淀可提高产量）
7.12000rpm离心5分钟,弃液体
8.70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，
9.重复8一次，再12000rpm离心弃液体.
10.50度烘干.
11.去离子水溶解。
LiCl抽提
1把样品至置于离心管中,加4/5体积10MLiCl
2室温下静置1分钟
312000rpm离心5分钟
4把液体转移到另一离心管中
5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟
往下的步骤同于上面的8-12
E.coil总DNA的提取
1将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。
2加500μl水重悬浮，加入500μl2%SDS,混合振荡约1min，55℃温育15min，直到溶液的粘度显著下降。
3加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。
4加入150μl中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，
6加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。
7用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。
8烘干，溶解DNA沉淀。
链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）
1将适量的菌体悬浮于500μl溶菌酶溶液（2％）中，37℃温育1hr左右至完全溶菌，
2加入500μl碱性SDS溶液（0.3mol/LNaOH,2%SDS），立即振荡混合完全，
3打开管盖，在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃,30min），然后于水浴中冷却至室温，
4加入100μl酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。
6在上清液中加入1/10体积的3MNaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min，
7用70%乙醇洗涤沉淀两次,
8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。
另：
可使用抽提总DNA的试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。
去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）
注：
CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5ul即可。
也可减少温浴时间，如37℃,10~20min即可。
AT克隆（详见说明书）
所用的载体:
pGEM-T,pGEM-TEasyVetorSystem
1.酶连
（1）体系10ul
standardReationPositivecontrolBackgroundcontrol
2XRapidLigationBuffer,T4DNALigation5ul5ul5ul
pGEM-T,pGEM-TEasyVetor（50ng）1ul1ul1ul
PCRproductXul------
ControlinsertDNA---2ul---
T4DNALigase（3weissuntis/ul）1ul
Deionizedwatertoafinalvolumeof10ul10ul10ul
（2）.反应4oC过夜
注:
PCR产物和载体的摩尔比为:
（ngofvectorxkbsizeofinsert）/（kbsizeofvector）*（insert:
vectorration）=ngofinsert
一般外源和载体的摩尔比例为3:
1
T载体大小为3bkb50ng
2.转化
（1）取大肠杆菌感受态细胞100ul,连接产物2-5ul加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20分钟.
（2）42oC热激90秒.（不要摇动）
（3）立即置冰上3-5分钟.
（4）加1mlSOC培养基（室温）
（5）37oC培养1.5小时（约150rpm摇动）.
（6）离心,去上清,余下的混匀涂皿（LB/抗生素/IPTG/X-Gal）.
（7）37oC培养16—24小时,挑白斑.
＊所用的培养基:
SOC培养基
胰蛋白胨2g
酵母抽提物0.5g
1MNaCl1ml
1MKCl0.25ml
2MMg2+储液1ml
2M葡萄糖1ml
*Mg2+储液
MgCl.6H2O20.33g
MgSO4.7H2O24.65g
加双蒸水到100ml,过滤灭菌
*葡萄糖过滤灭菌
SouthernBlot
转膜
1.DNA经酶切后，用Agarose凝胶电泳分离，切去多余的胶块并在右下角切去一角以便于识别方向，接着EB染色并拍照。
（注意：
TAE需新配，凝胶浓度视片段大小而定，一般为0.8%~1.0%，电压1~50v/cm）
2.拍照后的凝胶先用无菌的去离子水轻轻摇晃，洗2次，5min/次。
3.去嘌呤：
在室温下，把凝胶置于盛有0.25MHCl的大平皿中轻轻摇动，直到溴酚蓝由蓝变黄（如果杂交的目标片段小于5kb，此步可省略），再用无菌水摇动洗5min。
4.DNA变性：
把凝胶放入盛有变性液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次，再用无菌水洗5min。
5.中和：
把凝胶放入盛有中和缓冲液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次。
6.把凝胶放入盛有20xSSC的平皿中，平衡10min。
7.印迹：
用一玻璃板横放于盛有20xSSC的搪瓷盘上作为桥，把一张用20xSSC浸润的3MM的Whatman滤纸铺在玻璃板上，其两端放入瓷盘的20xSSC液体中，用玻璃棒赶尽气泡。
把凝胶（点样孔面朝下）放在滤纸上，避免气泡产生，凝胶周围用胶板封住。
剪一张比凝胶略大的带正电的尼龙膜平铺在凝胶上，避免气泡产生，（使凝胶湿润再放膜）。
再在尼龙膜上放两张与尼龙膜大小一致的3MM滤纸，然后放一叠吸水纸在滤纸上，再在吸水纸上一平板，平板上放一500g的重物，印迹时间大于2h。
8.紫外交联：
取下重物及吸水纸拿出尼龙膜放在一滤纸上，与胶接触面朝上，放入紫外胶膜仪中胶联。
9.用无菌水洗膜10min，如不立即杂交，自然烘干保存。
预杂交及杂交
1.裁剪一张比尼龙膜稍大的杂交袋，把尼龙膜放入袋中，用封口机先封住三边，放入10ml预杂交液，赶尽气泡，封口。
把杂交袋放入杂交筒中，预杂交时间大于4h,温度65゜C。
2.加探针：
把探针先煮沸15min后立即放入冰中，至少10min，然后把探针加入1ml预杂交液中，剪去杂交袋一角，除去绝大部分预杂交液，加入杂交液，除尽气泡封口，放入杂交筒中65゜C杂交6~20h。
洗膜
1.用2xSSC,0.1%SDS室温下轻轻摇动洗2次，5min/次
2.用0.5xSSC,0.1%SDS在68゜C条件下洗膜2次，5min/次，轻轻摇动（可在杂交筒中进行）
Dig检测
1.洗膜后，用washingbuffer摇动润洗5min。
2.用100mlBlockingsolution温育30min，轻轻摇动。
3.用20mlAntibodysolution温育30min，轻轻摇动。
4.用washingbuffer轻轻摇动洗2次，每次15min。
5.在20mlDetectionbuffer中平衡5min。
6.把膜转到用铂纸包裹的盛有新配置的Colorsubtratesolution的平皿中显色。
7.用PH8.0TE终止反应。
第三章PCR及相关技术
PCR
不同公司不同的酶要求的反应体系与反应条件会有不同，PCR反应可参考该酶的产品说明上的反应体系与反应条件。
一般的反应体系如：
引物（50pmol/μl）
各1μl反应终浓度:
各1pmol/μl
模板（约30ng/μl）
1μl
约30ng
Buffer（10,含Mg2+）
5μl
1
dNTPs（10mM）
1μl
0.2μM
高温聚合酶（5U/μl）
0.2～1μ
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