Identification of Continuous Human B.docx
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IdentificationofContinuousHumanB
IdentificationofContinuousHumanB-CellEpitopesintheVP35,VP40,NucleoproteinandGlycoproteinofEbolaVirus
连续人类B细胞抗原表位在埃博拉病毒的VP35，VP40，核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）上的识别
PierreBecquart1,2*,TanelMahlako˜iv2,Dieudonne´Nkoghe2,EricM.Leroy1,2
ReceivedDecember24,2013;AcceptedApril4,2014;PublishedJune10,2014
Abstract摘要
Ebolavirus（EBOV）isahighlyvirulenthumanpathogen.RecoveryofinfectedpatientsisassociatedwithefficientEBOV-specificimmunoglobulinG（IgG）responses,whereasfataloutcomeisassociatedwithdefectivehumoralimmunity.AsB-cellepitopesonEBOVarepoorlydefined,wesoughttoidentifyspecificepitopesinfourEBOVproteins（Glycoprotein（GP）,Nucleoprotein（NP）,andmatrixViralProtein（VP）40andVP35）.Forthefirsttime,wetestedEBOVIgG+serafromasymptomaticindividualsandsymptomaticGabonesesurvivors,collectedduringtheearlyhumoralresponse（sevendaysaftertheendofsymptoms）andthelatememoryphase（7–12yearspost-infection）.WealsotestedserafromEBOV-seropositivepatientswhohadneverhadclinicalsignsofhemorrhagicfeverorwholivedinnon-epidemicareas（asymptomaticsubjects）.WefoundthatserumfromasymptomaticindividualswasmorestronglyreactivetoVP40peptidesthantoGP,NPorVP35.Interestingly,anti-EBOVIgGfromasymptomaticpatientstargetedthreeimmunodominantregionsofVP40reportedtoplayacrucialroleinvirusassemblyandbudding.Incontrast,serumfrommostsurvivorsofthethreeoutbreaks,collectedafewdaysaftertheendofsymptoms,reactedmainlywithGPpeptides.However,inasymptomaticsubjectsthelongestimmunodominantdomainswereidentifiedinGP,andanalysisoftheGPcrystalstructurerevealedthatthesedomainscoveredalargersurfaceareaofthechalicebowlformedbythreeGP1subunits.TheB-cellepitopesweidentifiedintheEBOVVP35,VP40,NPandGPproteinsmayrepresentimportanttoolsforunderstandingthehumoralresponsetothisvirusandfordevelopingnewantibody-basedtherapeuticsordetectionmethods.
埃博拉病毒（EBOV）是一种高度致命的人类病原体。
治愈感染患者与有效的EBOV特异性免疫球蛋白G（IgG）的反应有关，而致命的结果与有缺陷的体液免疫有关。
B-细胞不易定义EBOV表位，我们试图确定4个EBOV蛋白的特定表位（糖蛋白（GP），核蛋白（NP）和基质病毒蛋白（VP）40和VP35）。
第一次，我们对无症状个体和对症加蓬幸存者，在早期的体液应答（症状结束后七天内）和已故的记忆阶段（7-12岁感染后）收集测定IgG抗体的EBOV血清。
我们还测试了从未有过出血热临床症状或住在非疫区（无症状患者）的EBOV-阳性患者的血清。
我们发现从无症状个体获得的血清对VP40肽比对GP,NP或VP35有更强烈的反应。
有趣的是，无症状患者的抗EBOV的IgG靶向VP40的三个免疫显性区域据研究在病毒装配和出芽方面发挥了至关重要的作用。
与此相反，来自三次发病后幸存者的血清，症状结束几天后收集，反应主要与GP肽有关。
然而，无症状受试者的最长免疫结构域在GP鉴定，而且，对GP晶体结构的分析表明，这些结构域覆盖着一片更大的由3个GP1亚基形成的像酒杯似的表面。
我们在EBOVVP35，VP40，NP和GP蛋白上识别的B细胞表位可能代表着用于理解本病毒的体液应答和开发新的基于抗体的治疗剂或检测方法的重要工具。
Introduction引言
Ebolavirus（EBOV）,amemberoftheFiloviridaefamily,isahighlyvirulentpathogenforhumansandnonhumanprimates[1].EBOVisafilamentousenvelopedviruscontaininganegative-strandRNAgenomeofabout19kb.TheEBOVgenomecodesforeightmajorsubgenomicmRNAsthatsequentiallyencodesevenstructuralproteins,namelyanucleoprotein（NP）,twovirionproteins（VP35andVP40）,asurfaceglycoprotein（GP）,twoadditionalviralproteins（VP30andVP24）,anRNA-dependentRNApolymerase（L）,andanon-structuralsolubleprotein（sGP）[2].
埃博拉病毒（EBOV），丝状病毒家族的一个成员，是一种对人类和非人灵长类动物[1]具有高毒性的病原体。
EBOV是一种含有约19kb的负链RNA基因组的丝状包膜病毒。
EBOV基因组编码八个主要亚基因组mRNA，顺序编码7个结构蛋白，即核蛋白（NP），两个病毒体蛋白（VP35和VP40），表面糖蛋白（GP），两个附加的病毒蛋白（VP30和VP24），一个RNA依赖性RNA聚合酶（L）和一个非结构可溶性蛋白（SGP）[2]。
Afteranincubationperiodrangingfrom2to21days（mean4–9days）,EBOVcausesseverehemorrhagicfeverthatisfatalinnearly90%ofcaseswithin7–11days[3].EBOVhascausedseveraloutbreaksinGabon,DemocraticRepublicoftheCongo（DRC）andRepublicoftheCongo（RC）[4–7].Thereiscurrentlynovaccineandnospecifictreatment.FatalEBOVinfectionischaracterizedbyadefectiveinnateimmuneresponse,leadingtouncontrolledreleaseofinflammatorymediatorsandchemokinesinthelatestageofthedisease,andcorrelateswiththecollapseofadaptiveimmunitywithmassiveTandBlymphocyteapoptosis[8–10].However,lethallyinfectedmodelmicegeneratedafunctionalCD8+TcellresponsedespitesignificantTcellapoptosis[11].Survivorsandasymptomaticsubjectsdevelopanearlyandmoderateinflammatoryresponsetogetherwithaneffectiveadaptiveresponse[8–10].Defectiveadaptiveimmunityobservedinfatalcasesisassociatedwithanimpairedhumoralresponse,asEBOV-specificIgGandIgMarebarelydetectablebeforedeath[12–14].Incontrast,recoveryisassociatedwithearly,increasinglevelsoflong-lastingEBOV-specificIgG,followedbyviralantigenclearance[12,15,16].ModerateamountsofEBOV-specificIgGarealsodetectedabout3weeksafterinfectioninasymptomaticpatients[8].Astrongearlyhumoralresponsemaythusplayamajorroleinsurvival.
经过一个潜伏期即2〜21天（平均4-9天），EBOV使7-11天内近90％的病例[3]死亡，造成严重的出血热。
EBOV在加蓬，刚果和刚果（金）[4-7]已造成数次疫情爆发。
目前还没有疫苗，也没有具体的治疗方法。
致命EBOV感染的特点是有缺陷的先天免疫应答，导致炎性介质和趋化因子在疾病的晚期阶段受控排放，与大量T和B淋巴细胞的凋亡[8-10]导致的适应性免疫的崩溃。
然而，尽管T细胞凋亡[11]显著，注射致死模型小鼠中产生了功能性CD8+T细胞应答。
幸存者和无症状患者早期中度的炎症反应伴有有效的适应性反应[8-10]。
通过死亡病例观察到有缺陷的适应性免疫与受损体液反应有关，如EBOV特异性IgG和IgM死亡[12-14]之前均几乎检测不到。
与此相反，治疗与及早的提高长效EBOV特异性IgG的水平有关，其次是病毒抗原间隙[12,15,16]。
无症状患者[8]感染之后约3周，也检测到适量EBOV特异性IgG。
一个强大的早期体液免疫反应可能因此在生存中起到了重要作用。
LittleisknownofhumanantibodytargetsinEBOVinfection.WesternblotanalysishasshownthatIgGantibodiesinserafromsurvivorsofsymptomaticinfectionandfromasymptomaticsubjectsaremainlydirectedagainstNPandVP40,and,inaminorityofcases,againstVP35[8,12].Similarresultshavebeenreportedinseropositiveindividualswhohaveneverhadclinicalsignsofhemorrhagicfeverorwholiveinnon-epidemicareas[17].AntibodyphagedisplaylibrariesconstructedfromRNAderivedfromtwosurvivorsofthe1995EBOVoutbreakinKikwit（DRC）alsoshowedthepresenceofantibodiesreactingwithNP,GPandsGP[18].LittlefurtherinformationisavailableonhumanB-cellepitopesofEBOVproteins.Thus,thepurposeofthepresentstudywastoidentifyimmunodominantIgG-specificepitopesinGP,NP,VP40andVP35using,forthefirsttime,anti-EBOVIgG+patientsera.
EBOV感染人体抗体的目标鲜为人知。
免疫印迹分析表明症状性感染的幸存者和无症状的受试者血清中IgG抗体主要目的是对抗NP和VP40，以及在少数情况下，对抗VP35[8,12]。
据报道从未有过出血热临床症状或住在非疫区[17]的阳性个体的血清有相似的结果。
从1995年埃博拉暴发在Kikwit（金）2名幸存者的RNA构建的抗体噬菌体展示文库也表现出以NP，GP和SGP[18]反应的存在的抗体。
很少有对人EBOV蛋白B细胞抗原表位的进一步资料。
因此，本研究的目的是首次使用抗EBOV的IgG+病人的血清确定GP，NP，VP40显性和VP35的免疫抗体特异性抗原表位。
MaterialsandMethods材料和方法
BcellepitopemappingB细胞抗原表位映射
InordertoidentifylinearepitopesandtocharacterizeimmunodominantsitesinEBOV,weappliedepitopemappingtofourEBOVproteinsrepresentingthemaintargetsofthehumoralresponse,namelyVP35,VP40,NPandGP.Fivehundredandsixpeptides（consecutive15-merswithanoverlapof11aminoacids（aa）weresynthesizedbyEurogentec（Belgium）.Thepeptidesspannedthe676aaofGP（162peptides）,the739aaofNP（182peptides）,the326aaofVP40（79peptides）andthe340aaofVP35（83peptides）,asdeducedfromtheEBOVgenomeisolatedduringthe1995outbreakinKikwit,DRC[19].Eachlyophilizedpeptidewassolubilizedindimethylformamideandadjustedtoafinalconcentrationof5mg/mLwithphosphatebufferedsaline（PBS）beforeuse（Sigma,France）.
为了识别线性表位和表征免疫位点EBOV，我们采用表位映射到四个EBOV蛋白代表人体的体液应答的主要对象，即VP35，VP40，NP和GP。
五百零六肽（连续15聚体与11个氨基酸的（AA）的重叠）由EUROGENTEC公司（比利时）合成。
按照在基奎特、刚果（金）[19]1995年EBOV基因分离爆发期间来推断，该肽横跨676个氨基酸的GP（162肽），739个氨基酸的NP（182肽），326个氨基酸的VP40（79肽）和340个氨基酸的VP35（83肽）。
每个冻干肽使用前（Sigma公司，法国）溶解于二甲基甲酰胺并用磷酸缓冲盐水（PBS）调节至5毫克/毫升的终浓度。
Ebolapatientsera埃博拉患者血清
WeusedserumsamplesfromEBOV-infectedpatientscollectedduringtheoutbreaksinthevillagesofMayibout,Booue´（1996）andMekambo（2001）inGabon（Figure1）.ThefirstoutbreakhitthevillageofMayibout,locatedinnorth-easternGabon,fromJanuarytoFebruary1996,causing10non-fatalclinicalcasesand21deaths[6].Thesecondoutbreakcaused45deathsamong60casesbetweenOctober1996andMarch1997intheBooue´area,150kmsouthwestofMayibout[6].TheinfectionspreadtoseveralvillagesaroundBooue´.ThethirdoutbreakoccurredbetweenOctober2001andMay2002intheMekamboareaofGabonandtheMbomoareaofRepublicofCongo,150kmeastofMayibout[20].Atotalof207humancases（58survivorsand149deaths）wererecorded.Atotalof298humancasesand215deathswerereportedduringthesethreeoutbreaks.SerafromtwogroupsofsurvivorswereusedtomapBcellepitopes.Thefirstconsistedof15storedseracollectedduringthethreeoutbreaksfromsurvivorsoflaboratory-confirmedinfection,sevendaysaftertheendofsymptoms（Survivorgroup#1）[8,12].Thesecond（Survivorgroup#2）consistedofseracollectedin2008fromasurvivorofthe1996Mayiboutoutbreak,twosurvivorsofthe1996–1997Booue´outbreakandthreesurvivorsofthe2001Mekambooutbreak[15].EarlyhumoralresponsestoEBOVwereanalyzedinthefirstsurvivorgroup,andlatehumoralresponseswereanalyzedinthesecondgroup.Alltheindividualswereadults（.16years）,exceptforpatient#19whowas7yearsoldandpatients#1and#2whowere15yearsold.Wealsoscreened21serafromEBOVIgG-seropositiveadultswhohadneverhadclinicalsignsofhemorrhagicfeverorwholivedinnon-epidemicareas.Theseindividuals,selectedrandomlyinvariouspartsofGabon,hadtestedpositiveforanti-EBOVantibodiesinanindirectIgGELISAandbywesternblot[17].Theylivedinruralvillageswithfewerthan300inhabitants,locatedinthenineadministrativeregionsofGabon.Asnegativecontrols,werandomlyselected20individualsfromGabonwhohadtestednegativeforEBOVbyindirectELISAandwesternblotmethods,asdescribedelsewhere[13,17].
我们用从Mayibout，博韦（1996年）和加蓬（图1）的梅坎博（2001年）的村庄暴发期间收集到的EBOV感染患者的血清样本。
第一次爆发袭击Mayibout村，位于北东部的加蓬，1996年1月至2月，造成10例非致命性临床患者和21人死亡[6]
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