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三、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件

3.1李氏木霉来源的蛋白酶的功能类别及作用机理

3.1.1功能类别

李氏木霉来源的酸性真菌蛋白酶的底物特异性不强，能催化水解广谱的蛋白质水解。

其催化中心P1和P1'位点更偏好疏水残基，但也接受P1为赖氨酸残基，这一催化特性可导致该蛋白酶能活化胰蛋白酶原。

该蛋白酶不会凝结牛奶。

李氏木霉来源的蛋白酶是特别为在酸性条件下，谷物加工和果汁生产而开发的一种酶制剂产品。

目前商业化的蛋白酶主要有米曲霉，黑曲霉和枯草芽孢杆菌来源。

由于李氏木霉本身就产蛋白酶，通常李氏木霉来源的蛋白酶基本作为其他李氏木霉产酶制剂的次要成分。

近些年来，本申报的李氏木霉生产菌株是市场上首个用李氏木霉生产其本身蛋白酶达到了商业化可行的表达水平。

该蛋白酶可以取代当前市面上的一些其他来源的蛋白酶，甚至可以取代一部分在稀亚硫酸溶液浸泡玉米粉生产玉米浆工艺中使用的二氧化硫。

自克隆的李氏木酶生产菌株与同等的非转基因菌株相比较具有产酶效率更高，生产过程更加稳定，从而节约了宝贵的资源，包括原料、能源和水的优点，并且自克隆菌株不携带任何外源基因。

3.1.2作用机理

蛋白酶AFP的应用有很多，该酶可水解各种蛋白质，其作用于肽键，主要生成各种不同分子量的多肽、小肽直至氨基酸。

在其应用中，蛋白酶AFP作为加工助剂使用，在最终食品中并不存在。

李氏木霉来源的蛋白酶可用于玉米湿磨工艺提高淀粉得率，缩短生产时间；也可用于酒精发酵，非柑橘类果汁的生产和柑橘类果汁生产中的果肉的脱胶过程提高果汁产率。

该蛋白酶的广谱底物范围和酸性最适pH让它可以在谷物加工的酸性条件下直接作用，下图是该蛋白酶的最适反应pH曲线。

蛋白酶AFP的耐酸性在其应用中起到了很大的作用，其最适作用pH范围为3.0-4.5。

反应条件：

37︒C，30分钟，0.7%（w/v）高氮基纯化酪蛋白

图3-1、李氏木霉蛋白酶的最适反应pH曲线

在酒精发酵生产中，AFP蛋白酶还可以降解谷物中的蛋白质，产生酵母生长所必需的氨基酸，降低加工过程所需额外添加的氮源（尿素或无水氨），起到促进酵母分裂繁殖及生产酒精的能力。

3.2拟添加的食品中添加与否的效果对比

3.2.1蛋白酶AFP在玉米湿磨工艺中添加与否的效果对比

传统的玉米湿磨工艺是一个投资很大且相当耗能的过程，玉米湿磨工厂大约21%的投资和能耗发生在浸泡阶段。

浸泡工艺需要30-40︒C的热水软化玉米，并需要添加二氧化硫来破坏二硫键，以释放被蛋白质包裹的淀粉颗粒。

浸泡过程有利于蛋白质在随后的湿磨过程中与淀粉分离开来。

传统湿磨工艺中的浸泡过程相当耗时，通常需要至少24小时使玉米吸水软化，接着是较长时间的浸泡，以利于淀粉更好地释放出来，因此，浸泡时间至少需要24-36小时。

酸性条件不仅有利于玉米的浸泡和淀粉的释放，溶解在水中的二氧化硫也是湿磨过程中很好的抑菌剂，而浸泡所需的二氧化硫饱和浓度约为4000ppm。

酶法玉米湿磨工艺，可以有效缩短玉米的浸泡时间，提高淀粉得率。

通常的做法是在湿磨过程中添加蛋白酶，并把这种粉碎方式称为酶法湿磨（EnzymaticMilling）。

这种新的酶法湿磨工艺可以有效地降低运行的能耗，进一步扩大处理能力，给酶法湿磨工厂中带来的好处如表3-1所示。

项目

蛋白酶AFP添加与否效果对比

浸泡阶段二氧化硫使用量

蛋白酶AFP的添加使二氧化硫的使用量由4000ppm降低到200ppm，降低幅度为95%，从而减少了二氧化硫对工人身体健康的危害及其对环境的影响。

浸泡时间

蛋白酶AFP的添加使浸泡时间由24-36小时大幅降低到6-10小时，从而大幅度提高了生产效率。

玉米胚乳中包裹淀粉的释放

蛋白酶AFP的添加使玉米胚乳中包裹的淀粉更容易释放出来，提高淀粉的得率。

粉碎

蛋白酶AFP的添加使粉碎变得相对容易，较粗的粉碎细度即可达到同样的释放效果，从而提高设备利用率，同时大幅减少粉碎电耗。

新建工厂固定投资

蛋白酶AFP的添加可以有效地降低运行的能耗，进一步扩大处理能力，无需购买过多浸泡等工艺所需设备，可以降低固定资产的投资。

表3-1蛋白酶AFP在玉米湿磨工艺中添加与否的效果对比

杰能科公司对蛋白酶AFP的使用效果进行了研究（参见表3-2）。

从试验的结果看，淀粉的得率大约提高了1.22%，这部分多出的淀粉主要是在酶法湿磨过程中从纤维和蛋白质中分离出来的。

蛋白质的得率提高了大约3.52%。

在淀粉中残留蛋白含量以及淀粉的糊化特性方面，酶法湿磨工艺均好于传统的湿磨工艺。

由于蛋白酶的添加，尽管缩短了浸泡时间，蛋白质的得率反而得到提高。

成分

酶法湿磨得率（%）

传统湿磨得率（%）

增减（％）

可溶性固形物

0.12

4.30

-4.18

纤维

9.83

10.20

-0.37

淀粉

70.22

69.00

1.22

蛋白质

12.80

9.28

3.52

表3-2蛋白酶AFP添加与否对玉米湿磨产物的影响

3.2.2蛋白酶AFP在酒精生产工艺中添加与否的效果对比

图3-2对比了在有无添加蛋白酶AFP的情况下，酒精发酵过程中酒精产率的曲线。

图中的蓝线代表生产工艺仅添加了葡糖淀粉酶，而红线代表生产工艺添加了葡糖淀粉酶和蛋白酶AFP。

葡糖淀粉酶和蛋白酶的联合作用比单独添加葡糖淀粉酶在传统的酒精发酵生产中可提高酒精得率。

由此可见AFP的使用可在提高发酵速度的同时增加酒精产率。

图3-2添加蛋白酶AFP对酒精发酵的影响

同时，由于在生产工艺中添加蛋白酶，可水解谷物中的蛋白质，产生酒精酵母生长所必需的氨基酸，降低加工过程所需额外添加的氮源（尿素或无水氨），起到促进酵母分裂繁殖及生产酒精的能力。

下图3-3对比了添加400ppm尿素和0.085kgAFP酶制剂/吨干玉米生产工艺对酒精产率的影响。

图3-3添加蛋白酶AFP与尿素对酒精产率的影响

杰能科公司针对酒精工业设计生产的蛋白酶AFP产品的优点总结如表3-3所述：

项目

蛋白酶AFP添加与否效果对比

作用范围

蛋白酶AFP水解作用强，水解范围广。

酵母生长所需氮源

传统工艺需要外加氮源；而蛋白酶AFP水解蛋白质的产物游离α-氨基氮是酵母生长繁殖的最佳氮源，因此发酵过程无需额外添加氮源。

发酵过程

蛋白酶AFP的添加促进了酵母的繁殖和增殖，酵母强壮数量增加，从而减少了杂菌污染的机会，并使得发酵更加完全彻底，原料能被充分利用，提高了淀粉转化率。

发酵成熟醪

蛋白酶的水解作用会使发酵成熟醪的粘度明显降低，有利于浓醪发酵、发酵罐的清洁以及酒精蒸馏。

副产物的产生

由于发酵速度快，缩短发酵时间，因此降低了副产物（甘油、乳酸等）的产生，可使整个工厂的生产能力提高10-15%左右。

蒸馏

由于蛋白酶AFP对原料中的蛋白质分解得比较彻底，能够减少蒸馏清液中的悬浮颗粒和剩余碳化合物的含量，提高了蒸馏与蒸发的效率。

酒精得率

蛋白酶AFP的添加可在提高发酵速度的同时增加酒精产率。

DDGS（干全酒糟）

发酵中的糖份被酵母充分利用，蒸馏酒糟在高温干燥制成DDGS的过程中，颜色较浅，外观质量提高。

表3-3添加蛋白酶AFP对酒精生产的有利影响

3.3与同一功能类别的食品添加剂效果对比

3.3.1蛋白酶AFP在玉米湿磨工艺中与同一功能添加剂使用效果对比

传统的玉米湿磨工艺需要添加二氧化硫来破坏二硫键，以释放被蛋白质包裹的淀粉颗粒，蛋白酶AFP与二氧化硫的使用效果对比如上文所述；蛋白酶AFP与其它具有同一功能的蛋白酶制剂的使用效果对比如表3-3所述。

由此可见，蛋白酶AFP在玉米湿磨工艺中的使用效果优于同一功能添加剂。

项目

蛋白酶AFP与同一功能添加剂使用效果对比

作用条件

由于蛋白酶AFP是在酸性条件下起作用，因此，玉米湿磨所需的酸性条件对蛋白酶AFP是最佳的，而其它蛋白酶无法在酸性环境下发挥作用或作用效果不佳

耐酸性能

蛋白酶的耐酸性能强，能够在极低的pH值条件下水解蛋白质，这是其它蛋白酶产品无法比拟的

产品规格

蛋白酶AFP活力高、纯高度、细菌总数极少，完全符合食品安全标准要求

表3-4蛋白酶AFP与其它来源蛋白酶在玉米湿磨工艺中使用效果的对比

3.3.2蛋白酶AFP在酒精生产工艺中与同一功能添加剂使用效果对比

众所周知，酒精生产的重要环节是发酵，而发酵的重点是酵母，它的质量的好坏将直接影响到酒精发酵的水平，关系到一个工厂的绩效，是每一个酒精工厂所控制的重点。

一般来说，外界因素可以影响酵母的代谢机制，如发酵醪液的温度、pH值、浓度、营养成分等等，都可以影响酵母的生长和代谢。

作为酵母营养物质所必需的碳源来自糖化好的可发酵性糖，而氮源，酵母并不能利用原料自身所含有的这些成分（蛋白质），一般仍需要外加补充利用，通常分为无机氮源（尿素、硫酸铵等）和有机氮源（氨基酸、多肽等）。

近些年的研究表明，虽然一些无机氮源（如尿素）可以很快降解为氨分子和二氧化碳，但是会在酵母的代谢过程中形成聚氨酯类的化合物，而此类物质已经被证实是致癌物，所以许多国家已经禁止在生产食用酒精的过程中添加尿素作为氮源。

我国卫生部于2011年11月发函明令禁止尿素作为食品加工助剂用于食品加工。

由于蛋白酶AFP是在酸性条件下起作用，而葡糖淀粉酶水解淀粉与酵母发酵也都是在低pH值下进行，因此，pH值为4.0-4.5的发酵醪对于葡糖淀粉酶、蛋白酶AFP与酒精酵母都是最佳的，蛋白酶AFP可以将原料中的蛋白质水解得比较彻底，其产物FAN（游离α-氨基氮）是酵母生长繁殖的最佳氮源。

蛋白酶AFP与同一功能添加剂使用效果的对比如表3-5所描述。

项目

蛋白酶AFP与同一功能添加剂使用效果对比

作用范围

蛋白酶AFP水解作用强，水解范围广

作用条件

由于蛋白酶AFP是在酸性条件下起作用，而葡糖淀粉酶水解淀粉与酵母发酵也都是在低pH值下进行，因此，在pH值为4.0-4.5时的发酵醪对于葡糖淀粉酶、蛋白酶AFP与酒精酵母都是最佳的。

糖化好的醪液无需调节pH就可直接进行发酵，同时也节省了时间

耐酸性能

蛋白酶AFP的耐酸性能强，能够在极低的pH值条件下水解蛋白质

产品规格

蛋白酶AFP活力高、纯高度、细菌总数极少，完全符合食品安全标准要求，且能减少发酵染菌的机会

表3-5蛋白酶AFP与其它来源蛋白酶使用效果的对比

由此可见，Y间发酵速度的同时增加酒精产糖淀粉酶作为葡糖淀粉酶的构形源及水。

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX与其他同一功能产品相比，蛋白酶AFP除了耐酸性强的优点外，其达到食品级标准，细菌总数低的优点，能减少发酵染菌的机会，这一点对发酵生产至关重要。

我们相信，随着蛋白酶AFP生产成本的进一步降低，随着人们食品安全意识的逐步增强，蛋白酶AFP在我国酒精生产中的应用必将成为发展趋势。

3.3.3其他优点

蛋白酶AFP是由自克隆的李氏木霉生产菌株生产，该生产菌株能非常高效地表达目的基因酸性真菌蛋白酶，下表比较了AFP与国内目前市售的一些蛋白酶的催化活性，数据显示无论是从酶制剂的单位酶活还是蛋白浓度来说都具有明显优势，产生FAN（游离α-氨基氮）的能力最强。

产品

在pH3.0的酶活（U/ml）

蛋白浓度（mg/ml）

FAN

AFP

~100,000

47.8

++++

市售产品1

59,124

23

+++

市售产品2

2790

7

+

市售产品3

12,257

19

++

表3-6蛋白酶AFP与市售蛋白酶的活力对比

3.4其他有关技术必要性的资料

蛋白酶AFP的使用量：

该酶产品在玉米湿磨中的使用量为0.009g/kg玉米，在酒精生产中的使用量为0.16g/L纯酒精。

蛋白酶AFP的灭活：

蛋白酶AFP的预期用途包括玉米湿磨及酒精生产。

玉米湿磨所产生的淀粉主要有两种用途，一种是烘干成干淀粉作为最终产品，烘干过程中的高温使AFP很快失活；另外一种是作为其它产品的原料，其后续工艺中通常有高温蒸煮过程，AFP在高温下失活。

生产酒精时，在发酵阶段加入AFP，发酵结束后的蒸馏过程中温度达到100℃，AFP很快失活。

综上所述，在最终产品中没有蛋白酶AFP的存在。