植物病理学实习总结报告.docx
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植物病理学实习总结报告
植物病理学实习总结报告
学院：
资源环境学院
年级：
2008级
专业：
植物保护微生物工程
组别：
第三小组
姓名：
***
学号：
************
指导老师：
李敏慧、刘琼光、周国辉、徐大高、杨媚、
谢辉、何艺郡
一、前言--------------------------------------------------------3
二、实习目的与意义----------------------------------------3
三、实习内容与方法----------------------------------------3
实验一植物病害标本的采集和制作------------4
实验二植物病原的分离与培养-------------------8
实验三植物病原真菌玻片标本制作------------12
实验四植物病原线虫的分离及形态观察------14
实验五植物病毒（香蕉束顶病毒）检测------15
四、实习（验）结果与分析------------------------------18
五、收获与体会----------------------------------------------19
六、参考文献-------------------------------------------------20
植物病理学实习总结报告
戴泽翰20083020050808植保微生物1班
一、前言
植物病理学是主要研究引起农作物病害发生的各种生物与非生物引子及其致病机制、病原物与寄主间相互关系和控制病害发生、减轻发病程度、减少病害所致损失的原理及具体措施的一个重要农业学科。
学习基本的植物病理学、流行学知识，掌握常见农业病害鉴别和病原物采集、分离等技能，是对作为高等农科院校植保专业学生提出的要求。
为巩固和印证所学的植物病理知识，增强学生对本地区主要作物及主要植物病害的直观认识，我校资环学院为植保专业安排了植物病理学课的实习，以加强学生理论结合实际，提高分析问题和解决问题的能力，
二、实习目的与意义
（一）巩固和印证所学植物病理学基础理论知识
（二）熟练掌握植物病理学实验操作技能
（三）通过室内外观察，认识本地区主要作物及主要植物病害的形态特征
（四）加强理论联系实际，提高分析问题和解决问题的能力
三、实习内容与方法
（一）植物病害标本的采集和制作及常见病害鉴定
（二）植物病原的分离与培养
（三）植物病原真菌玻片标本制作
（四）线虫病害标本的采集、分离与鉴定
（五）植物病毒（香蕉束顶病毒）检测
实验一植物病害标本的采集和制作及常见病害鉴定
一、实验目的
植物病害标本是植物病害及其分布的事务性记载，有了标本即可在室外观察的基础上，开展室内各方面的工作，特别是病害诊断和病原物的分离鉴定工作，没有合格的标本更无从谈起。
因此，病害标本的采集和制作是植物病害研究和实验的基本建设工作，植病标本的采取和制作是植保人员必须掌握的的基本技术之一。
通过本次标本采集和制作实践实习，学习标本采集和制作的常用方法
二、实验步骤
（一）标本采集
1、外出实习地点
（1）华农大农场
（2）华农大增城宁西基地
（3）广州白云区蔬菜地
2、采集方式与标本采集要求
（1）直接从病害植株以手、刀、剪刀提取病样。
（2）症状应具有典型性。
标本应有典型的病状和病症，最好有不同阶段和不同部位的症状。
这样才能使标本起到帮助人们正确识别病害的作用。
（3）真菌病害标本应采集有子实体的。
对于真菌病害来说，鉴定病原物是正确诊断病害的重要条件之一，因此要求真菌病害标本必须有病菌的子实体。
（4）每种标本上的病害种类应力求单纯。
如果一份标本上同时有几种病害，就会
混淆视线，影响鉴定，这样就没有适用价值。
（5）采集时应进行必要的记载，以辅助标本不足。
记载的内容应包括：
寄主名称、发病情况、环境条件、以及采集日期、地点、采集人姓名等。
（6）寄主的鉴定也很重要，有些病害如锈病，不知道寄主是无法鉴定的。
对于不认识的寄主植物。
应将寄主鉴定所必需的部分，如枝、叶、花及果实等部分都采集齐全。
（7）适于干制的标本，应随采随压于标本夹中，尤其容易干燥卷缩的标本如水稻、小
麦的叶片，最好立即夹在厚书本中，否则叶片失水卷缩后无法展平。
（8）柔软多汁或腐烂的标本，应用纸袋或标本纸包好，然后置于标本箱中，以免污染和挤坏标本，妨碍鉴定。
（10）黑白粉病、锈病、霜霉类标本等由于病菌孢子极易散落，所以采集时应用纸袋或标本纸包好后，再置于采集夹中或采集箱中，以免混杂妨碍鉴定。
（11）每种标本采集的数量不宜过少，以便在制作和应用中留有余地。
（二）标本制作
1本实验采取干制法制作腊叶标本。
2基本原理：
利用标本纸快速把病样标本脱水，并加压把标本压成美观的平面标本。
干燥愈快愈能保持标本原有的色泽。
3操作：
（1）把适于压制的病样如植物的茎、叶以及去掉果肉的果皮等，整形后分层压在标本夹中，放一层标本纸（每层3-4张）放一层标本，每个标本夹的总厚度以三寸左右厚为宜，用绳子将标本夹压紧。
（2）每隔一至两天就打开标本夹检查标本纸的干湿程度，及时更换较湿的标本纸。
在第一次换纸时，同时将标本整形，使其达到既美观又便于观察的要求。
（3）将完全干燥的病样标本用透明胶、双面胶等固定在白纸上，纸张右下角写上标签（标签内容依次为寄主名称、病害名称、病原物中文名及拉丁文学名、采集地点、采集人姓名、采集日期、）
（三）实验结果
1、制作了丝瓜霜霉病、玉米小斑病、水稻纹枯病、水稻白叶枯病、玉米黑粉病、茶轮斑病、竹黑痣病、玫瑰黑斑病、稻曲病的标本。
（见图1-1,1-2）
图1-1
图1-2
2通过外观形态观察及显微观察结合，鉴定出了一些常见的病害：
病害名称
鉴定状态
水稻白叶枯病
已鉴定
水稻细菌性条斑病
已鉴定
玉米锈病
未鉴定（显微观察仅见夏孢子）
玉米小斑病
已鉴定
花生黑斑病
已鉴定
花生锈病
未鉴定（显微观察仅见夏孢子）
花生褐斑病
未鉴定
南瓜花叶病毒病
未鉴定
南瓜炭疽病
未鉴定
莴苣霜霉病
已鉴定
水稻纹枯病
已鉴定
番茄晚疫病
未鉴定
豇豆煤霉病
未鉴定
辣椒炭疽病
未鉴定
丝瓜白粉病
已鉴定
丝瓜炭疽病
已鉴定
白菜软腐病
已鉴定
玉米大斑病
已鉴定
茶炭疽病
已鉴定
茶轮斑病
已鉴定
茶白粉病
已鉴定
茶藻斑病
未鉴定
茶云纹叶枯病
已鉴定
香蕉枯萎病
未鉴定
水稻胡麻叶斑病
已鉴定
芋疫病
未鉴定
白菜霜霉病
已鉴定
水稻叶鞘腐败病
未鉴定
白菜黑腐病
已鉴定
茄褐纹病
已鉴定
玫瑰黑斑病
已鉴定
番茄早疫病
未鉴定
甘蓝黑腐病
已鉴定
竹子黑痣病
已鉴定
毛豆锈病
未鉴定（显微观察仅见夏孢子）
表1-1
实验二植物病原的分离与培养
一、实验目的
在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。
通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、实验前准备
（一）清洁环境：
分离工作严格说应在无菌条下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。
若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。
地上多洒些水，以消除室内尘埃，分离开始前准备好一切用品，避免工作过程中频繁走动，以破坏环境带来杂菌，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。
（二）实验材料及用品准备
1病组织材料
玉米小斑病病叶
水稻纹枯病病叶
水稻白叶枯病病叶
2用品准备
0.1%升汞溶液（广口瓶盛装）；
95%酒精（广口瓶盛装）；
1000ppm链霉素；
瓶装牛肉膏蛋白胨培养基；
瓶装马铃薯琼脂培养基；
此外，还有以下备品，无菌水1瓶，灭菌培养皿6付，灭菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和镊子各1把，移植环，移植钩、酒精灯、珐琅盘和试管架各1个，毛巾1条，玻璃铅笔1支及火柴等。
三、实验步骤
（一）玉米小斑病与水稻纹枯病原分离（组织分离法）
1、取样。
取患玉米小斑病、水稻纹枯病的病样，分别切取材料2~3mm长的病健交界处。
2、表面消毒。
将病组织用清水洗净，接着放到75%酒精里浸泡30s，然后放到0.1%升汞里浸泡0.5~1min，最后用无菌水洗3次。
3、培养。
把材料放到PDA培养基上并在25℃培养箱里培养2~3天，观察结果。
（二）水稻白叶枯病原分离（稀释分离法）
1消毒：
将剪下的植物组织用清水洗干净，然后用75%的酒精浸泡30秒，在用0.1%的升汞洗0.5~1分钟，最后用无菌水洗涤3次。
2捣碎：
取用一个灭菌小皿，向内滴加1~2滴无菌水，然后灭菌剪刀剪碎已洗涤好的组织，放入水中静置5-10分钟，制备成菌悬液。
3划线：
用接种环取一环菌悬液进行平板划线。
4培养：
将平板倒置，写标签，至于28-30摄氏度培养，2天后，观察分离结果。
四、实验结果与分析
玉米小斑病分离培养的很成功，但水稻纹枯病全部都失败了。
玉米小斑病病原平板培养菌落的形态见图2-1。
菌落大体呈圆形，营养菌丝呈黑色，以接种样叶为中心辐射生长，菌落较大型。
靠近菌落中心长有白色霉状物。
水稻纹枯病病菌分离培养失败，我认为有以下原因：
首先、病样选取有问题。
我们组选取的病叶保湿措施做得不够好，病叶枯死面积大，虽实验过程尽量选取病健交界出，但是活菌数少；另外，基于全班只有少数几个人做成功，我认为可能位于采集地的病原菌处于不良环境或进入菌落生长的衰亡期，活菌数本身就不多；最后可能我们采取病样的地方太单一，病样叶均采自同一亩田。
其菌落形态见图2-2（引自第四组）。
菌落大小中等，白色透明，背光难以看清，需置于深色背景以便观察。
菌落以接种叶样为中心，自叶脉向外两侧呈放射状生长。
水稻白叶枯病病原为细菌，分离时采取划线稀释分离法。
所有分离培养均成功，并取得了较好的单个菌落（见图2-3,2-4）。
水稻白叶枯病菌菌落较小，呈圆形，金黄色，半透明，表面光滑，向上隆突。
图2-1
图2-2（引自第四组吴瀚嵘）
图2-3
图2-4
实验三植物病原真菌玻片标本制作
一实验目的
观察植物病原物的形态，进行病原物的分类鉴定，研究受病组织结构病变、受病植物组织与病原物的解剖学关系以及病原物的保存备用等，都需将材料制成适当的显微玻片标本。
因此，徒手制片技术也是植物病理学研究的重要手段之一。
通过本次实验系统学习常用的徒手制片技术，为普通植物病理学和农业植物病理学的深入学习以及以后开展病理学的有关研究工作奠定坚实的制片技术基础。
二内容、材料和方法
实验材料：
美人蕉锈病病叶、竹子黑痣病病叶
实验器材：
解剖针、剪刀、载玻片、盖玻片、无菌水
三实验步骤
（一）美人蕉锈病病原装片制作
1取美人蕉锈病病叶，用剃刀或解剖针轻轻挂取美人蕉叶背的黄色锈突，使锈突刮破并使刀片或针尖沾上黄色粉状物。
2在载玻片上点一滴无菌水，将针尖或刀片浸于水中，使锈粉进入漂散于水滴中。
重复以上操作，待获得足够锈粉后，盖上盖玻片。
3显微镜下观察。
4鉴别结束后，将载玻片取走，风干水分后，滴一滴绵蓝乳酚油，盖上盖玻片，贴上标签。
（二）竹子黑痣病病原装片制作。
1取竹子黑痣病病叶，选取带黑色突起较多的部位为切面，用刀片切取0.5*1cm规格的薄片。
2切得所需薄片后，置于滴有无菌水的载玻片上，盖上盖玻片。
用钝物轻轻压平，置于显微镜下观察。
3鉴别结束后，将载玻片取走，风干水分后，滴一滴绵蓝乳酚油，盖上盖玻片，贴上标签。
四实验结果
如图3-1
图3-1
实验四线虫病害标本的采集、分离与鉴定
一实验目的
熟悉植物病原线虫的基本形态及其所致病害的症状特点，
学习土壤线虫的采集和分离，以及鉴定主要植物病原线虫的方法。
常见线虫种类的观察
二内容、材料和方法
塑料袋，铁铲，贝曼漏斗，解剖镜，显微镜，培养皿，酒精灯，解剖针等
三实验步骤
1，采样线虫多在植物生长高峰期，多数为夏末秋初。
丰富于根系土壤。
采时运用五点法，以植株为中心，取其根系五点取样。
取离地表10~20厘米深的土样。
每点取500~1000克，五点取后混匀，再倒出一些，最后取1000克。
2，分离（贝曼漏斗法）
分离时在漏斗内放大小适中的金属网，筛上铺纸巾，漏斗下面接橡皮管，橡皮管下接离心管，加样本于网的纸巾上，以水淹没后经之。
3，鉴定经过四个小时左右，取下离心管，再静置十分钟，吸去一半，把剩下的一半倒进培养皿，因为线虫多数沉淀了。
把培养皿置于解剖镜下观察，把线虫吸到玻片用低倍镜观察。
4，杀灭治理把线虫置于酒精灯火焰上灼烧30~60秒，线虫即死亡。
四实验结果
观察到较多无口针的腐生性线虫和少量的有口针的植物线虫，推测表明根部土壤附近含有大量线虫。
在解剖镜下线虫游动或卷曲，并沉淀，死后即伸直。
观察到标本滑刃线虫，垫刃线虫，螺旋线虫，纽带线虫，腐生性线虫。
实验五植物病毒（香蕉束顶病毒）检测
一实验目的
由于病毒甚为微小，在普通显微镜下看不到，也不能在一般培养基上培养，所以通常只能靠病状的表现及病毒的属性，进行诊断和鉴定。
在某些植物的病组织中，在一定时间内，尚能发生特殊的内含体，也可作为鉴定上的参考。
本实验的目的是识别植物病毒病的病状类型及其特点，了解病毒的一般性质，学习病毒病害的鉴定方法及其原理。
二实验步骤
（一）CTAB法提取香蕉叶片总DNA
1、2%CTAB抽提缓冲液，用前加0.2~1%巯基乙醇）在65℃水浴锅中预热。
2、取供试植物幼叶0.2g，置于研钵中加液氮研磨成粉末状。
3、在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅速加入600μL预热的抽提缓冲液，稍作研磨混匀
4、研磨液转入1.5mL离心管中，65℃水浴30~45min,期间不时摇匀。
5、加入300μL饱和酚，300μL氯仿/异戊醇（24：
1），剧烈振荡2~3min,
1200r/min，5min离心（室温）
6、取上清液置于新的离心管中。
加入等体积氯仿/异戊醇（24：
1），温和的混匀，
1200r/min，5min离心（室温）
7、取上清液置于新的离心管中。
加入1/10体积3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍体积冷无水乙醇，混匀，置于-20℃冰箱20min或过夜。
8、4℃下12000r/min，10min离心
9、弃上清液，沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇各洗一次，室温下风干，溶于200μLTE或双蒸水中，DNA制剂在4℃、-20℃、-70℃保存。
（二）PCR检测
1、PCR管编号
2、配制反应体系，设置阳性对照和阴性对照（共3个反应体系），配制如下：
1个反映体系
n个反映体系
DEPC水
16.8μL
n×16.8μL
10×PCRBuffer
2.5μL
n×2.5μL
dNTPMix
0.5μL
n×0.5μL
上游引物F
1μL
n×1μL
下游引物R
1μL
n×1μL
rTaq
0.2μL
n×0.2μL
3、加DNA模板
4、盖紧PCR管，放入PCR仪，
按所示程序进行扩增
（三）PCR反应产物的电泳
1、1.2％琼脂糖凝胶配制
称取1.2g琼脂糖，溶于100mL0.5XTBE电泳工作液中，放入微波炉加热熔化，室温下冷却至50℃左右，每配制100mL琼脂糖加入5µLEB替代物，混匀。
琼脂糖凝胶缓慢倒入制胶槽内，至胶厚约5mm，插上样品梳，待其继续冷却至固体，拔去样品梳。
2、上样
往电泳槽倒入0.5×TBE电极缓冲液（液面必须浸没凝胶上表面）
将琼脂糖凝胶放入电泳槽中（由负极向正极电泳）
用微量移液器吸取6µLPCR产物与1µL6Xloadingbuffer混合后，加入到凝胶上样孔中，每样品一个样孔，并设分子量标准样孔。
3、电泳及结果观察
将电泳槽与电泳仪相连接，接通电源（注意样品孔须位于负极）
5V/cm电泳20～30min。
电泳结束后，关闭电源，将制胶板从电泳槽中取出。
取出胶块置于凝胶成像系统或紫外光灯下观察、照相。
三实验结果
本组实验失败了。
紫外光灯下观察琼脂糖凝胶，可见本组试样除了Marker显色外，DNA样品、阳性、阴性均无显色。
其他组的结果则为，第二组第一样品显色，阳性没显色，但样品条带位置与五六组的阳性相符，说明香蕉束顶病毒DNA提取成功。
五六组只有阳性显色，第四组与本组结果一样。
分析结果，可能有以下原因导致实验失败。
1、实验原材料所带此病毒较少。
2、叶片磨得不够细，病毒DNA并未完全暴露或暴露较少。
3、加液氮研磨叶片时动作较慢，未及时加入抽提缓冲液（已加入巯基乙醇），导致解冻后内源性Dnase降解基因组DNA。
4、CTAB法提取香蕉叶片总DNA过程第9步中，用70%乙醇和无水乙醇洗涤DNA沉淀后未完全风干即转入低温冷藏并用于PCR反应，较高浓度乙醇使rTaq活性减弱，PCR反应受阻。
5、PCR中添加样品与对照时溶液不均匀导致并没吸取到所需DNA。
四实习心得和体会
在我看来，两个星期的植物病理学实习，对于我们来说，是一次洗礼，是一次转折。
得益于学院安排给我们植保专业的脱课实习，我们跳出了课堂，摆脱了枯燥无味的书本，获得了在大自然这个大课室中学习的机会。
在这次长达两个星期的实习中，我获益良多，有知识的增长、技能的提高，有意志的锻炼、耐心的考验、更有对我们心思缜密度的挑战、逻辑。
但最让我觉得重要的是，我意识到了两样品质对的一个科研人员的重要性：
严谨的治学态度和团体合作精神。
1外出实习，多知觉的学习——眼看，手触，耳听
日本的川岛隆太教授认为，包含多种知觉信息的集合对人脑刺激是最大的。
为什么人们喜欢看3D电影？
因为糅合了声光效果的信息媒体会让我们记得更深，脑波频振动更大！
以前上课，一节课的幻灯片下来，我们记下了多少页？
但实习结束后，至少我还记得玉米叶子上的锈突握在手里的感觉。
不下田，某些城市来的同学甚至不知道辣椒长啥样，虽然在树上看过。
而在田间听老师讲病理生理学、病害流行学、分类学知识似乎好玩得多。
2实验技能扎实提升
两个星期的实验，使我们的实验技能有了长足提升。
在某些方面的知识，比如说田间病样采集的常识还有土壤线虫的采样与分离方法等，在之前近乎为零。
分离纯培养的实验操作则是功课重温，使我们的这些技能更扎实。
3意志、耐性、细腻
每一天的外出和每一天的实验都是对我们意志的考验，采样的路不可能永远都是好走的，实验不可能永远都是易做易成功的。
让我记忆犹新的是竹子黑痣病切片制作的艰辛。
整整一个下午了，我们都纠结在一块小小的竹叶上。
人道读万卷书，走万里路，我们都是切了一万个切片了，就是鲜有成功。
那是对人注意力、小脑平衡力的挑战，大抵是我做实验以来做使人眼酸手累的活儿了。
但是过几天当我再次捡起刀片的时候，解剖镜下我的手似乎没有那么抖了。
4团结，就是力量
我们可以一个人做好一个实验，但不可能写好一篇文章，哪位科学家敢敢说自己从来不看参考的文献？
人的思维是有死角的，对于一位科研人员来说，心思必须尽量缜密，做事和计划要力图巨细无遗，但对于一个人来说，要求其做到完美无错似乎是对他吹毛求疵。
因而，思想的交流是我们成功的必经之途。
团队协作的重要性，是我在资料整理、PPT制作以及写这篇总结报告中感受最深的一样东西。
某个实验失败了，为什么失败，哪一点遗漏了呢，你为什么认为是这个原因呢：
实验数据不足了，结果与分析写不出来了，可以让我看看你们组的吗，可以引用一下你们组的图片吗，你的分析有点道理哦……有了伙伴，我们不需要一个人对着一大堆数据纠结了，我们不需要一个人完成一个80页的PPT了，我们不需要为自己1个小时都切不到合适的切片供观察而烦恼，总会有人相机里有相应的照片，总会有人这个实验步骤中这个药剂的用途，总会……如果你认为我们会有抄袭之嫌那就错了。
我们厌恶自己的智力劳动成果被窃取，谁也不喜欢自己熬费苦心想出来的分析被人简单的一个粘贴就拿走了……总而言之，teamwork是如此之重要，我们会发扬下去！
六、问题和建议
1希望能增加做实验或实习的时间。
农业植物病理学是一门理论与实践联系很强的学科，离开田间搞研究只不过是纸上谈兵。
好比学一门外语，学好一门外语、最好的方法就是使用它。
2本次实习安排得不甚严谨。
比如说需要无菌操作的地方没用提供无菌操作台，又比如发给学生的实习指导上未必全有都与实际操作相符的信息。
诚然，迫于经费和和时间、空间的原因，我们不能做到像诸位老师真正搞科研时的实验条件。
但是，实验既要求，又锻炼科研人员严谨、认真、细腻的治学态度。
若实验本身就漏洞百出，岂不是与培养学生具有严谨的科研态度、治学精神的初衷相违吗？
为什么有些同学上了大学后觉得大学不外如是，为什么有些同学四年后觉得自己没学到应该学到的东西呢？
为什么老师总是不满学生素质和知识不足呢？
有自身兴趣、学习态度等方面的原因，是否也有教学方式和动机不符的恶性循环的原因呢？
3尝试大胆些，让学生们完全支配一个实验。
为什么我们都认为美国的大学好？
因为美国的本科教育极力抵制专业知识的抗拒，而是重视技能的培养，他们会让学生完全计划和进行一个科研项目，从立项、仪器的准备，用品用量的计算和安排，到实验的执行、数据的处理等等，让学生全权包办。
不放心学生的实验技能？
害怕学生搞砸了浪费经费？
那是因为没有让学生肩负过责任，大纲为我们做，原理为我们找，材料为我们安排好，我们只需要遵循实验指导做就可以了，我们有时甚至不需不知道做每一步的原因是什么。
迫于教学资源分配和设施、计划的时限等等原因，我们不能做到世界一流大学的水平，但是否有一些除了硬件以外的地方我们可以做得比他们好呢？
一点拙见，望老师笑涵。
七、参考文献
赖传雅等.2008.农业植物病理学华南本第二版.北京:
科学出版社
陈利锋等.2007.农业植物病理学第3版.北京：
中国农业出版社
赵亚华.2005.生物化学与分子生物学实验技术教程.北京：
高等教育出版社
许志刚.2002.普通植物病理学.北京：
中国农业出版社
徐文耀.2006.普通植物病理学实验指导北京：
科学出版社，
贺运春.2002.植物病害制片技术北京：
中国农业出版社
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