食品质量安检测技术W43044HLB柱MCM柱在兽药残留检测中的应用微教材.docx

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食品质量安检测技术W43044HLB柱MCM柱在兽药残留检测中的应用微教材

《农产品/食品质量安全检测技术》课程-微教材

微课编号

W4404

微课名称

HLB柱、MCX柱在兽药残留检测中的应用

所属模块

兽药残留检测

子模块

M4-4兽用违禁促生长药物的检测——猪肉中瘦肉精（盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺）的检测

关键词

固相萃取；HLB柱；MCX柱；瘦肉精；猪肉

是否通用

√通用农产品食品

是否重点建设

是√否

微课类型

讲授型，实验实训型

微课形式

混合拍摄式

微课类型

讲授型，实验实训型

教学目标

了解固相萃取前的样品处理目的和要求；掌握基质固相分散萃取与分散固相萃取的概念和用途；了解固相萃取技术发展趋势；了解HLB柱特点及MCX柱特点；通过猪肉中瘦肉精残留的净化操作掌握固相萃取仪的操作。

教学内容

知识点

技能点

1、固相萃取前的样品处理

2、基质固相分散萃取与分散固相萃取

3、固相萃取技术的展望

4、HLB柱特点

5、MCX柱特点

1、固相萃取仪规范操作

2、瘦肉精残留净化的规范操作

知识讲解

一、固相萃取的概述

1、固相萃取前的样品处理

固相萃取利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，或加热解吸附达到分离和富集目标化合物的目的。

是用高效、高选择性的固体物质作为萃取剂进行萃取的样品预处理技术。

固相萃取技术是基于固态（SPE吸附剂）与液态或气态样品之间的相互作用力而实现将目标化合物从样品基质中分离出来的，这项技术的局限性之一在于要求样品必须是液态或者气态，因此如果样品是固态或者半固态，必须将其先制备为液体形态才能进行固相萃取操作。

 即使是液体样品，固相萃取也有其额外的苛刻要求，即液体必须洁净度高，不能有悬浮物或其它固体颗粒，否则会在柱前形成堵塞，无法继续过柱及洗脱操作。

所以固体样品要制备成液体，液体样品最好还要过滤。

 固相萃取前的样品预处理主要目的归为三点：

1将目标化合物溶解在适当的液体中；

2、通过预处理使目标化合物呈现被固相萃取柱保留的游离状态

3、调节液体样品的pH值、离子强度和黏度。

在建固相萃取方法过程中，样品基质的性质与目标化合物同样重要，因为样品基质的pH、极性或非极性特征，离子强度等对目标化合物在SPE柱的保留产生影响。

以生物组织的预处理为例，生物组织中有大量不溶于水和有机溶剂的蛋白质等组分，在分析前必须除去，同时目标化合物及其代谢物在生物组织中可能会与蛋白质生成共轭物，必须通过适当方法将这些化合物从蛋白质分子中释放出来。

常用的方法有蛋白质沉淀，强酸水解，酶水解，超声波萃取，加速溶剂萃取及微波辅助萃取等。

对于生物组织样品来说，固相萃取往往不是萃取手段，而是净化手段。

2、基质固相分散（MSPD）和分散固相萃取（d-SPE）

基质固相分散（MSPD）是1989年美国StarenBarker首次提出并给予理论解释的一种崭新的SPE技术，可同时分散和萃取固体、半固体样品。

基于SPE的MSPDE技术，兼有SPE的优点，而且在操作上比SPE更简便，提取、净化能一步完成。

减少样品损失。

其基本操作是将试样直接与适量反相填料研磨、混匀制成半固态装柱淋洗。

MSPDE浓缩了传统的试样前处理中所需的试样均化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了试样均化、转溶、乳化、浓缩等造成的待测物的损失。

是简单高效的提取净化方法。

自提出以来，MSPD在各个领域得到广泛应用，尤其是在食品中药物、毒物的安全分析中，显示出独特的性能。

图1.基质固相分散

分散固相萃取（d-SPE）：

与MSPD相同之处在于两者都使用分散的固相萃取吸附剂而不是经典的固相萃取柱对样品进行萃取；但与MSPD不同是，分散固相萃取是将固相萃取吸附剂颗粒分散在样品的萃取液中，而不是直接加入到原始样品中，用于除去样品中的杂质干扰物。

分散固相萃取经典应用在多农药残留检测中使用QuEChERS样品前处理方法。

QuEChERS萃取法（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safey的缩写）即为快速，简易，廉价，有效，稳定，安全的萃取法。

2003年，美国农业部Anastassiades等建立了QuEChERS作为一种农药残留样品前处理方法,适用于高湿低脂的基质环境（如蔬菜、水果、谷物等低脂农产品）。

通过方法改进，QuEChERS也适用于动物源性食品中复杂的基质环境,可用于兽药残留检测。

QuEChERS之所以在兽药残留检测领域迅速占有一席之地,是因为其具有特殊的优势:

可以根据不同基质和不同兽药的物理、化学性质，通过调整提取溶剂、pH、盐类或稀释剂等来适应不同情况。

该方法具有回收率高，检测结果准确等优点，操作简单以及应用范围广使得该方法成为兽药残留定量检验的首选方法之一

QuEChERS实质上是将传统的液-液萃取、分离和基质固相分散技术组合起来的前处理方法，其中分散固相萃取体现在加入一种或多种分散的固相萃取吸附剂来有针对性的吸附杂质，而不是目标物，达到净化除杂的作用。

是一种简单直接的样品制备技术。

图2.分散固相萃取

3、固相萃取柱的展望

固相萃取作为一种有效的样品前处理技术已经广泛应用于许多分析实验室，随着人们对固相萃取技术的深入理解和新型固相萃取材料的开发，固相萃取技术将不断得到发展壮大。

1、应用领域不断扩大

固相萃取主要应用于食品、环境、医药、司法鉴定等，在生命科学领域主要应用于生物样品中的指定组分的萃取分离，随着蛋白质组学的深入研究，将更改广泛的应用于生命科学的样品前处理；在工业领域如纺织品，日用品、化妆品成分的分析检测中液可以发挥其特有的作用；在无机检测领域，也有人开始尝试用固相萃取代替液液萃取来对痕量重金属离子萃取富集。

2、开发新型固相萃取材料

2．1免疫亲和净化柱（IAC）固相萃取：

根据特异性免疫原理将抗体作为免疫吸附剂而制成的免疫亲和净化柱是一种新型的固相萃取技术，也有用于食品农残分析的报道。

2.2磁性纳米材料

随着近年对纳米材料的深入研究,一些磁性纳米材料逐渐代替传统填料应用于固相萃取技术,发展出新颖的磁性固相萃取技术（magneticsolid-phaseextraction）。

磁性固相萃取使用铁、镍、硅及其氧化物作为磁性吸附剂填充于固相萃取柱中,通过磁性吸附待测物,可以有效缩短萃取时间、增强萃取效果。

图3.磁性固相萃取

2．3分子印迹固相萃取技术是固相萃取技术中的一种，它是利用分子印迹聚合物作为固相萃取剂，选择性分离目标物的技术。

MIP是以某种化合物分子为模板合成的聚合物，对模板分子具有较高的特异性识别能力，类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用原理。

分子印迹固相萃取技术的使用能弥补固相萃取选择性盲目的不足，对于复杂样品中的特定成分富集与分离十分有效，克服医药、生物及环境样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素，达到样品分离纯化的目的。

分子印迹介质：

其原理与亲和色谱类似

图4.分子印迹固相萃取（MI-SPE）的4个步骤

3、更加自动化、高通量

随着科技的发展和检测需要，固相萃取正经历着从手工操作到自动化发展的进程，使操作人员从繁琐重复的劳动中解放出来，提高分析结果的重现性。

市面上已经出现全自动固相萃取仪，能自动完成固相萃取的全部步骤，以及出现圆盘式固相萃取柱可以增大检测量，但仍属于初步发展阶段，今后会有一批高通量、合适不同分析领域要求的自动化固相萃取仪器问世。

3．1全自动固相萃取仪

图6.全自动固相萃取

3．2圆盘式SPE

SPE圆盘类似一张扁平过滤膜,厚度<1mm，直径约4～96mm。

dSPE具有比cSPE相对较大的横截面、固定相薄，这就使允许流速增大，萃取速度也增大，特别适合环境样品如水中痕量有机物的分析，可以加大样品体积以提高检测灵敏度。

图7.圆盘式SPE

4、更加小型化、简单化

小型化简单化是样品前处理的发展趋势，固相萃取技术也在不断朝该方向努力，如瑞典公司开发的微固相萃取技术，填充吸附剂微萃取（MEPS）将1mg固相吸附剂装填在注射管或注射针头与针管之间的萃取节中，操作方法同吸嘴型固相萃取相似，主要用在生物液中药物的萃取。

还有固相微萃取（SPME）技术，SPME由SPE技术发展而来，是根据吸附-解吸原理，由萃取头（纤维）吸附样品中挥发性或半挥发性有机污染物，吸附一定时间后，取出萃取头，置于气相色谱或高效液相色谱等仪器进样口，进行热解吸（Gc）或溶解（HPLC）。

其显著优点是集萃取、净化、浓缩、进样功能于一体，操作简单、所需时间短、无需溶剂、用样量少、选择性强、容易实现自动化，是极具发展前途的农药残留分析前处理技术。

图8.固相微萃取

5、多种前处理技术结合，在线联用

多种样品前处理技术结合，特别是将不同的自动化样品前处理仪器结合在一起，如加速溶剂萃取与固相萃取一起，微波辅助萃取与固相萃取一起，超临界萃取和固相萃取一起等。

并连接到分析仪器上，是样品从前处理到分析实现真正意义上的自动化将是分析领域的一个发展方向。

如超临界固相萃取SFE，以超临界流体（CO2）为洗脱液，使SFE和SPE结合为可用于液体样品萃取的整体萃取技术。

以超临界流体作流动相，直接从固体（粉末）或液体样品中将目标物质（有机物）萃取出来的一种分离方法。

在线联用技术是样品制备和处理技术发展的另一方向，可减轻劳动强度，节省人力，而且可以防止人工操作产生的误差，提高灵敏度、准确度与重现性。

图9.LC-SPE

边学边练

一、任务：

HLB柱和MCX柱净化猪肉中瘦肉精的提取液

样品：

猪肉

参考标准：

国标标准GB/T21313-2007：

动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法》（液相色谱-质谱/质谱法HPLC-MS/MS）猪肉中的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的残留进行测定。

首先了解β-受体激动剂的结构特点。

β-受体激动剂具有苯乙醇胺结构母核，为苯乙醇胺类物质。

按照苯环上取代基的不同，可分为苯胺型和苯酚型，而苯酚型β-受体激动剂又分为邻苯二酚型、间苯二酚型及水杨醇型，结构如图10所示。

β-受体激动剂的母核结构及主要化合物列于表1。

可以看出β-受体激动剂含有羟基，呈弱碱性。

接着再了解HLB和MCX两种固相萃取柱的原理和使用范围。

1）HLB固相萃取柱

HLB是一种全能型亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂，即使填料抽干，HLB仍可保持高保留性能和重现性。

HLB是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，为反相吸附剂，通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留，并提供很好的水浸润性。

主要用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附，包括巴比妥类，抗生素，酞类，咖啡因，染料，芳香油，脂溶性维生素，杀菌剂，除草剂，苯酚，类固醇，表面活性剂，维生素，磷酸酯、药物代谢物等。

2）MCX固相萃取柱MCX是一种混合型强阳离子交换反相吸附剂。

MCX提供了双重保留模式，即离子交换和反相，保留作用发生在一种洁净、稳定、高表面积，在pH0-14范围内稳定的共聚物上。

MCX柱对碱性化合物具有高的选择性和灵敏度，可耐受有机溶剂。

可用来分离塑料制品，食品或生物基质（如血浆、尿液及组织匀浆）中的碱性化合物，如苯丙胺，奶粉及奶制品中三聚氰胺、扑尔敏等。

图11.WatersOasis柱的官能团结构

为什么选用这两种固相萃取柱？

HLB是亲水亲脂的填料，对极性和非极性的物质均有较好的吸附作用，对含有羟基（非极性基团）的有机物，有较好的保留作用。

具有高回收率，高吸附容量，是用于酸性，中性和碱性化合物的通用型吸附剂通过对HLB柱的使用可以获得更干净的本底。

MCX柱为混和弱阳离子交换柱，通过疏水相互作用和阳离子交换使有机物保留，对碱性化合物具有高选择性和高灵敏性，适于吸附弱碱性化合物。

根据β-受体激动剂的结构特点,本实验采用这两种固相萃取柱猪肉提取液中的瘦肉精可以达到良好的净化作用。

二、操作技术要点：

前面，我们已经将猪肉中的瘦肉精进行了提取操作，接下来看下净化部分。

1）HLB柱净化

活化。

将HLB固相萃取柱在固相萃取仪上安装好，使用前用6mL甲醇、6mL水活化，大约各用两管，一管即为液面刚好达到萃取柱的柱口。

过柱。

将猪肉提取液以2mL/min~3mL/min的速度过柱，弃去滤液。

此时不开真空泵，以防止流速太快，出现待测样未被萃取完全吸附，从而导致测定结果偏低的情况。

淋洗。

用2mL5%甲醇淋洗，小柱抽干。

此时应开启真空泵，将固相萃取柱尽量抽干，以除去水分。

否则洗脱液中会含有水，氮吹较难将水吹干。

洗脱。

装上3支10mL离心管，用6mL甲醇洗脱，收集洗脱液。

此时应开启真空泵，将萃取柱尽量抽干。

氮吹。

洗脱液用氮气吹至近干。

调整氮吹针距液面1cm左右，调整合适的氮气流量，吹至近干。

复溶。

用大约3mL0.1mmol/L高氯酸溶液溶解残渣，采用漩涡振荡混合均匀，供MCX柱净化用。

2）MCX柱净化

①活化。

将MCX柱在固相萃取仪上安装好，使用前用3mL5%甲醇氨、3mL甲醇、3mL水、3mL0.1mmol/L高氯酸（pH4.0）溶液活化。

过柱。

将刚才用HLB柱制得的溶液过柱，弃去滤液。

淋洗。

用1mL甲醇淋洗，此时可不抽干，再用1mL2%甲醇水溶液淋洗。

此时需要抽干，否则将造成结果偏小。

洗脱。

最后用7mL5%甲醇氨洗脱，收集洗脱液于10mL离心管中。

注意控制流速，流速不宜过快，应使洗脱液成滴流下，最后要用真空泵抽干。

氮吹。

洗脱液用氮气吹至近干。

氮气吹干实际是个富集浓缩过程，在惰性的氮气流中将溶剂吹干，既可以保护被测物质，又可以将其浓缩，加大浓度，以备上机检测之用。

复溶。

用甲醇-0.1%甲酸水（5+95）定容至1.0mL，漩涡混合1min，将样液用巴氏管转移入进样瓶中，用于HPLCMS/MS测定。

拓展阅读

固相萃取技术就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。

该技术基于液－固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程：

也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。

在此过程中。

首先要选用适当的溶剂对吸附在吸附剂上的干扰物进行洗脱，然后再用洗脱剂对目标物质进行洗脱，最终得到目标物质。

与传统的液－液萃取方法相比，SPE显著的优势为：

提高样品处理量，大大减少溶剂的消耗和废物的产生，回收率高，重现性好，极低的杂质干扰，无乳化现象，多种分离模式选择，易于实现自动化。

（缺点需要预先知道吸附、解析条件，否则需要摸索条件。

）

常用的固相萃取柱的类型有极性柱、非极性柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、共价型柱等。

根据目标化合物性质和样品类型选择合适的固相萃取柱和淋洗剂。

影响固相萃取效果的主要因素有：

吸附剂类型及用量、水样体积、洗脱剂类型等。

尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂，正相吸附剂保留极性有机物，反相吸附剂保留非极性有机物或弱极性有机物，阴离子交换树脂则适用于离子型的有机物。

洗脱剂体积应以淋洗完全为前提，体积最小的为最佳。

样液中pH值也影响吸附效率。

在吸附剂和洗脱剂选定条件下，回收率随吸附剂量增大而提高，水样流速对回收率的影响不明显。

分析者应根据分析物的极性、溶解度、pKa等理化性质，选择合适的固相萃取小柱。

图12.OasisSPE的选择