荧光探针定量PCR技术原理及应用.docx

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荧光探针定量PCR技术原理及应用

荧光探针定量PCR技术原理及应用

     PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测。

荧光探针定量PCR（FQ—PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（realtimequantitativePCR）”或“TaqManPCR（以美国PE公司商标命名）”。

该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术.

1.原理

     FQ-PCR的工作原理［1—3]是利用Taq酶的5’→3'外切酶活性,在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。

该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5'端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素,荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基诺丹明，荧光发射峰值在582nm处）,两者之间构成能量传递结构。

当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。

当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段,荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。

当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3'端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时,其5’→3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。

荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。

PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放.由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。

由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离,实现了仪器实时检测（图2）,为新的PCR定量原理创造了条件.

图1。

TaqManPCR反应模式

（A）聚合反应：

（B）链置换;（C）裂解;

（D）聚合完成（R：

FAM；Q:

TAMRA；FP：

上游引物；RP:

下游引物）

图2.FQ—PCR实时动力学曲线

     ABI公司首先根据上述原理研制了ABI7700等系列定量PCR仪,在PCR反应中设置标准模板系列（一般5～7个标准浓度）反应管和空白对照管。

通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ.RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ—代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量。

当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出以99。

7%的置信度大于平均值作为阈值）时,标准模板反应管所用的循环次数（Ct值）就被记录下来。

Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系［3]，利用系列标准模板的Ct值,制成标准曲线（图3），根据待测样品的Ct值,就可在标准曲线中确定待测样品起始的DNA数量。

根据数据处理，即可得出定量结果.探针设计一般应符合以下条件［2]:

①探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合的特异性。

②GC碱基含量在40％~60%，避免单核苷酸序列的重复.③避免与引物发生杂交或重叠。

④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。

另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响.

图3.FQ—PCR标准曲线

2。

技术特点

2.1封闭状态下检测,避免了扩增产物污染而致的假阳性

     传统PCR于反应结束后取出反应液，通过电泳染色和紫外仪观察结果。

扩增产物在开放状态下分析，对实险室的污染是不可避免的.因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越的障碍。

FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析,完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。

至于样品间的污染，无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。

我国PCR临床应用出现问题,产物污染所致假阳性是主要原因之一。

2。

2基因的定量检测，扩展了临床应用空间

     传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：

①PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增加到一定程度,产物就停止了指数积累。

不同起始模板,其指数增长期所用的循环是不同的，因此，不同数量基因的样品在同一循环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据；②PCR产物积累到一定程度就不能再增加,再进入平台期。

为了扩大PCR检出的灵敏度通常要增加循环次数，循环次数增加使得样品目的基因含量高的反应管已进入平台期，终产物量并不代表样品目的基因含量;③PCR反应的管间扩增效率差异总是存在的，既然PCR产物呈指数增长,由扩增效率差异引起的产物扩增差异也呈指数积累，增加循环次数势必增加终产物的差异,而减少循环次数又降低了检测的灵敏度。

FQ—PCR采用实时检测，使所有含有不同数量的目的基因均在同一条件（达到荧光阈值）下进行分析，因而更具有可比性。

而且，这一条件处于扩增产物指数积累初期，合成产物所需的dNTP、酶、离子均处于饱和的最佳状态，所以FQ—PCR循环参数与起始模板间有良好的线性关系（相关系数＞0。

95），实现了极为精确的基因定量检测。

2。

3光谱技术进一步提高了灵敏度

     FQ-PCR技术已用于单细胞基因诊断，灵敏度已达到极限水平,即检测单拷贝基因,而传统PCR是不易做到的。

灵敏度提高得益于光谱技术。

2。

4荧光探针杂交，进一步提高了特异性

     PCR扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体,从而影响了对特异电泳带的判断.FQ—PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物,相当于PCR反应过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。

2。

5扩增与自动分析一体化，检测更加简便和快速

     FQ—PCR通过计算机和分析软件，使PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，比传统定性PCR更为简便和快速，同时也避免了传统PCR产物分析中有害物质对人体的影响，计算和数据处理也有利于科研和临床资料的保存和分析.

3。

临床应用概要

     科学研究已经证明,人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正进入基因诊断时代.但对于许多疾病的发生和发展来说，相关基因不是有无问题，而是一个从量变到质变的过程，基因定量检测更具有临床意义。

3.1感染性疾病

     PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。

理论上,只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到.一般实验室也能检出10～102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到.PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期"问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

     定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性.许多研究表明，人类免疫缺陷病毒（HIV）感染后,潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；有也研究表明，HIV病毒载量低于一定值时,没有传染性。

     在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。

例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作

用。

3.2肿瘤

     尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚,但相关的基因的遗传学改变的积累，是致癌性转变的根本原因已被普遍接受。

     癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。

PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量,可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。

几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量,以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。

     肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。

目前临床对此多用免疫学方法检测,灵敏度低,一般需要达到108个分子数.用定量逆转录（RT）—PCR方法，一般条件下可检出10—102某种标志物的mRNA，可大大提高检出率。

     一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ—PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访.

3.3遗传病

     PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。

基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ—PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。

     总之,除与疾病直接相关的基因检测外，各种与疾病相关的细胞因子、激素、受体，用FQ—PCR方法检测其基因表达水平具有更高的灵敏性，更有利于疾病诊断.

参考文献

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[3］HiguchiR，DollingerG,WalshPS，etal。

Stimutaneousamplificationand

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Biotechnology,1992,10：

413—417.

一荧光探针定量PCR定量检测的意义

     定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有"或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多"或“少”。

     定量检测的意义:

1.体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。

2.评价和考核治疗效果。

3.用于传染病发病的监控、预测与预防。

4.作为新的愈后指标。

5.建立新的病原体分子诊断标准。

6.新的药物及疗法的研究与开发.

二荧光定量PCR报告结果的读取：

     荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少,结果通常用数字表示,

     报告为“copies/ml”、“2U/ml"或“copies”,copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。

     例:

HBV—DNA定量结果报告：

3。

637×104IU/ml（如果采用科学记数法表示为:

3。

637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。

     如果待检标本能够定量，如血液等,结果报告为多少copies/ml或2U/ml。

     如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等,结果只报告为多少copies。

乙型肝炎病毒（HBV）

一乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染

     HBV感染是全球性公共卫生问题，世界卫生组织统计，全世界乙肝病毒携带者有3。

5亿人之多。

我国人群HBV携带率约为10％,有近1.3亿人感染HBV，是世界上最大的“肝炎大国”。

HBV感染后临床表现呈多样性，可表现为重症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者,其中部分慢性肝炎可演变成肝硬化或肝癌.HBV携带者因无症状，不易被察觉，其作为传染源的危害性比患者更甚。

     HBV病毒颗粒呈球形,具有双层的衣壳,HBsAg镶嵌于脂质双层的外衣壳中。

HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要标志,可刺激机体产生保护性抗体即HBsAb。

     HBcAg位于内衣壳部分，其外被HBsAg所覆盖，不易在血循环中检出。

其抗原性较强，能刺激机体产生HBcAb.HBcAblgG在血中持续时间较长,为非保护性抗体。

HBcAblgM提示HBV处于复制状态。

     HBeAg是PreC基因（前核基因）的编码产物,是一种非结构性蛋白，为可溶性蛋白质,自肝细胞分泌入血中.HBeAg的消长与病毒体的DNA聚合酶的消长一致，故可作为HBV复制及强感染性的指标。

其刺激机体产生HBeAb，对HBV感染有一定的保护作用，通常认为HbeAb的出现是预后良好的征象.

在这三对抗原、抗体系统中,核心抗原较难检测到，一般不作为临床常规检查，故称为“两对半”。

其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三项阳性称为“大三阳”,HBsAg、HBeAb、HBcAb三项阳性称为“小三阳".

二“两对半”检测与HBV—DNA定量

     “两对半"是从免疫学水平来检测HBV感染机体后引起免疫应答，产生相应抗原抗体的含量（这个“含量”还不是定量，而只是抗原抗体的“有”或“无”），它实际上测定的是机体感染HBV后免疫应答结果的反映。

由于个体反应的差异，不同的人在感染HBV后会出现不同的免疫应答，从而得到不同的“两对半”结果模式。

如产生抗体、表现为“携带者”、“大三阳"、“小三阳”等等。

但是所有这些免疫学指标不能反映患者或病人体内病毒的复复水平及传染程度，不能提示其与乙型肝炎的发生和发展过程之间的联系。

     荧光探针定量PCR技术则是从分子生物学水平直接检测HBV病毒自身的遗传物质DNA,是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。

     HBsAg虽然是HBV的感染标志,但在感染的早期,或由于S基因（编码HBsAg）的低水平表达或变异，常规方法难以检出，会导致漏检。

HBV—DNA检测比免疫学检测更早期、更灵敏。

免疫学方法检测为HBsAg（-）的病人中，约有3%以上检测出HBV-DNA（+）,健康供血者用PCR方法检测HBV—DNA，也有一定比例的阳性.HBsAg阴性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的.所以单凭HBsAg阳性与否来判断肝脏中HBV的复制及有无传染性是远远不够的,易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏诊。

对于HBsAg阴性或有HBV感染后的任何血清学依据都应进一步进行HBV—DNA荧光定量检测。

也有时出现HBeAg（-）而HBV—DNA（+）的结果,这是因为编码e抗原的PreC区基因极易出现变异，在PreC区出现终止密码子,使PreC区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原，导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。

     HBsAg（+）患者中大约有1-10%检测不出HBV-DNA，这种情况在世界各国都有报道。

一方面，由于HBV-DNA整合于宿主细胞基因组，或基因变异，与常用的PCR引物、探针不匹配,PCR扩增不出相应的基因序列，因而未能检出。

此外，由于HBV的复制有反转录过程，S基因（编码表面抗原）可以以2.1KbRNA为mRNA转译成HBsAg，故在部分HBV感染中虽无病毒复制，但可长期产生HbsAg.5~10％HBV感染者表现为单项HBcAb阳性。

有许多报道证明，单项HBcAb阳性的血液可以引起HBV的输血后感染。

如果同时检查HBV-DNA，可以减少漏检，预防输血后肝炎的发生。

     应用PCR检测发现，大多数“大三阳”病人血中能够检出HBV-DAN（检出率约为96%左右）,有相当一部分人e抗原转化e抗体后，即“大三阳”转化为“小三阳”后,其血清中仍有DNA存在（检出率约为30%），说明病毒仍未消失和停止复制。

“小三阳"病人血清中HBV-DNA转阴率约为60-70%，这与病毒遗传物质突变或与宿主基因组整合、用药后复制暂停、以及血清HBV病毒炎症清除使血清中的HBV-DNA消失或下降至极低浓度（低于检测下限）有关,这种情况下并不表示病人恢复,应随访并复查血清HBV—DNA以免误症。

     要特别指出的是，近年来由于抑制病毒复制的核苷类药物药物（如拉咪呋啶）在临床的大量使用，使得HBV—DNA复制水平可能会在短时期内迅速降低至不可检测水平（这时候免疫学检测指标可不发生改变）,但是随着患者出现药物耐受或产生基因突变，HBV-DNA复制水平又可能呈现一种上升趋势，从而使HBV-DNA定量检测出现相对复杂的动态变化结果。

三荧光探针PCR定量检测HBV—DNA的意义

（一）HBV—DNA定量检测,临床上以＜103copies/ml为检测临界值，可作为乙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标.慢性乙肝患者血清中HBV-DNA＞105copies/ml的患者，如果体内丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平异常,应考虑接受抗病治疗。

（二）HBV-DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增，是病毒复制和存在的最早期、最灵敏也是最可靠的指标，可对HBV感染作出早期诊断。

乙肝病人传染性与其血清中HBV—DNA含量高低呈正相关,病人血清中HBV—DNA复制水平越高，其传染性越强。

（三）乙肝的治疗目前尚无特效方法，常用的有干扰素和拉咪呋啶.临床上一般认为用药后HBV-DNA下降到105copies/ml以下为对药物完全应答;定量下降大于2个数量级（102）为对药物部分应

答；未达上述标准为低应答或无应答.研究表明，对于干扰素治疗：

（1）治疗前HBV低水平复制者对

干扰素的反应性明显优于高水平复制者。

HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV-DNA含量较低者，而治疗前HBV-DNA含量特别高者大多疗效不佳；

（2）治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。

相反，治疗期间HBV-DNA水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者,大多治疗无效；（3）治疗结束后，采用PCR定量法监测，HBV-DNA完全转阴一年以上者，可能不再复发，而终止治疗后HBV-DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大.核苷类药物拉咪呋啶有显著降低高病毒载量作用,近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV基因突变，患者易产生耐受性，且易出现停药后反弹。

（四）肝移植前患者血清HBV—DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV。

因为HBV主要侵犯肝脏，建议移植前使用抗HBV药物,最大限度降低血清HBV—DNA浓度，有助于防止HBV侵犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果.

（五）乙肝妇女怀孕前进行定量PCR测定,有助于选择有利的怀孕时机，要选择低病毒载量时受孕。

乙肝孕妇怀孕期间定期进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断，减少宫内感染的风险;母—婴传播多发生于胎儿期和围生期。

尤其是HBsAg和HBeAg双阳性的母亲，体内HBV—DNA复制水平相对较高，发生胎内传播和围生期感染的机率均较高。

因HBV可通过乳汁直接传染给婴儿，哺乳期妇女，除血液检测外,还应进行乳汁HBV—DNA检测，以决定是否母乳喂养。

丙型肝炎病毒（HCV）

一丙肝病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染

     丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因.据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1。

7亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。

丙肝病毒呈球形，有包膜，是一种单正链RNA病毒，主要在肝细胞内复制.基因组由9个基因区组成,编码糖基化包膜蛋白E1区和E2区基因极易出现变异。

丙肝病毒体外培养至今尚不成功.

     HCV感染引起的临床过程轻重不一，可表现为急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。

HCV感染的重要特征是易于慢性化，急性期后易于发展成慢性肝炎，部分病人可进一步发展为肝硬化或肝癌。

40％~50%的丙肝患者可转变成慢性肝炎。

多数慢性肝炎患者的临床表现不明显，发病时已呈慢性过程，约20%慢性肝炎可发展成肝硬化.HCV感染与肝癌的发生有密切关系,在意大利、希腊、日本等国肝癌患者血中，50%～70%抗—HCV阳性，我国肝癌患者血中约10％存在抗—HCV阳性。

用RT-PCR技术可从约10%的肝癌组织中检出HCR-RNA.

     HCV主要通过输血传播，是输血后肝炎致病因子。

免疫学标志仅有抗-HCV一项,为非中和抗体。

     全国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗-HCV阳性率为3。

2％。

各地抗—HCV阳性率有一定差异。

     HCV在体内呈低水平复制，病毒血症水平较低，不易诱导高水平的免疫应答；HCV亦可存在于肝外组织或外周血单核细胞中，使病毒感染不易清除。

因为E1区和E2区基因具有高度变异性,导致丙肝病毒包膜蛋白的抗原性快速变异，这种变异引起的免疫逃避作用,是病毒在体内持续存在，感染易于慢性化的主要原因,也是丙肝病毒疫苗研制的最大障碍.不同地区的不同个体、同一个体的不同时期、同一样品的不同克隆之间,丙型肝炎病毒的基因序列都存在着差异性。

二荧光探针PCR定量检测HCV—RNA的意义

（一）HCV-RNA荧光定量PCR检测，临床上以＜80copies/ml为检测临界值，可作为丙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标.慢性丙肝患血清中HCV-RNA＞103copies/ml的患者应接受抗病毒治疗。

血清HCV-RNA＜107copies/ml的患者抗病毒治疗的疗效常优于HCV—RNA含量更高者。

（二）荧光探针PCR定量检测HCV—RNA可以大大提高检测的窗口期。

暴露于HCV后1~3w，在外周血可检测到HCV—RNA。

丙肝的免疫学指标只有抗-HCV抗体一项，血清学筛查HCV抗体的“窗口期”约达三个月之久。

在急性HCV感染者出现临床症状时，仅50%～70%患者抗-HCV阳性，3个月后约90％患者抗—HCV转

阳，少数人感染HCV后不产生抗-HCV。

故在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体的丙肝病毒携带者,都可出现HCV—RNA（+），抗—HCV（—）的检测结果。

（三）慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制，这时只能通过HCV—RNA定量检测鉴别丙肝病毒的活动性和复制程度.有些人抗-HCV阳性，但可表现为ALT水平正常，HCV-RNA（—）。

当然也不排除由于HCV基因变异，或是PCR抑制效应而导致的假阴性结果。

（四）HCV—RNA病毒载量与抗—HCV滴度以及ALT水平呈正相关，抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。

HCV—RNA常在ALT恢复正常前转阴，但也有ALT恢复正常而HCVRNA持续阳性者.

（五）HCV—RNA病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。

丙型肝炎治疗有一定疗效,治疗后血清HCV—RNA转阴率可高达50％～80％,但停药后约半数HCV-RNA又转阳，复发时间多在治疗后6～12个月，若治后12个月ALT持续正常，血清HCV-RNA阴性，则可能治愈.抗-HCV阴转与否不