学术论文毕业设计论文《不同产地的黄连抗菌作用实验研究》.docx
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学术论文毕业设计论文《不同产地的黄连抗菌作用实验研究》
〔毕业设计论文〕?
不同产地的黄连抗菌作用实验研究?
精品
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本科毕业论文
题目：
不同产地的黄连抗菌作用实验研究
学 院:
医学院
专 业:
药学
学 号:
学生姓名:
指导教师:
日 期:
二0一一年六月
精品
摘 要
目的 影响中药材质量及成效的因素很多，产地因素尤为重要。
通过对不同产地药用植物黄连对不同致病细菌抗菌作用的实验研究可以为判断其在感染性疾病治疗中的应用价值提供直接的实验依据；并为判断研究其中化学成分的抗菌作用及其抗菌相互作用提供实验依据。
方法 应用水煎法对五种不同产地〔四川、湖北房县、山东泰山、神农架、贵州〕的黄连进行提取，采用等倍稀释法来测定该产地黄连提取物的最小抑菌浓度，采用测溶液OD值的方法来测定溶液中细菌的浓度，设置一个不加菌液的对照组来消除药物对菌液OD值的影响，并测出相同药物的不同菌种的最小抑菌浓度〔MIC〕。
用平板培养计数法测定最低杀菌浓度〔MBC〕。
再进行数据整合和结果比较，并作出抑菌效用评价。
结果 五种产地的黄连〔房县、四川、山东、神农架、贵州〕对葡萄球菌的最小抑菌浓度〔MIC〕分别是1/1024、1/1024、1/512、1/1024、1/512g/ml。
最小杀菌浓度〔MBC〕分别是1/512、1/512、1/256、1/512、1/256g/ml。
对大肠杆菌的最小抑菌浓度〔MIC〕分别是1/1024、1/1024、1/512、1/512、1/1024g/ml。
最小杀菌浓度〔MBC〕分别是1/512、1/512、1/256、1/256、1/512g/ml。
对伤寒杆菌的最小抑菌浓度〔MIC〕分别是1/1024g/ml、1/512、1/512、1/256、1/256g/ml。
最小杀菌浓度〔MBC〕分别是1/512、1/256、1/256、1/128、1/128g/ml。
对乙型副伤寒杆菌的最小抑菌浓度〔MIC〕分别是1/1024g/ml、1/1024g/ml、1/512g/ml、1/512、1/256g/ml。
最小杀菌浓度〔MBC〕分别是1/512、1/256、1/256、1/128、1/128g/ml。
结论 五种产地的黄连中，对葡萄球菌抑菌效果最好的是湖北房县、四川和神农架的黄连。
对大肠杆菌抑菌效果最好的是湖北房县、四川和贵州的黄连，对伤寒杆菌抑菌效果最好的是湖北房县的黄连，对隐形附伤寒杆菌抑菌效果最好的是湖北房县和四川的黄连。
综合来说，黄连的产地不同对其抗菌效果产生一定的影响。
关键词：
黄连；最小抑菌浓度〔MIC〕；最小杀菌浓度（MBC）；细菌
Abstract
Objective TherearemanyfactorsthataffectthequalityandeffectivenessofChineseherbalmedicines,andtheplaceoforiginfactorsareespeciallyimportant.Medicinalplantsondifferentareasofdifferentbacteriaantibacterialberberinecandeterminethetreatmentofinfectiousdiseasesintheapplicationofvaluetoprovidedirectexperimentalevidenceandprovideexperimentalevidenceforinteractionwhichtodeterminewhichchemicalcomponentsoftheantibacterialeffectofantibiotic
Methods Applicationofdecoctionmethodonfivedifferentareas（Sichuan,Hubei,FangCounty,ShandongTaishan,Shennongjia,Guizhou）ofberberinewasextracted,suchasdilutionmethodusedtodeterminetheoriginCoptisextracttheminimuminhibitoryconcentration,bymeasuringODsolutionvaluemethodtomeasuretheconcentrationofbacteriainsolution,setupacontrolgroupwithoutbacteriatoeliminatedrugsontheODvaluesofbacteriaandmeasuredthesamedrugindifferentstrainsoftheminimuminhibitoryconcentrationandminimumbactericidalconcentration.BycomparingthetheMICandMBCofCoptiswhichproducedindifferentareas,judgewhethertheoriginofdifferentantibacterialeffectofCoptisimpact.Thisistheappropriatechoiceofinfectiousdiseasestoprovideexperimentalevidenceforberberine.
Results Theminimuminhibitoryconcentration（MIC）offiveCoptiswhichareproducedinfiveareas（FangCounty,Sichuan,Shandong,Shennongjia,Guizhou）onstaphylococcuswere1/1024、1/1024、1/512、1/1024、1/512g/ml.theminimumbactericidalconcentration（MBC）offiveCoptisonstaphylococcuswere1/512、1/512、1/256、1/512、1/256g/ml.OnE.coliwere1/1024、1/1024、1/512、1/512、1/1024g/ml.theMBCoffiveCoptisonE.coliwere1/512、1/512、1/256、1/256、1/512g/ml.TheMIConsalmonellatyphiwere1/1024、1/512、1/512、1/256、1/256g/ml.theMBCoffiveCoptisonsalmonellatyphiwere1/512、1/256、1/256、1/128、1/128g/ml.TheMIConBacteriumparatyphosumBwere1/1024、1/512、1/512、1/256、1/256g/ml.theMBCoffiveCoptisoninvisibleattachedsalmonellatyphiwere1/512、1/256、1/256、1/128、1/128g/ml.
Conclusions ThefivekindsofCoptisinwhichhavethebestantimicrobialefficacyonstaphylococcusareproducedinHubeiFangCounty,SichuanandShennongjiaandinwhichhavethebestantimicrobialefficacyonE.coliareproducedinHubeiFangCounty,SichuanandGuizhouandinwhichhavethebestantimicrobialefficacyonsalmonellatyphiareproducedinHubeiFangCountyandinwhichhavethebestantimicrobialefficacyoninvisibleattachedsalmonellatyphiareproducedinHubeiFangCountyandSichuan.Inshort,theoriginofCoptisisakeyfactoroftheeffectofitsantibacterialaffecting.
Keywords:
Coptis;Minimuminhibitoryconcentration;Minimumbactericidalconcentration; Bacterial
目 录TOC\o"1-3"\h\z\u
l"_Toc264047788"前 言1
l"_Toc264047789"1 材料与方法REF_Toc264047789\h2
l"_Toc264047790"1.1 材料来源REF_Toc264047790\h2
l"_Toc264047791"1.1.1药材REF_Toc264047791\h2
l"_Toc264047792"1.1.2细菌株REF_Toc264047792\h2
l"_Toc264047793"1.1.3培养基REF_Toc264047793\h2
l"_Toc264047794"1.1.4试剂REF_Toc264047794\h2
l"_Toc264047795"1.1.5仪器REF_Toc264047795\h2
l"_Toc264047796"1.2 方法REF_Toc264047796\h3
l"_Toc264047797"1.2.1玻璃器皿的处理REF_Toc264047797\h3
l"_Toc264047799"1.2.2营养肉汤液体培养基的配置REF_Toc264047799\h3
l"_Toc264047800"1.2.3营养琼脂培养基的配置REF_Toc264047800\h3
l"_Toc264047801"1.2.4生理盐水的配置REF_Toc264047801\h3
l"_Toc264047802"1.2.5细菌的复苏REF_Toc264047802\h3
l"_Toc264047803"1.2.60.5McF麦氏比浊管的配置REF_Toc264047803\h3
l"_Toc264047804"1.2.7菌液的配置REF_Toc264047804\h3
l"_Toc264047805"1.2.8水提物的制备REF_Toc264047805\h4
l"_Toc264047807"1.2.9细菌浓度与OD值的线性关系REF_Toc264047807\h4
l"_Toc264047808"1.2.10水提物MIC的测定REF_Toc264047808\h4
l"_Toc264047809"1.2.11水提物MBC的测定REF_Toc264047809\h5
l"_Toc264047810"1.3 分析指标REF_Toc264047810\h5
l"_Toc264047811"2 结果与分析REF_Toc264047811\h6
l"_Toc264047812"2.1 菌液浓度与OD值的线性关系REF_Toc264047812\h6
l"_Toc264047813"2.2 MIC实验中实验组和对照组试管的性状REF_Toc264047813\h6
l"_Toc264047815"2.3 五种产地的黄连分别对四种细菌的抑菌曲线REF_Toc264047815\h6
l"_Toc264047816"2.4 五种产地的黄连分别对四种细菌的最小杀菌浓度〔MBC〕REF_Toc264047816\h6
l"_Toc264047817"3 讨论REF_Toc264047817\h6
l"_Toc264047818"3.1 本研究中MIC测定方法的特点REF_Toc264047818\h6
l"_Toc264047819"3.2 黄连在医学上的应用REF_Toc264047819\h6
l"_Toc264047820"3.3 药物现在的研究现状以及药物主要抗菌成分与抗菌作用的关系REF_Toc264047820\h6
l"_Toc264047821"3.4 结果讨论REF_Toc264047821\h6
l"_Toc264047822"3.4.1同一〔产地〕药物对不同细菌的抗菌作用的差异。
REF_Toc264047822\h6
l"_Toc264047823"3.4.2不同〔产地〕药物对同一细菌的作用差异REF_Toc264047823\h6
l"_Toc264047824"3.5产生作用差异的原因分析REF_Toc264047824\h6
l"_Toc264047825"3.6本实验尚未解决的问题或需要进一步研究的问题REF_Toc264047825\h6
l"_Toc264047826"4 结论REF_Toc264047826\h6
l"_Toc264047827"参考文献REF_Toc264047827\h6
l"_Toc264047828"致 谢REF_Toc264047828\h6
前 言
黄连为多年生草本毛茛科植物。
具有清热燥湿、泻火解毒之成效，可产生抗菌、抗肿瘤、解热抗炎、降血脂、降血糖和抗心律失常等多种药理作用，主治痢疾，伤寒、肺结核、流行性脑脊髓膜炎，大叶性肺炎，猩红热，白喉，肺脓肿，溃疡性结肠炎，白色念珠病，麻疹，百日咳，烧伤，眼部感染性疾病，高血压等疾病[1]。
黄连中主要有效成分为小檗碱〔黄连素〕。
黄连碱，药根碱也是抗菌作用的重要成分,因协同作用，所以黄连的抑菌作用强,而且抑菌范围广。
黄连还有抗病原微生物作用，〔1〕抗菌作用：
抗金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、脑膜炎双球菌、HYPERLINK":
//baike.baidu/view/36276.htm"\t"_blank"痢疾杆菌、炭疽杆菌等；〔2〕抗病毒作用：
抑制流感病毒、乙肝病毒等。
〔3〕抗原虫作用：
体外抑制阿米巴原虫、阴道滴虫、锥虫[2]。
临床用于治疗萎缩性胃炎、胃及十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎和高血压等疾病。
大肠埃希菌〔Escherichiacoli〕,俗称大肠杆菌。
为中等大小的革兰阴性杆菌。
无芽孢，肠外感染的菌株有多糖包膜〔微荚膜〕。
多数有周鞭毛，能运动。
有普通菌毛和性菌毛。
大肠杆菌是人和动物肠道中的正常菌群，宿主免疫力下降或细菌侵入肠外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些菌株具有较强的毒力，可引肠内感染，如腹膜炎、HYPERLINK":
//baike.baidu/view/38285.htm"\t"_blank"胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。
人在感染大肠杆菌后的病症为胃痛、呕吐、腹泻和发热。
感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。
葡萄球菌属因细菌常堆聚成葡萄串状而得名。
广泛分布于空气、水、土壤、人和动物的皮肤及与外界相通的腔道中。
呈球形或略呈椭圆形，葡萄串状排列，平均直径0.8-1.0μm，革兰氏阳性菌。
葡萄球菌的抵抗力是无芽孢菌中最强的细菌之一。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的致病菌。
金黄色葡萄球菌可产生多种侵袭性酶和外毒素，故其毒力强。
其是最常见的化脓性球菌，可引起化脓性炎症，由金黄色葡萄球菌引起的皮肤软组织感染如疖、痈、毛囊炎、蜂窝组织感染等；内脏器官感染，如气管炎、肺炎、脓胸等以及全身感染——败血症，脓毒血症。
金黄色葡萄球菌外毒素可引起食物中、假膜型肠炎、烫伤样皮肤综合症、毒性休克综合症等。
伤寒杆菌（Salmonellatyphi），革兰阴性杆菌，大小为〔0.6~1.0〕μm×〔2~4〕μm，有菌毛，多数有周身鞭毛，一般无荚膜，无芽孢，兼性厌氧。
其造成之HYPERLINK":
//baike.baidu/view/2152482.htm"\t"_blank"伤寒病，常称“伤寒热〞（typhoidfever），其病症包括高烧，可达39°至40°C；其他病症有腹痛、严重腹泻、头痛、身体出现玫瑰色斑（rosespot）等。
肠道出血或穿孔是其最严重的并发症。
其传染途径为粪口途径，传染力很高。
乙型副伤寒杆菌一般只能感染HYPERLINK":
//baike.baidu/view/14713.htm"\t"_blank"人类，仅偶而感染HYPERLINK":
//baike.baidu/view/7866.htm"\t"_blank"动物。
其病理变化大致与伤寒相同，儿童易患副伤寒乙，但可因地区、年代等而不同。
由于抗生素耐药菌株的日益增多，药用植物在细菌感染性疾病的治疗中受到广泛关注。
研究显示不同产地药用植物黄连主要成分含量存在一定差异[8-10]，目前主要以其中活性物质含量评价不同产地具有抗菌作用的药用植物质量，进而推断其药理效应强度，这种评价方法存在局限。
本研究通过对不同产地药用植物黄连对不同致病细菌抗菌作用的实验研究可以为判断其在感染性疾病治疗中的应用价值提供直接的实验依据；并为判断研究其中化学成分的抗菌作用及其抗菌相互作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源
1.1.1药材
黄连〔产自房县、四川、山东、神农架、贵州的毛茛科植物黄连的枯燥根茎〕经湖北省食品药品检验监督研究院的副主任药师康四和鉴定为正品。
1.1.2细菌株
大肠杆菌；伤寒杆菌；金黄色葡萄球菌；乙型副伤寒杆菌〔由武汉科技大学医学院微生物实验室提供〕。
1.1.3培养基
营养琼脂培养基〔购于杭州微生物试剂〕；营养肉汤〔购于天津市英博生化试剂〕。
1.1.4试剂
分析纯氯化钠〔购于武汉市中南化工试剂〕，氢氧化钠〔天津市博迪化工，生产批号20210125〕，硫酸98%〔岳阳欣祥化工〕，氯化钡〔山东众诚钡盐化学〕。
1.1.5仪器
无菌操作台〔SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化〕；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵〔上海亚荣生化仪器厂〕；DELTA320pH计〔METTLERTOLEDO〕；Uopu DHP-90系列〔303A-S系列〕不锈钢胆电热恒温培养箱〔上海索普仪器制造〕；DHG-9070A型 电热恒温鼓风枯燥箱〔上海索普仪器制造〕；不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器〔MODELYX-450,上海三申医疗器械〕；752紫外光栅分光光度计〔上海第三分析仪器厂制造〕；电子天平〔赛多利斯科学仪器〔北京〕〕；800离心机〔常州国华电器〕；超纯水机〔前沿科技〕。
1.2 方法
先用碱液将实验要用到的玻璃器皿刷洗干净，晾干。
再按重铬酸纳50g：
水850ml：
浓硫酸100ml的比例配置4000ml洗液。
先将200g重铬酸纳溶于3400ml温水中，在缓慢参加400ml浓硫酸，搅拌混匀。
最后将配置好的洗液倒入陶瓷缸，再将清洗干净的仪器投入洗液中，并使之完全没入，浸泡20h后取出，用清水冲洗干净，烘干。
枯燥后放入高压灭菌锅中高压灭菌〔124℃,20min〕。
1.2.2营养肉汤液体培养基的配置
取营养肉汤粉2.9g，加蒸馏水至1000ml,加热摇匀至肉汤粉完全溶解，再分装至4个250ml锥形瓶中，每瓶250ml，加塞，置高压灭菌锅中灭菌〔124℃,20min〕，冷却后取出，放入冰箱中保存〔1℃〕。
1.2.3营养琼脂培养基的配置
取35g营养琼脂粉，加蒸馏水至1000ml，加热溶解，置高压灭菌锅中灭菌〔124℃,20min〕，取出后趁热倾倒5ml在一次性培养皿中，冷却凝固，放冰箱中保存。
1.2.4生理盐水的配置
取分析纯氯化钠0.9g，加蒸馏水至100ml，搅拌混匀,置高压灭菌锅中消毒〔124℃,20min〕，冷却后取出，再放入冰箱中保存。
1.2.5细菌的复苏
从冰箱取出冷藏的菌种，在无菌室中用接种环将原始菌种接种到斜面培养基上，放入37℃温箱中培养18小时。
取0.25gBaCl2溶于100ml蒸馏水中得浓度为0.25％的BaCl2溶液。
取98％的浓硫酸1ml溶于98ml蒸馏水中，得到浓度为1％的稀硫酸。
取0.2ml0.25％的BaCl2溶液和9.8ml1％的稀硫酸混合，得0.5McF的BaSO4悬浊液。
测其OD值为0.108。
在无菌室中，将斜面培养基上的细菌用生理盐水冲入营养肉汤中。
取局部细菌肉汤溶液，以无菌肉汤调零，测其OD值。
通过添加无菌肉汤稀释，使其OD值为0.108，此时菌液浓度为1×108/ml。
1.2.8水提物的制备
应用水煎法[5]对五种不同产地〔四川、湖北房县、山东泰山、神农架、贵州〕的黄连进行提取。
分别取五种产地的黄连各150g，分别用1500ml清水浸泡20分钟，然后将黄连及浸泡液转入搪瓷缸中，加热煮沸1小时后放入冰箱保存[4]。
1.2.9细菌浓度与OD值的线性关系 。
分别抽滤，然后分别向5份药渣中加750ml水，煮沸30分钟，抽滤。
分别合并滤液，沸水浴上浓缩，都稀释成150毫升，这样黄连提取物就被浓缩成1g/ml。
将浓缩液分别以每分钟3000转的速率离心15分钟，分别取上清液，做上标记后分装并高压灭菌，冷却
麦氏比浊法是通过配置麦氏比浊管来确定微生物溶液浓度的方法。
麦氏比浊管具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值[5]。
麦氏比浊管的配比方下：
表1 麦氏比浊管的配制方法
管 号（McFarland）
1
2
3
4
5
0.25%BaCl2〔ml〕
1%H2SO4（ml）
细菌的近似浓度（×108/ml）
1
3
6
9
12
15
我们通过配制麦氏比浊管并与细菌溶液比较来确定细菌溶液的浓度，然后等倍稀释已经确定浓度的细菌溶液，分别测取它们的OD值。
用细菌溶液浓度与其对应OD值做回归曲线，验证其线性关系。
具体操作如下：
在无菌操作室〔紫外灯照30min〕将培养后的细菌用50ml的生理盐水洗到一次性培养皿中。
测该5个麦氏点BaSO4溶液〔其对应的细菌浓度为15×108/ml〕的OD值为0.9〔600nm〕，调配菌液，使其OD近似0.9。
得菌液1再用10倍生理盐水稀释菌液1的菌液2，用生理盐水调零，测得OD值A；再用同样方法得菌液3、4、5、6、7，并测OD值OD2、
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