生物工程与下游技术知识点整理.docx

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生物工程与下游技术知识点整理

生物工程与下游技术知识点整理

第十三章β内酰胺类抗生素

1、（掌握青霉素的性质并分析流程，会设计提取分离纯化的流程）

青霉素的理化性质

（1）酸碱性：

有一个酸性基团；解离常数pK值为2.7；

（2）溶解度：

青霉素是有机酸，易溶于醇，酸，醚，酯；氯仿是多种青霉素游离酸的很好溶剂；在水中溶解度很小，迅速丧失抗菌能力；

青霉素的金属盐易溶于水；易溶于低级醇；略溶于乙醇，丁醇，酮类，醋酸乙酯；含有少量水分时，溶解度大大增加；不溶于乙醚，氯仿，醋酸戊酯；

青霉素的分离纯化工艺（工业钾盐生产工艺流程）课本277页

发酵液，冷到10℃下，

1/3体积中性过滤，板框压滤或鼓式过滤，

10％硫酸调pH5，加PPB溶液（十五烷基溴化吡啶，絮凝剂），板框过滤或鼓式过滤，冲水量20－30％；滤洗液；

加1/3BA（醋酸丁酯），加PPB，10％硫酸调pH2－2.5，逆流萃取；得一次丁酯萃取液；

加0.3％活性炭搅拌10min，压滤，

－10℃冷冻脱水，水分在0.9%以下，过滤得BA清液；

加温到15℃，加醋酸钾－乙醇溶液适当搅拌，结晶后静置1h以下，甩滤，得湿晶体；

湿晶体放洗涤罐，丁醇（4－6L/10亿）洗涤，乙酸乙酯（2L/10亿）顶洗，挖出粉子真空干燥；得青霉素G钾盐成品；

2、头孢菌素C

（1）头孢菌素C性质：

为两性化合物，C为氨基酸，水溶性很大，稳定性差；

大孔网状吸附剂从发酵液中初步分离头C，离子交换法纯化，络盐沉淀法结晶；

（2）分离纯化工艺流程

头C发酵液，硫酸酸化，板框过滤，得头C滤液；

大孔网状吸附剂吸附，得饱和树脂；丙酮水溶液解吸，得一次头C解吸液；

阴离子树脂吸附，醋酸钠解吸；

加醋酸锌，得头C锌络盐结晶；板框过滤，得头C锌盐湿品；

气流干燥，得头C锌盐成品；

（3）头C分离纯化工艺要点

A、发酵液预处理

发酵液冷到15℃以下，硫酸酸化到pH2.5－3，放置一段时间；板框或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣；收集，合并滤液，洗液，低温10℃保存；

B、大孔网状吸附剂的吸附和解吸

头C最适吸附pH2.5－3，XAD4的吸附容量为15－20g/L；

2－4倍体积去离子水洗涤，除去硫酸根等阴离子，以免干扰离子交换树脂的纯化；

15－25％乙醇，丙酮，或异丙醇水溶液来解吸。

C、离子交换树脂的纯化

采用弱碱性阴离子交换树脂，树脂用醋酸溶液处理成醋酸型，开始吸附；

去离子水洗涤树脂，1.5－2.5％醋酸钠（钾）水溶液解吸；

D、沉淀结晶

头C可与二价重金属离子铜锌钴铁铅Ni形成难溶性络盐微晶沉淀；锌盐最普遍；

头C锌盐，淡黄色微晶粉末，不溶于水及氯仿，甲醇，乙醇；

离子交换解吸液，放结晶罐中，5℃，加醋酸锌，搅拌溶解，加结晶液体积30％的乙醇或丙酮，析出头C锌盐微晶沉淀；

选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶；只适用于纯化后的头C溶液；

E、膜分离

发酵液通过微孔滤膜MF，除去菌丝，固形物；

超滤UF（除大分子物质），除去分子量10000以上的蛋白质，多糖，深棕色色素，获得色浅的头C滤液；

反渗透膜RO浓缩（除水）

3、克拉维酸的分离纯化

（1）萃取：

溶剂萃取法

发酵滤液，盐酸调pH2，3/4体积正丁醇，多级逆流萃取，5℃萃取；

1/20体积水，用20％氢氧化钠水溶液调pH7；液液离心机，水相反抽提液；

浓缩洗脱液，5℃Zerolit FFIP氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度吸脱，合并活性部分，减压浓缩；

Amberlite XAD4树脂脱盐，能吸附克拉维酸，不吸附无机盐；1％正丁醇或无盐水洗脱，混合活性部分，真空浓缩和冷冻干燥；

（2）离子交换：

吸附于强碱性阴离子交换树脂上，用含盐水溶液洗脱；

发酵滤液，pH6.2，通过Zerolit FFIP氯型强碱性阴离子交换树脂，冷的1mol/L氯化钠洗脱；

浓缩液，pH6，25℃的滤液，通过Amberlite XAD4树脂，用0.1mol/L氯化钠洗涤，5℃无盐水洗脱；

脱盐浓缩液，离子交换色层分离；Zerolit FFIP树脂氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度洗脱，5℃；

浓缩洗脱液，5℃Amberlite XAD4树脂脱盐，混合活性部分，浓缩和冷冻干燥。

第十四章氨基糖苷类抗生素

1、离子交换法分离纯化链霉素（强碱）的工艺

发酵液，1－2倍量水稀释，（高价离子在稀溶液中优先吸附）

草酸酸化，pH2.8-3.2，

加热70－75℃，

板框过滤或固体排出式离心分离，冷到15℃以下；

10%氢氧化钠中和pH6.7－7.2，110－Na型树脂吸附，得饱和树脂，水洗到澄清，5－6％硫酸洗脱；洗脱液；

401树脂吸附，得饱和树脂，先用无盐水挤压，再以8％硫酸单罐循环洗脱3－4次；

得二次洗脱液，1X14H型精制，330－OH型中和；

调pH4.3－5，0.2-3％炭，透光度90％以上；

小于35℃薄膜浓缩，硫酸调pH4.5，加2－3％活性炭，得酸性脱色液；

氢氧化钙调pH5.5-6，加1.5％－2％活性炭到透光度90％以上；

无菌过滤，喷雾干燥进风120－135℃，出风84－85℃；

2、卡那霉素的分离纯化工艺

（1）硫酸卡那霉素：

易溶于水，不溶于乙醇（水中加乙醇沉淀），丙酮，苯，醋酸乙酯；

（2）分离纯化工艺流程

发酵液，盐酸调pH5－5.5，加水稀释，

1X12H型强酸阳离子树脂吸附，搅拌4h，

用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子；

强碱型树脂201X4脱色，2－2.8％氨水洗脱，

硫酸调pH3.2－3.4，乙醇中结晶2h，离心得粗晶；95％及50％乙醇分次洗涤，

无盐水溶解到20万u/ml，调pH7，加1－5％活性炭脱色达滤；精制液，无菌过滤，喷雾干燥，进风116℃出风88℃，得粉针剂原药；

精制液，制成水针剂；

3、庆大霉素的分离纯化工艺

（1）庆大霉素：

易溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿，乙醚，苯；

（2）分离纯化工艺流程

发酵液，盐酸调pH1.5－2.5，氢氧化钠中和到pH6.8－7.2；

加水稀释；

1x2H型吸附6h；得饱和树脂；

用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子，

4－5％氨水洗脱；

强碱性201x4脱色；浓缩去氨，10％硫酸调pH5，加4％活性炭，40℃脱色；成品浓缩液；无菌过滤进风115℃，出风85℃，得硫酸庆大霉素成品；

第十五章 四环类抗生素

（两性物质，沉淀法）

四环类抗生素的分离纯化

沉淀法：

四环类抗生素在碱性下能和钙，镁，钡，某些季铵碱形成复合物而沉淀；

一）钙镁

1四环素：

发酵液调pH9，加氯化钙形成钙盐沉淀；将沉淀以草酸溶解，析出草酸钙；过滤，滤液调pH4.6－4.8；析出四环素粗碱；

粗碱溶于草酸水，活性炭脱色；调pH4，得四环素碱成品；

2金霉素：

发酵液加碳酸钙，氯化镁，调pH7.8形成沉淀；

沉淀用草酸－盐酸调pH1.6－1.7溶解；

加黄血盐（除铁离子），硫酸锌去蛋白；过滤，加4－6％盐酸，升温40℃，金霉素盐酸盐析出；

3土霉素

加0.5-1％溴代十六烷吡啶（季铵碱），调pH9.6-10；沉淀析出；

沉淀用水洗涤，溶于4份体积5％草酸和1份体积浓盐酸；得到的溶液pH1－1.2；活性炭脱色；调pH4－4.5；析出土霉素碱粗品；

第十六章 大环内酯类抗生素

（弱碱，萃取）

1、性质：

无色碱性化合物，微溶于水，在水中溶解度随温度升高降低；易溶于醇酮酯（醋酸乙酯，醋酸丁酯），氯仿；易溶于酸性水溶液且成盐，盐易溶于水

2、红霉素分离纯化工艺（溶剂萃取法）

（1） 单纯溶剂萃取法提取红霉素

发酵液预处理：

加甲醛，硫酸锌，氢氧化钠调pH7.8－8.2；过滤，滤洗液；

萃取：

BA（醋酸丁酯）二级逆流萃取，一级pH10－10.2，二级pH10.4-10.6；一次BA萃取液；

反萃取：

醋酸缓冲液作二级逆流萃取，一级pH5，二级pH4.6；醋酸缓冲液；

萃取：

BA作二级萃取；二次BA萃取液；

结晶：

加10％丙酮，－5℃静置24－36h；离心，蒸馏水洗涤，得湿晶体；

干燥：

制颗粒干燥20h，70－80℃真空干燥；得红霉素碱成品；

（2）溶剂萃取法结合中间盐沉淀的工艺流程

发酵液预处理：

提取：

BA二次逆流萃取，BA萃取液；

中间盐沉淀：

缓缓加入计量的乳酸，加完后继续搅拌30min；得红霉素乳酸盐湿晶体；

BA洗涤，55℃干燥；干晶体；搅拌下加入计量的水－丙酮液溶解，pH6左右；氨水或碳酸氢钠调pH10，搅拌30min，55℃，得红霉素湿晶体；甩滤，水洗到pH7－8，55℃烘干，得红霉素碱成品；

（3）大孔树脂吸附法的工艺流程

发酵液，0.1%甲醛，3％硫酸锌，氢氧化钠调pH7.8－8.2；过滤；

树脂吸附：

CAD40树脂吸附，流速1/25v/v.min；

树脂洗涤：

饱和树脂，40℃水洗涤；

树脂解吸：

氨水pH10，丁酯用2％氨水混合，流速1/130v/v.min；丁酯萃取液；

反萃取：

pH4.7－5.2，醋酸缓冲液；

BA萃取：

碱化pH9.8－10，38－40℃；

结晶：

加10％丙醇，－5℃静置24h离心过滤洗涤；

干燥：

湿晶体，制颗粒，70－80℃干燥；得红霉素碱成品；

3、麦迪霉素分离纯化工艺

发酵液，草酸酸化pH2.5-3；滤洗液；

氢氧化钠调pH8.5-9，BA提取二次；得一次BA萃取液；

盐酸调pH2-2.5，一次酸水提取液；

氢氧化钠调pH8.5-9，BA提取2次；

盐酸调pH2-3.5，蒸馏水提取；

去残溶剂：

减压空气搅拌；

结晶：

5%氢氧化钠调pH8.5-9，40℃搅拌20min；

洗涤，干燥：

热pH8.5无盐水洗涤，60-70℃真空干燥，得成品；

4、螺旋霉素分离纯化工艺

发酵液，加硫酸铝，搅拌20min，过滤，得滤液；

加15-20％BA，氢氧化钠调pH9，得BA萃取液；

洗涤：

无盐水洗涤BA；

5-10％磷酸缓冲液，补加6M盐酸调pH2-2.5；得磷酸缓冲液；

除残余BA后过滤；

结晶：

10M氢氧化钠调pH9，升温到60℃，保温20min；得湿晶体；

分离去母液；

干燥：

70-80℃真空干燥；得螺旋霉素成品；

第十七章 氨基酸类药物的分离纯化

1、氨基酸的理化性质

（1）物理性质

无色晶体，具特殊晶型；易溶于酸碱溶液；

在水中溶解度差异大，精氨酸，组氨酸，赖氨酸（都是碱性氨基酸）溶解度最大；胱氨酸，酪氨酸溶解度最小；不溶于有机溶剂，但脯氨酸溶于乙醇；

（2）两性解离及等电点PI（可用等电点沉淀法）

带电情况取决于溶液的pH；

pH＞PI时，氨基酸带负电；

pH＜PI时，氨基酸带正电；

pH＝PI时，溶解度最低，易于沉淀；

不同氨基酸PI各异；同一pH下各种氨基酸所带电荷的质和量不一致，可应用离子交换法或电泳法分离；

2、氨基酸分离纯化实例（给出条件会设计）

胱氨酸

（1）特性：

六角形片状白色结晶，或结品性粉末，无味，pI4.6；难溶于水，不溶于乙醇，乙醚，及其他有机溶剂；易溶于酸碱溶液中，热碱液中易分解；

（2）提取和纯化：

毛发酸水解，等电点沉淀，盐酸溶解，活性炭脱色，除酪氨酸，结晶；

水解：

人发或猪毛，洗净，2倍量10M盐酸，预热70－80℃，间歇搅拌，1－1.5h内升温到110℃，6.5－7h；过滤，得滤液；

中和：

用30－40％的氢氧化钠中和到pH4.8，继续搅拌15min，复测pH，放置36h，过滤得胱氨酸粗品；滤液可分离精氨酸，亮氨酸，谷氨酸

初步纯化：

取胱氨酸粗品，加10M盐酸，加热到65－70℃，搅拌溶解30min，加2％活性炭，升温到85－90℃，保温30min，过滤，滤液加热到80－85℃，搅拌，用30－40％氢氧化钠中和到pH4.8，静置，结晶析出，趁热过滤得沉淀，离心甩干；滤液回收酪氨酸；

纯化：

取胱氨酸沉淀，加1M盐酸，加热到70℃溶解，加活性炭，升温到85℃，搅拌30min脱色，过滤，得无色透明澄清滤液；加15倍蒸馏水，加热到75－80℃，搅拌下用12％氨水中和到pH3.5－4；胱氨酸结晶析出；过滤得胱氨酸结晶；蒸馏水洗到无氯离子，真空干燥；

异亮氨酸

（1）特性：

无臭，味微苦；pI6.02；几乎不溶于乙醇或乙醚；乙醇中形成菱形叶片状或片状结晶；溶于热乙醇，25℃在水中溶解度4.17，7.5℃为6.08；

（2）制备，分离，纯化

菌种培养与发酵：

菌种AS1.998；

种子培养基：

葡萄糖，尿素，玉米浆，豆饼水解液，pH6.5；1000ml三角瓶装200ml；

30℃摇床培养16h；

二级种子：

另加菜籽油；接种量3.5％，培养8h；

发酵培养基：

硫酸铵，豆饼水解液，玉米浆，淀粉水解糖，碳酸钙，pH7.2；30－32℃，通气发酵60h，25－50h间不断补加尿素，氨水；

预处理：

发酵液100℃10min，冷却过滤，滤液加硫酸和草酸调pH3.5，过滤除沉淀；

离子交换分离：

滤液以1.5％树脂量的流速经007X1（732）阳离子交换树脂H型（40X100cm），100L去离子水洗涤，氨水（60℃，0.5M氨水）以3L/min流速洗脱，

分步收集；合并pH3－12的洗脱液，70－80℃减压蒸馏浓缩到黏稠状，加去离子水，浓缩，重复三次，以除去氨；

脱色，浓缩，结晶：

浓缩液加去离子水到原体积的1/4，搅拌均匀，2M盐酸调pH3.5，加1％活性炭，70℃搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；2M氨水调pH6，5℃过夜，滤取沉淀，105℃烘干得异亮氨酸粗品；

精制：

取异亮氨酸粗品，加浓盐酸，去离子水，加热到80℃，搅拌溶解，加氯化钠到饱和，用氢氧化钠调pH10.5，过滤，滤液用盐酸调pH6，5℃过夜，滤取沉淀；沉淀用去离子水加热80℃溶解，加氯化钠和1％活性炭，70℃搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；氨水调pH6，5℃结晶过夜；滤取结晶，105℃烘干得异亮氨酸粗品；

天冬氨酸（酸性氨基酸）

（1）特性：

白色菱形叶片状结晶，pI2.97；溶于水及盐酸，25℃水中溶解度0.8，75℃水中为2.88；不溶于乙醇，乙醚；

（2）制备，分离，纯化

天冬氨酸酶的制备：

大肠杆菌AS1.881，斜面：

肉汁培养基；摇瓶：

玉米浆，延胡索酸，硫酸镁，氨水调pH6；37℃振荡培养24h；逐级扩大培养；发酵液用1M盐酸调pH5，45℃1h，冷却到室温，离心收集菌体（含天冬氨酸酶）；

细胞固定：

湿菌体，悬浮于生理盐水，40℃保温，加明胶溶液（40℃，12％），戊二醛溶液，充分搅拌均匀，5℃过夜，切成3－5mm的立方小块，浸于戊二醛溶液中过夜；蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶的固定化细胞；装于填充床式反应器，制成生物反应堆，备用；

转化反应：

延胡索酸铵底物液37℃，按一定流速流过生物反应堆，收集转化液；

分离，纯化：

过滤，滤液用1M盐酸调pH2.8，5℃结晶过夜；滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干，105℃干燥得天冬氨酸粗品；粗品用稀氨水溶解成15％溶液，加1％活性炭，70℃搅拌脱色1h，过滤，滤液用1M盐酸调pH2.8，5℃结晶过夜，滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干，85℃真空干燥得天冬氨酸精品；

谷氨酸分离纯化

利用谷氨酸与锌作用,在pH6.3条件下生成难溶于水的谷氨酸锌盐沉淀,达到从谷氨酸发酵液中分离谷氨酸的目的。

然后,于酸性条件下溶解谷氨酸锌盐,再调至谷氨酸等电点,析出谷氨酸。

谷氨酸钙（19238-49-4）的制备方法：

由发酵法所得的谷氨酸，与氢氧化钙或碳酸钙中和后脱色、结晶精制而成。

赖氨酸的提取

（1）发酵液除菌体及滤液酸化

   发酵液中加入絮凝剂絮凝后过滤除菌体，也可用高速离心液固分离设备直接分离出菌体，回收的菌体可进一步加工利用，澄清的滤液用盐酸调节PH4.0后待用。

（2）离子交换提取

    赖氨酸的离子交换提取一般用铵型732＃树脂

离交结束后，要用水洗柱，以除去可溶性和非可溶性杂质，提高赖氨酸质量，水洗后，用2-3mol/L浓度的氨水洗脱，洗脱高峰赖氨酸含量可达6-8%，如用高浓度氨水（15-20%）洗脱，洗脱高峰赖氨酸浓度可达15-16%

第十八章 蛋白质的分离纯化（重要）

（两性解离）

1、蛋白质的提取：

蛋白质在不同溶剂中的溶解度，取决于蛋白质分子中非极性疏水基团和极性亲水基团的比例，以及这些基团在蛋白质中相对空间位置；

水溶液提取：

蛋白质提取中最常用的溶剂；

盐浓度：

低浓度盐溶液和缓冲液可提高蛋白质在溶液中的稳定性及溶解度；等渗盐溶液，如0.02-0.05M磷酸盐缓冲液或0.15M氯化钠溶液；如果是胞外蛋白质，等渗溶液可减少胞内蛋白质的释放；有些蛋白质在低浓度盐溶液中溶解度低，提高盐浓度，如脱氧核糖核蛋白，1M以上的氯化钠提取；有些蛋白质在盐溶液中溶解度低，用水提取；

2、包涵体制备：

菌体细胞破碎：

如超声波法；包涵体的洗涤和收集：

含不同添加剂的磷酸盐缓冲液，离心收集沉淀；

（1）包涵体溶解前处理：

用温和表面活性剂如TritonX100或低浓度弱变性剂如尿素处理，除去脂质和部分膜蛋白，浓度以不溶解包涵体中表达产物为原则；

（2）包涵体溶解，表达产物变性

包涵体溶解：

盐酸胍，尿素：

破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的去折叠和变性，但不破坏共价键；

SDS：

破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用；

先进行预实验：

测定包涵体中表达产物开始溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间；一般能使表达产物溶解的盐酸胍浓度为5－8M，尿素为6－8M，SDS为1－2％；

（3） 重组蛋白的复性：

溶液稀释，使变性剂浓度变低，促使蛋白质复性；通过透析，超滤，电渗析除去变性剂；

3、 重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子分离纯化（重要）（pI5.4）

分离和纯化，以包涵体的形式表达；

（1）收集菌体细胞：

发酵后的工程菌，7000rpm30min，50mMTris盐酸缓冲液反复洗涤，离心三次，去上清；

（2）细胞破碎，包涵体收集：

菌体细胞，加4倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含5mMEDTA），冷浴搅匀，超声破碎器中破菌，每次30s，间隔30s，反复破碎直到革兰氏镜检无完整的菌体；5000g离心30min，去上清，沉淀含包涵体

（3）包涵体的洗涤：

沉淀加9倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含0.5%TritonX100），5000g离心30min，沉淀加9倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含0.5M脲）同法离心，沉淀加入6倍体积20mM磷酸盐缓冲液（含5mMEDTA），10000g离心30min，收集沉淀；

（4）包涵体的变性与复性：

沉淀加8M脲，振摇12h，40000g30min；逐步稀释法将脲浓度稀释到0.1M，复性24h，17000g30min，上清液为复性粗产品；

（5）色谱纯化：

1）疏水色谱

Phenyl－Sepharose6FF色谱柱用50mM磷酸－7％硫酸铵（pH6.9）平衡；复性粗产品加硫酸铵使浓度达7％，上样，用50mM磷酸－7％硫酸铵（pH6.9），20mM磷酸盐缓冲液（pH7），30％异丙醇依次洗脱，280nm紫外检测，收集洗脱峰，电泳检定；

2）离子交换色谱

装DEAE－SepharoseFF色谱柱，20mM磷酸盐缓冲液（pH6.5），20mM磷酸盐－0.15M氯化钠（pH6.5），20mM磷酸盐－1M氯化钠（pH6.4）分别洗脱，收集洗脱峰，电泳检定；

3）凝胶色谱

装SephacrylS200色谱柱，20mM磷酸盐－0.15M氯化钠（pH6.5）平衡，上样后以相同缓冲液洗脱，收集吸收峰，产品经0.2um滤膜过滤；HPLC检测为单一峰，纯度99％；SDS－PAGE显示为一条带；

4、重组胸腺素α1（pI4.2）

分离纯化

（1）菌体的收集与裂解：

离心收集菌体，盐酸胍（7M，pH7.5）4℃搅拌裂解3h，离心收集上清；

（2）透析除盐酸胍：

上清液用生理盐水2000ml透析24h，中间换一次生理盐水；

离心收集上清，用磷酸盐缓冲液（10mM，pH5.5）2000ml透析24h，中间换一次PB；离心收集上清；

（3）融合蛋白的纯化：

SP－SepharoseFF阳离子柱用PB（10mM，pH5.5）平衡，上样时收集穿过峰液；DEAE－SepharoseFF阴离子柱用上述缓冲液平衡，上样后用0－0.5M氯化钠的PB梯度洗脱，收集主峰，用水透析除盐，测蛋白浓度，冷冻干燥得融合蛋白；

（4）融合蛋白的裂解：

按蛋白质：

CNBr为1：

3的比例，加入到70％的甲酸溶液中混匀，避光室温裂解24h，加10倍体积纯水灭活CNBr，橱内充分排风30min，冷冻干燥；

（5）单体的纯化：

SP－SepharoseFF阳离子柱用醋酸钠－醋酸缓冲液（10mM，pH5）平衡，冻干样品加缓冲液溶解，4℃搅拌过夜，离心上清过SP－SepharoseFF阳离子柱；收集穿过峰液，冷冻干燥；用Tris－盐酸缓冲液（50mM，pH8）溶解后上Q－SepharoseFF阴离子柱，用0－0.5M氯化钠溶液梯度洗脱，收集主峰，测定蛋白浓度；HPLC法检定产品纯度98％以上；

5、人神经细胞生长因子（pI8.86）

分离纯化：

以人胎盘为原料提取hNGF；

（1）胎盘绒毛的分离：

取人胎盘，用注射器向脐带总动脉注入生理盐水，并轻揉胎盘，直到洗尽血污，分离绒毛叶；

（2）提取：

取来自100个胎盘的绒毛叶剪碎，加20％预冷的PBS（pH6.8，含1mMEDTA）；匀浆，每次3min，共3次；4℃8000rpm30min；上清以尼龙膜过滤，除去脂肪；滤液中加尿素到5M，调pH4，静置2h，以解离hNGF高分子聚合体；8000rpm30min，收集上清；

（3）超滤分离：

上清液以分子量截留值为30KD的超滤膜超滤，滤液再用10KD的超滤膜超滤；当截留液剩下1000ml时，加pH4，50mM醋酸钠－醋酸缓冲液2000ml，再浓缩到1000ml，反复5次，收集截留液，对平衡缓冲液充分透析；

（4）离子交换色谱纯化：

CM52离子交换纤维柱，平衡缓冲液平衡，透析液上样，以平衡缓冲液洗脱穿过峰，换用Tris盐酸缓冲液（pH9，50mM）洗脱，收集洗脱峰（含hNGF）；

从100个胎盘中提取纯化得hNGF148.6mg；

SDS－PAGE银染显示为单一条带；HPLC层析得单一峰；

6、L天冬酰胺酶（pI4.6）

分离纯化

（1）菌体丙酮粉的制备：

天冬酰胺酶为胞内酶；丙酮脱水，脱脂制成细胞干粉来破坏细胞；

（2）提取：

菌体粉悬浮于硼酸－硼酸钠缓冲液中（pH8，0.01M）37℃搅拌1.5h，将胞内酶抽提出来，离心，收集上清液；

（3）盐析分离：

离心上清液中加硫酸铵使饱和度43％，充分沉淀后离心，除去杂蛋白沉淀，上清液中加硫酸铵使饱和度85％以沉淀酶，充分沉淀后离心，收集沉淀；

（4）脱盐：

沉淀溶于蒸馏水，利用分子量截留置为10kD的膜超滤，浓缩到一定体积后，向浓缩液中加蒸馏水使达到原来的体积，如此反复使透过液中检不出硫酸根离子为止；

（5）沉淀粗酶：

浓缩液pH调到L天冬酰胺酶pI附近（pH4.3－4.5），加入2倍体积冷丙酮使酶沉淀；抽滤收集沉淀，挥尽丙酮，得天冬酰胺酶粗品；

（6）纯化：

乙醇分级沉淀：

酶粗品溶解，中性条件下加1.1倍酒精，沉淀除杂蛋白，清液用醋酸调pH到pI，继续加乙醇沉淀酶；

第十九章 核酸的分离纯化

DNA和RNA都是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇，乙醚，氯仿；

钠盐比游离酸易溶于水；

1、RNA的提取

组织捣碎，制成组织匀浆，用0.14M氯化钠提取，把细胞质中RNA蛋白提取出来，留下含DNA的细胞核物质，调节pH4.5，沉淀RNA蛋白；

2、RNA的分离纯化

（1）氯仿处理：

将RNA蛋白溶液与等体积的氯仿－戊醇（3