09TI66001细菌内毒素检查法一部检验标准操作规程.docx
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09TI66001细菌内毒素检查法一部检验标准操作规程
1.目的：
建立细菌内毒素检查法（一部）检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：
2.1.《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：
适用于所有用细菌内毒素检查法（一部）测定的供试品。
4.责任：
检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.正文：
5.1.本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
5.1.1.细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。
5.1.2.细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
5.1.3.细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。
用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.4.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
5.1.5.凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
5.1.6.试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
5.2.供试品溶液的制备：
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
5.3.内毒素限值的确定：
药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：
L=K/M。
5.3.1.式中：
L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；
5.3.2.K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）；
5.3.3.M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或U/（kg.h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。
注射时间若不足1小时，按1小时计算。
供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
5.3.4.按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
5.4.确定最大有效稀释倍数（MVD）：
最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：
MVD=CL/λ。
5.4.1.式中：
L为供试品的细菌内毒素限值；
5.4.2.C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L；
5.4.3.λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
5.5.方法1：
凝胶法。
5.5.1.凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
5.5.2.鲎试剂灵敏度复核试验：
在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
5.5.3.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制成2.0λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.lml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
5.5.4.将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阴性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
5.5.5.当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
5.5.5.1.式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
5.5.5.2.当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
5.5.6.干扰试验。
按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表1：
凝胶法干扰试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/被加入内毒素的溶液
稀释用液
稀释
倍数
所含内毒素的浓度
平行
管数
A
无/供试品溶液
——
——
——
2
B
2λ/供试品溶液
供试品溶液
1
2
4
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
4
4
4
4
C
2λ/检查用水
检查用水
1
2
4
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
4
4
4
4
D
无/检查用水
——
——
——
2
注：
A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
5.5.7.只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。
按下列计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。
Es=antilg（ΣXs/4）
Et=antilg（ΣXt/4）
式中：
Es、Et分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）。
5.5.8.当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
5.5.9.可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如滤过、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰实验。
5.5.10.当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
5.5.11.当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
5.5.12.检查法。
5.5.12.1.凝胶限量试验：
按表2制备溶液A、B、C和D。
使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2：
凝胶限量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/被加入内毒素的溶液
平行管数
A
无/供试品溶液
2
B
2λ/供试品溶液
2
C
2λ/检查用水
2
D
无/检查用水
2
注：
A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
5.5.12.1.1.结果判断：
保温60分钟±2分钟后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
5.5.12.1.2.若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。
5.5.12.2.凝胶半定量试验：
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
按表3制备溶液A、B、C、和D。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表3：
凝胶半定量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/被加入内毒素的溶液
稀释用液
稀释
倍数
所含内毒
素的浓度
平行
管数
A
无/供试品溶液
检查用水
1
2
4
8
2
2
2
2
B
2λ/供试品溶液
1
2λ
2
C
2λ/检查用水
检查用水
1
2
4
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
2
2
2
2
D
无/检查用水
——
——
——
2
注：
A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。
从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。
B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。
C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D为阴性对照。
5.5.12.2.1.结果判断：
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。
5.5.12.2.2.系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度【按公式CE=antilg（ΣX/2）】。
如果检验时采用的是供试品的稀释数，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
5.5.13.2.3.如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。
如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
5.5.13.2.4.若内毒素浓度小于规定的限度，判定供试品符合规定。
若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。
5.6.方法2，光度测定法：
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
5.6.1.浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。
终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一项先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
5.6.2.显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。
终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。
动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。
5.6.3.光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
5.6.4.供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
5.6.5.为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。
5.6.5.1.标准曲线的可靠性试验：
当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
5.6.5.1.1.用标准内毒素制成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。
每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。
同时要求做2支阴行对照。
当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。
5.6.5.1.2.根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。
否则须重新试验。
5.6.5.2.干扰试验：
选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。
按表4制备溶液A、B、C和D。
表4：
光度测定法干扰试验溶液的制备
编号
内毒素浓度
被加入内毒
素的溶液
平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
B
标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）
供试品溶液
至少2
C
至少3个浓度（最低一点设定为λ）
检查用水
每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
注：
A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。
B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D为阴性对照。
5.6.5.2.1.按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。
R=（Cs-Ct）/λm×100%
5.6.5.2.2.当内毒素的回收率在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
5.6.5.2.3.当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。
并重复干扰试验来验证处理的有效性。
5.6.5.2.4.当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
5.6.6.检查法：
按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
5.6.6.1.使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。
5.6.6.2.试验必须符合以下三个条件方为有效：
5.6.6.2.1.系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；
5.6.6.2.2.用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；
5.6.6.2.3.溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
5.6.7.结果判断：
若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。
若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
5.7.注：
本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
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