定量PCR技术及应用.docx

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定量PCR技术及应用

定量PCR技术及应用

班级：

生物制药技术二班学号：

2011307040202姓名：

乔凤龙

摘要：

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

可看作生物体外的特殊DNA复制。

通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。

关键词：

定量PCR快速PCRDNA聚合酶mRNA差异显示PCR

1.前言

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）技术由于PCR简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。

但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。

鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。

几经探索，先后出现了多种定量PCR（quantitativePCR，Q-PCR）方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR，FQ-PCR）。

随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR（RapidPCRorFastPCR）。

快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景.近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。

从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。

生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。

研究基因差异表达主要技术有：

消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术[3]和mRNA差异显示PCR技术等（mRNADifferentialDisplayPCR，简称DD-PCR[4]）。

迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。

尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA的量极少，不需要纯化的mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。

现将定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术研究情况作简要综述。

1.定量PCR技术

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。

广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。

狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。

1.1.竞争性PCR技术

定量PCR技术是对传统PCR技术的进一步发展和补充，在定量过程中需借助各种形式的参照物。

参照物是一种已知含量的标准模板，按其是否与待测样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照。

鉴于PCR扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差异，理想的定量PCR应该使用内参照。

竞争性PCR即是采用内参照的一种定量PCR方法，通过消除管间及样品间的变异，从而达到较为精确的基因定量[10]。

该方法是将待测基因与已知浓度的内参照模板在同一反应管中共同扩增，由于二者具有相同引物的结合位点并采用同一引物进行扩增，因此二者竞争引物、脱氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物就会逐渐减少。

两模板的扩增产物量可分别用以下公式表示：

Y待测=X待测（1+E）n；Y内参照=X内参照（1+E）n，其中X待测为起始拷贝量；Y待测为扩增产物量。

由于在同一反应体系中扩增，两模板的循环次数n保持一致，如果使两者间的扩增效率E也相同，就存在如下关系：

Y待测/Y内参照=X待测/X内参照。

当两模板的产物量相同时，则两模板的反应起始拷贝数相等，由此可对待测模板进行精确定量。

具体检测方法是将已知浓度的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因一起扩增，以参照模板的起始拷贝数为横轴，以两模板扩增产物量的比率为纵轴，作出标准曲线，纵坐标为1的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测基因的拷贝数。

由上述定量原理可知，保持两模板扩增效率E的一致性是定量的关键，为此要求参照模板应与待测基因具有相似的大小及序列，相同的引物结合位点。

此外，参照模板还应在扩增后易于分离检测。

因此，对于竞争性PCR的研究重点主要集中在建立高效、稳定、可靠的模板方面，现已取得了较满意的结果[11-13]。

1.2.荧光定量PCR技术

荧光定量PCR（RQ-PCR技术）是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

Ct值（cyclethreshold，Ct），即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1.2.1.实时定量PCR常用的检测模式有TaqMan探针和SYRBGreen1检测模式。

1）TaqMan探针方法的作用原理

这种方法的原理主要是利用DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性并在PCR过程中,反应体系加入一个荧光标记探针.TapMan探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:

常规TapMan探针和TapManMGB探针。

常规TapMan探针利用合适的DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性，特异性的切割探针5’端的荧光基团。

该探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团FAM（6-羧基荧光素）和一个淬灭荧光基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。

当溶液中有PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。

2000年，美国AppliedBiosystems公司开发了一种新的TapMan探针----MGB探针。

这种荧光探针与常规TapMan探针相比，有两个主要的不同：

一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记。

这使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善。

二是探针3’端另结合了MGB（minorgroovebinder）结合物，使得探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性，使结果更精确，分辨率更高。

实验证明，TapManMGB探针对等位基因的区分更为理想，甚至能检测仅有单核苷酸差异的等位基因的表达水平。

2）SYBRGreen┃荧光染料方法的作用原理

SYBRGreen┃是一种只与双链DNA小沟结合的染料，当它游离在溶液中时，不发出荧光；一旦掺入DNA双链，便发出强烈的荧光。

但是当它从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系中，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

它的最大优点是能用于任何模板的任何一对引物。

它的缺点也在于能与非特异性双链DNA结合，但是它产生的干扰可通过熔解曲线分析得以解决。

1.2.2.实时荧光定量PCR技术的应用

（1）基因表达研究

RQ-PCR方法能检测各种组织细胞中基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控，监控mRNA表达模式，检测组织中少量存在的基因，跟踪群体细胞中克隆型，定量分析基因在不同组织中的转录水平等。

此外，RQ-PCR也用来研究各种处理如受病毒感染对细胞mRNA含量变化的影响，锻炼等对mRNA表达的影响，以及比较感染组织与正常组织中各mRNA含量，不同组织中基因表达情况等。

（2）转基因安全检测

现在转基因产品很流行，但是，在转基因食品，疫苗和治疗中介如外源物质可能引起危险。

因此在安全检测中，利用高敏感的PCR来检测这些物质是很关键的。

RQ-PCR可用于对转基因产品的检测和定量。

根据目前转基因技术中使用的基因构件主要来源于花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子和农杆菌的NOS终止子，绝大部分转基因产品中含有这两个基因片段，用RQ-PCR检测定量35S启动子和NOS终止子就可达到简便，快速，准确的检测转基因产品的目的。

此外，RQ-PCR在动物中基因治疗载体的生物分布的确定，生物疗法中残留DNA的含量，污染细胞库和终产物中病毒和细菌核酸检测等生物安全检测中都有广泛应用。

2.快速PCR技术

随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR（RapidPCRorFastPCR）。

快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。

例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。

近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。

从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明，快速PCR技术不仅对普通扩增，且对实时定量扩增都具有可实现性，并已有相关的部分试剂或仪器在市场上推出。

从研发角度，目前技术的发展重点主要集中在热聚合酶融合蛋白及芯片式PCR仪的研制两个方面。

2.1.快速PCR的实现途径

快速PCR技术原理仍建立在常规PCR原理的基础上。

常规的PCR反应过程通常是三大阶段的循环，即变性阶段、退火阶段和延伸阶段（在某些情况下，退火阶段和延伸阶段可以合并），反应时间是以上三个阶段的总时间加上各阶段间温度变化的时间。

要实现快速PCR，其根本问题就是要缩短这三大阶段的持续时间或温度变化的时间。

在PCR中，变性阶段的目的将双链DNA在高温下变性为单链DNA，所用时间取决于聚合酶的耐受温度，常用的聚合酶耐受95℃，若提高聚合酶的耐受温度，则变性阶段的时间可以缩短；退火阶段的目的是使单链DNA相互间正确配对形成双链DNA，主要取决于模板的复杂程度以及引物和模板之间的结合能力，要缩短这一阶段的持续时间可以通过加入一些稳定单链DNA形成或促进双链DNA形成的添加剂来实现。

而延伸阶段的持续时间主要取决于DNA聚合酶的延伸速率，可以通过发现新的高效DNA聚合酶、对现有DNA聚合酶的改进以及加入能增强酶活性的辅助因子等来获得更高的延伸速率，从而缩短延伸过程的时间。

至于各阶段间温度变化的时间则主要取决于热循环仪的工作效率，可以通过选择传热性能更优良的材料、改进热循环仪的工作原理或采用微小体积反应等方式使PCR仪的传热效率提高，进而大大缩短温度变化所占用的时间，最终使整个反应的速率得到提高。

2.2.用于实现快速PCR的DNA聚合酶

在PCR循环中，延伸阶段的持续时间主要取决于DNA聚合酶的延伸速率，提高聚合酶的延伸活性和延伸速率无疑会缩短整个PCR反应所需的时间。

由于PCR反应常用的Taq、Pfu等DNA聚合酶在其天然的生物体中主要用于DNA损伤的修复以及重组等，因此它们的延伸活性和延伸速率比较低[22]。

为了获得具有高延伸活性的热稳定DNA聚合酶，研究者通过基因工程的手段将DNA聚合酶与能和DNA链相互作用的蛋白质功能域以融合蛋白的形式相结合，或直接利用定点突变的方法筛选出具有高延伸活性的DNA聚合酶。

Wang等[22]通过将蛋白Sso7d与DNA聚合酶融合得到了具有快速延伸能力的DNA聚合酶。

Sso7d是从Sulfolobussolfataricus中分离到的一种双链DNA结合蛋白[23]。

它大量存在于嗜热古细菌中，被认为在稳定基因组DNA中发挥着重要的作用。

研究表明，将Sso7d与A家族或B家族的DNA聚合酶以融合蛋白的形式连接在一起后，由于Sso7d对双链DNA具有一定的亲和力，可以识别退火后的双链，从而使聚合酶快速找到延伸起始点，有效地增强了原DNA聚合酶的延伸速度。

例如，与Sso7d融合的PfuDNA聚合酶可以在2min内延伸10k的DNA片段，而一般的PfuDNA聚合酶相同时间下即使提高酶的用量也只能合成2k的DNA片段。

同时，融合后DNA聚合酶与双链DNA的作用是较弱的，这就避免了强相互作用所导致的阻碍DNA聚合酶在DNA链上移动的不利结果。

此外还发现Sso7d可以增加聚合酶对体系中高盐浓度的耐受性，可便于对PCR反应进一步优化。

目前，商品化的快速PCR聚合酶主要是Takara公司的Taq聚合酶，该酶除了延伸速率提高之外，还可耐受更高的变性温度，推荐98℃变性1s，因此变性阶段的时间也缩短了不少。

Machida等[24]在大批量样本的扩增中评价了快速Taq聚合酶，扩增产物正常，但未与其它常规用Taq酶比较。

在Qiu等[25]的工作中，评价了TaqDNA聚合酶、LAOTaqDNA聚合酶与AmpliTaqDNA聚合酶对PCR产物中嵌合体（chimeras），突变（mutiation）和异源双链（heteroduplex）的产生的影响。

在其试验体系中ZOTaq具有最高的反应速率，但形成PCR假象（artifact）的总几率较高，达20%；LAOTaq具有最高的保真度，反应速率居中，形成PCR假象的总几率为15%；AmpliTaq形成PCR假象的几率为7%。

ZOTaq（8.7%）与LAOTaq（6.2%）比AmpliTaq（2.5%）容易形成嵌合体。

ZOTaq形成嵌合体和异源双链的频率比AmpliTaq高几乎三倍。

该工作提示利用ZOTaq酶快速扩增的同时部分程度上牺牲了保真度。

3.mRNA差异显示PCR技术

3.1.mRNA差异显示PCR技术的主要原理

在生命过程的某一时期，生物细胞转录和表达的基因只有很少一部分，而且在不同的发育阶段、不同的生理状态和不同类型细胞的基因转录和表达也不尽相同，因此，研究mRNA的差异，相对于研究DNA差异，排除了内含子的影响，使研究更接近于生命活动的实质。

mRNA差异显示PCR技术是根据真核生物细胞中绝大多数mRNA均带有3′polyA尾的结构特点（除极少部分mRNA，如组蛋白mRNA外）。

以此为依据，设计3′端引物Oligo-dTnM（M分别代表A、C、G），这3种引物，称之为锚锭引物[26-27]。

利用锚定引物将不同来源的细胞或不同生理状态的同种细胞的mRNA逆转录为cDNA，并用此引物和5′端的随机引物对逆转录产物PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳，随后进行荧光染色或硝酸银染色或放射自显影，通过比较找出差异表达的cDNA条带[28]。

从凝胶上切割下这些差异性条带，用相同的引物和条件进行PCR再扩增，克隆所得PCR产物进行核苷酸序列分析，将分析结果与基因序列数据库中的序列作同源比较，就可知分离的是已知基因序列，还是未知基因序列；同时分析结果可以用作探针从cDNA文库或基因组DNA文库中筛选到全长的cDNA序列或基因组克隆。

4.小结与展望

基因分析的定量化是对基因诊断的要求和未来发展的趋势。

总的来说，定量PCR技术的研究方兴未艾，还有诸多问题有待解决，如竞争性PCR中竞争性模板制备较难，且与待测模板的扩增效率也难以达到完全相同；Taqman技术中Taq酶的外切酶活性能影响定量；此外，荧光定量PCR技术均存在探针标记的成本较高，不便普及的问题，分析灵敏度仍需不断提高。

以上表明对定量PCR技术的研究还需不断深入。

相信在不久的将来，会有结果更精确、成本更低的定量PCR技术出现，在实验研究及临床诊断上得到广泛的应用。

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